Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den Connaught Fund New Investigator Award an S.P., die Canada Foundation for Innovation, das NSERC Discovery Grant Program (Grants RGPIN-2015-05114 und RGPIN-2020-05881), die University of Manchester und den University of Toronto Joint Research Fund sowie das University of Toronto XSeed Program unterstützt. C.T. wurde durch ein NSERC USRA Fellowship unterstützt.

1. Coverslip-Vorverarbeitung
<ol><li>Bereiten Sie blitzsaubere Abdecklippen vor, wie in Waterman-Storer, 199825beschrieben.</li>
	<li>1% ige (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS) Lösung vorbereiten und die Coverlips in der Lösung für 10 min unter sanftem Rühren inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Deckenrlips in der Lösung frei bewegen.</li>
	<li>Deckenlippen zweimal mit dH2O für je 5 min waschen.</li>
	<li>Bereiten Sie 0,5% ige Glutaraldehyd (GA) -Lösung vor und inku...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. 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D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass das beschriebene IR-lasergestützte Mikromusterungsprotokoll (Mikrophotomusterung) reproduzierbare adhärente Muster verschiedener Formen liefert, die die Manipulation der Zellform und der Zytoskelettarchitektur ermöglichen. Obwohl sowohl vor als auch nach dem Debüt des Mikrophotomusternings zahlreiche Mikrostrukturierungsmethoden entwickelt wurden, besitzt diese Methode mehrere Vorteile. Erstens sind keine speziellen Geräte und Reinräume erforderlich, die normalerweise nur in Den E...

Die Zellform ist eine Schlüsseldeterminante grundlegender biologischer Prozesse wie Gewebemorphogenese1, Zellmigration2, Zellproliferation3und Genexpression4. Veränderungen in der Zellform werden durch ein kompliziertes Gleichgewicht zwischen dynamischen Umlagerungen des Zytoskeletts, das die Plasmamembran deformt, und extrinsischen Faktoren wie externen Kräften, die auf die Zelle ausgeübt werden, und der Geometrie von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsionenangetrieben 5. Migrierende mesenchymale Zellen polymerisieren beispielsweise ein dichtes Aktinnetzwerk an der Vorderkante, das die Plasmamembran nach vorne schiebt und eine breite Lamellipodie6erzeugt, während die Actomyosinkontraktilität die schmale Hinterkante der Zelle zurückzieht, um die Zelle von ihrer aktuellen Position7,8zu lösen . Störende Signalereignisse, die zu solchen spezialisierten Zytoskelettstrukturen führen, stören die Form und Polarität und verlangsamen die Zellmigration9. Darüber hinaus erfordert die Epithelblattbiegung während der Gastrulation eine Aktomyosin-basierte apikale Verengung, die dazu führt, dass Zellen und ihre Nachbarn keilförmig werden10. Obwohl diese Studien die Bedeutung der Zellform hervorheben, hat die inhärente Heterogenität der Zellform die Bemühungen um die Identifizierung von Mechanismen, die die Morphologie mit der Funktion verbinden, belastet.
Zu diesem Zweck wurden in den letzten drei Jahrzehnten zahlreiche Ansätze zur Manipulation der Zellform entwickelt. Diese Ansätze erreichen ihr Ziel, indem sie entweder die Zelle mit einer dreidimensionalen Form einschränken oder die zelluläre Adhäsionsgeometrie durch gemusterte Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen (ECM) auf einer Antifouling-Oberfläche steuern, eine Technik, die als Mikrostrukturierung bezeichnet wird11. Hier werden wir eine Reihe von Techniken überprüfen, die im Laufe der Jahre an Popularität gewonnen haben.
Ursprünglich als Ansatz für mikroelektronische Anwendungen entwickelt, ist der auf Soft-Lithographie basierende Mikrokontaktdruck eindeutig zu einem Kult-Favoriten geworden12. Ein Master-Wafer wird zunächst hergestellt, indem Bereiche eines mit Fotolack beschichteten Siliziumsubstrats selektiv der Photoirstrahlung ausgesetzt werden, wobei eine gemusterte Oberfläche zurückbleibt13. Ein Elastomer, wie PDMS, wird dann auf den Master-Wafer gegossen, um einen weichen "Stempel" zu erzeugen, der ECM-Proteine auf ein gewünschtes Substratüberträgt 11,14. Einmal hergestellt, kann ein Master-Wafer verwendet werden, um viele PDMS-Stempel zu gießen, die zu hochreproduzierbaren Mikromusternführen 12. Die Muster können jedoch aufgrund des langwierigen Photolithographieprozesses nicht ohne weiteres angepasst werden. Dieser Prozess erfordert auch hochspezialisierte Geräte und Reinräume, die in Biologieabteilungen normalerweise nicht verfügbar sind.
In jüngerer Zeit wurde berichtet, dass der Direktdruck mit tiefem UV die Einschränkungen herkömmlicher lithographiebasierter Ansätze umgeht. Tiefes UV-Licht wird durch eine Photomaske zu ausgewählten Bereichen eines Glasdecklippesgeleitet, der mit Poly-L-Lysin-gepfropftem Polyethylenglykol beschichtet ist. Chemische Gruppen, die tiefem UV ausgesetzt sind, werden ohne die Verwendung von lichtempfindlichen Linkern photokonvertiert, um die Bindung von ECM-Proteinen zu ermöglichen15. Das Fehlen lichtempfindlicher Linker ermöglicht es gemusterten Abdeckrlips, bei Raumtemperatur über sieben Monate stabil zu bleiben15. Diese Methode vermeidet die Verwendung von Reinräumen und Fotolithographiegeräten und erfordert weniger spezialisierte Schulungen. Die Anforderung an Fotomasken stellt jedoch immer noch eine erhebliche Hürde für Experimente dar, die leicht verfügbare Musteränderungen erfordern.
Neben Methoden, die die Zellgeometrie durch kontrollierte Ablagerung von ECM-Proteinen auf einer 2D-Oberfläche manipulieren, versuchen andere, die Zellform zu kontrollieren, indem zellen in 3D-Mikrostrukturen eingeengen werden. Viele Studien haben den oben beschriebenen Soft-Lithography-basierten Ansatz angepasst, um 3D- statt 2D-PDMS-Kammern zu erzeugen, um formabhängige biologische Prozesse in Embryonen, Bakterien, Hefen und Pflanzen zu untersuchen16,17,18,19. Die Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) hat auch die Führung als Mikrofabrikationstechnik übernommen, die komplexe 3D-Hydrogelgerüste mit Nanometerauflösung20herstellen kann. 2PP beruht auf den Prinzipien der Zwei-Photonen-Adsorption, bei der zwei in Femtosekundenpulsen abgegebene Photonen gleichzeitig von einem Molekül - in diesem Fall Photoinitiator - absorbiert werden, das eine lokale Polymerisation von Photopolymeren ermöglicht21. Diese Technik wurde stark eingesetzt, um 3D-Gerüste zu drucken, die die nativen ECM-Strukturen des menschlichen Gewebes nachahmen und nachweislich geringe photochemische Schäden an Zellen induzieren22.
Das Debüt der Mikrophotostrukturierung vor 10 Jahren gab Forschern die Möglichkeit, Mikromuster herzustellen und dabei unzugängliche und spezialisierte Geräte zu vermeiden. Die Mikrophotostrukturierung erzeugt Muster auf der Mikrometerskala, indem selektive Bereiche von Polyvinylalkohol (PVA), die auf aktivierten Glasoberflächen mit einem Infrarotlaserbeschichtet sind, thermisch entfernt werden 23,24. ECM-Proteine, die nur die darunter liegende Glasoberfläche und nicht PVA anbringen, dienen dann als biochemische Hinweise, um eine kontrollierte Ausbreitungsdynamik und Zellform zu ermöglichen. Diese Methode bietet auch eine überlegene Flexibilität, da Muster leicht in Echtzeit geändert werden können. Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der Mikrophotostrukturierung unter Verwendung eines kommerziellen Multiphotonen-Bildgebungssystems. Das beschriebene Protokoll ist für die schnelle und automatisierte Herstellung großer Muster konzipiert. Wir haben gezeigt, dass diese Muster die Zellform effizient steuern, indem sie die Geometrie von Zell-ECM-Adhäsionen einschränken. Schließlich zeigen wir, dass die beschriebene Mustertechnik die Organisation und Dynamik des Aktin-Zytoskeletts moduliert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

Mikrostrukturierung ist eine etablierte Technik in der zellbiologischen Gemeinschaft, die verwendet wird, um Verbindungen zwischen der Morphologie und Funktion von Zellkompartimenten zu untersuchen und gleichzeitig Komplikationen zu umgehen, die sich aus natürlichen Zell-zu-Zell-Variationen ergeben. Um die Zellform zu standardisieren, werden die Zellen entweder in 3D-Formen eingeschlossen oder durch Klebeinseln auf Klebegeometrie kontrolliert. Traditionelle Mikrostrukturierungstechniken, die auf Photolithographie und tiefem UV-Ätzen basieren, hängen jedoch stark von Reinräumen oder Spezialgeräten ab. Hier stellen wir eine von Doyle et al. modifizierte Infrarot-Laser-Assisted Micropatterning-Technik (Microphotopatterning) vor, die bequem mit handelsüblichen Bildgebungssystemen aufgebaut werden kann. In diesem Protokoll verwenden wir ein Nikon A1R MP+ Bildgebungssystem, um Mikromuster mit Mikrometer-Präzision durch einen Infrarotlaser (IR) zu erzeugen, der voreingestellte Bereiche auf polyvinylalkoholbeschichteten Decklippen absträcht. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Skript, um eine automatisierte Musterherstellung mit hoher Effizienz und Genauigkeit in Systemen zu ermöglichen, die nicht mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet sind. Wir zeigen, dass dieses IR-lasergestützte Mikromusterungsprotokoll (Mikrophotomusterung) zu definierten Mustern führt, an die sich Zellen ausschließlich anheften und die gewünschte Form annehmen. Darüber hinaus können Daten aus einer großen Anzahl von Zellen aufgrund der Standardisierung der Zellform gemittelt werden. Muster, die mit diesem Protokoll generiert werden, können in Kombination mit hochauflösender Bildgebung und quantitativer Analyse für Bildschirme mit relativ hohem Durchsatz verwendet werden, um molekulare Akteure zu identifizieren, die die Verbindung zwischen Form und Funktion vermitteln.

Die Qualität der experimentellen Daten, die durch Mikrostrukturierung gewonnen werden, hängt weitgehend von der Qualität der Muster ab. Um die Qualität der mit der obigen Methode erzeugten Muster zu bestimmen, haben wir zunächst die Reflexionsmikroskopie verwendet, um die Form und Größe der fotoabgetragenen Bereiche des Coverlips zu beurteilen. Wir fanden heraus, dass jedes einzelne Muster der Ablationsmaske sehr ähnlich sah und klare Grenzflächen und eine Oberfläche aufwies, die das Licht gleichmäßig reflekt...

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Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Herstellung von Mikromustern, die die Zellform standardisieren, um Zytoskelettstrukturen in Säugetierzellen zu untersuchen. Diese benutzerfreundliche Technik kann mit handelsüblichen Bildgebungssystemen eingerichtet werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die für Standard-Zellbiologielabore unzugänglich ist.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Mikrostrukturierung ist eine leistungsstarke Technik, die von Wissenschaftlern verwendet wird, um Zusammenhänge zwischen Zellform und der Aktivität interzellulärer Maschinen zu verstehen. Obwohl mehrere Techniken es Forschern ermöglichen, die Zellform zu modulieren, erfordern diese Techniken oft spezielle Geräte, die für einige Biologielabore unzugänglich sind. Dieses Video führt Sie durch die Schritte, die zur Automatisierung der Mikrostrukturierung auf einem kommerziell erhältlichen Multiphotonen-Bildgebungssystem erforderlich sind.Ein Vorteil dieses Protokolls ist, dass es die Verwendung von Spezialgeräten vermeidet. Muster können auch leicht geändert werden, ohne Fotomasken neu zu bearbeiten, was in der Regel der zeitaufwendigste Prozess beim Mikromustern ist. Unser Bildverarbeitungstool erzeugt durchschnittliche Zellbilder, die eine repräsentative Verteilung von Proteinen unvoreingenommen und automatisiert widerspiegeln.Obwohl wir in unseren Experimenten Coverlips verwenden, können Sie mit dem automatisierten Workflow auch Dias und Glasbodenschalen mustern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die richtige Mikroskopeinrichtung für das System entscheidend ist, um die richtige Fokusebene und das richtige Muster automatisiert abbilden, identifizieren zu können. Bereiten Sie die PVA-Lösung wie angewiesen vor.Fügen Sie ein Teil HCL zu acht Teilen PVA hinzu. Kehren Sie die Röhre vorsichtig ein paar Mal um, um sie zu mischen. Gießen Sie zwei Milliliter der Lösung in eine kleine Petrischale und tauchen Sie einen sauberen vorverarbeiteten Abdeckt in die Flüssigkeit.Bei Raumtemperatur fünf Minuten auf einem Shaker inkubieren. Entfernen Sie vorsichtig den Abdeck aus der Lösung. Verwenden Sie den Coverslip Spinner, um den Mantel für 40 Sekunden zu spinnen.In der Zwischenzeit die Pinzette reinigen. Den Abdeck in eine Box überführen und über Nacht bei vier Grad trocknen. Schalten Sie die Mikroskopsoftware ein.Stellen Sie zunächst die Laserlinie auf 750 Nanometer ein. Richten Sie dann eine neue optische Konfiguration namens Image ein. Dies ist die optische Grundkonfiguration, mit der wir den Abdeckungsschlupf durch Reflektoren abbilden können.Lassen Sie andere Optionen als Standard und wählen Sie das entsprechende Ziel aus. Konfigurieren Sie die Hardwareeinstellungen unter dieser optischen Konfiguration. Stellen Sie den Infrarotlaser als unseren Stimulationslaser ein.Platzieren Sie den Strahlteiler in den Lichtweg, um den IR-Laser für die Bildgebung zu verwenden. Wählen Sie die Galvano-Scannereinheit und den entsprechenden D-Scan-Detektor aus. Wählen Sie eine Scangröße und Verweildauer, die ausreicht, um kleine Merkmale auf dem Coverlip zu erfassen.Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen IR-Laser verwenden aktiviert ist. Passen Sie die Erfassungslaserleistung und die Detektorempfindlichkeit an, um ein helles, aber nicht gesättigtes Bild der Deckdeckeloberfläche zu erhalten. Legen Sie im Scanbereichsfenster den Zoom auf eins fest, um das gesamte Sichtfeld zu erfassen.Speichern Sie die optische Konfiguration. Jetzt richten wir eine Reihe optischer Konfigurationen ein, die es dem Mikroskop ermöglichen, zu fokussieren, die ROI-Maske zu laden und Muster automatisiert zu generieren. Die erste optische Konfiguration ermöglicht es uns, einen Treuhandmarker zu drucken, der zum automatischen Fokussieren auf das aktuelle Sichtfeld verwendet wird.Duplizieren Sie die optische Konfiguration des Bildes und benennen Sie sie um, Treuhandmarker drucken. Da wir in diesem Schritt drucken, bewegen Sie den Strahlteiler aus dem Lichtweg und ersetzen Sie ihn durch einen geeigneten dichroitischen Spiegel. Wählen Sie die kleinste Scangröße, um Zeit zu sparen.Da in diesem Schritt keine Bildgebung erforderlich ist, stellen Sie die Detektorempfindlichkeit auf Null ein. Erhöhen Sie die Laserleistung, um das Drucken zu ermöglichen. Stellen Sie im Scanbereichsfenster den Zoom auf Maximum ein und platzieren Sie den Scanbereich in der Mitte des Sichtfelds.Jetzt werden wir ein Z-Stack-Experiment einrichten, um Unebenheiten in der PVA-Oberfläche zu berücksichtigen. Stellen Sie die Bewegung an der Z-Position auf relativ ein. Wählen Sie das entsprechende Z-Gerät aus.Als nächstes duplizieren Sie die optische Konfiguration des Bildes und benennen Sie sie in Autofokus um. Wählen Sie die kleinste Scangröße und verringern Sie den Zoomfaktor im Scanbereichsfenster, sodass das Sichtfeld etwas größer ist als die Treuhandmarkierung. Dies stellt sicher, dass andere kleine Funktionen auf dem Coverlip den Autofokus nicht stören.Wählen Sie im Menü Geräte die Option Autofokus einrichten aus. Legen Sie die Scandicke auf die im Z-Stack-Experiment fest. Das Mikroskop durchtreift diesen Bereich und findet mit dem Treuhandmarker die beste Fokusebene.Als nächstes duplizieren Sie die optische Image-Konfiguration und benennen Sie sie in Load ROI um. Stellen Sie die Scangröße identisch mit der roi-Maske ein, da die Maske auf ein Bild geladen wird, das mit dieser optischen Konfiguration aufgenommen wurde. Wir haben 2048 Pixel verwendet, um eine optimale Balance zwischen Auflösung und Geschwindigkeit zu erreichen.Jetzt werden wir die optische Konfiguration einrichten, die zum Mustern des Coverlips verwendet wird. Duplizieren Sie die optische Konfiguration des Druck-Treuhändermarkers und benennen Sie sie in Micropattern um. Legen Sie den Zoomfaktor auf eins fest.Erhöhen Sie die Stimulationslaserleistung, um PVA abzunehmen. Wählen Sie eine geeignete Scangeschwindigkeit aus. Richten Sie im ND-Stimulationsfenster ein ND-Stimulationsexperiment ein.Fügen Sie dem Zeitplan einige Phasen hinzu und stellen Sie jede auf Stimulation ein. Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsbereich und die Dauer korrekt sind. Aktivieren Sie im selben Fenster die Haupt-Z-Funktion der Bühnenverschiebung vor jeder Phase.Dies berücksichtigt wiederum abweichungen in Z-Richtung. Richten Sie schließlich eine optische Konfiguration ein, um ein sichtbares Etikett auf dem Coverlip zu erstellen, das uns helfen kann, die Muster zu lokalisieren. Duplizieren Sie die Druck-Treuhandmarkierung und benennen Sie sie um, Etikettenoberfläche.Erhöhen Sie die Laserleistung deutlich und stellen Sie den Zoom auf eins. Übertragen Sie den PVA-beschichteten Deckmantel auf eine Halterung. Stellen Sie bei einem aufrechten Mikroskop sicher, dass die PVA-Oberfläche nach unten zeigt.Fügen Sie Wasser in die Ecken hinzu, um den Abdeckungsrutsch zu stabilisieren. Montieren Sie den Halter auf dem Mikroskopstand. Senken Sie das Objektiv und fügen Sie Wasser dazwischen hinzu.Schalten Sie in der Mikroskopsoftware den IR-Laserverschluss ein und führen Sie vor der Musterung eine automatische Ausrichtung durch. Wechseln Sie zur optischen Konfiguration des Bildes. Scannen Sie das Sichtfeld, während Sie das Objektiv langsam näher an die Abdeckung bewegen.Zunächst erscheint das Bild extrem dunkel. Bewegen Sie das Objektiv näher an den Coverlip, bis die Bildhelligkeit leicht zunimmt. Dies ist die Deckrutschfläche, die dem Objektiv zugewandt ist.Bewegen Sie das Objektiv weiter, bis die Helligkeit abnimmt und wieder zunimmt. Dies ist die PVA-Oberfläche, die wir mustern werden. Konzentrieren Sie sich auf kleine Funktionen, z. B. Abdeckungsfehler oder Staub, und stellen Sie auf dem Laufwerk Z Null ein.Wechseln Sie zur optischen Konfiguration der Etikettenoberfläche. Klicken Sie auf Aufnehmen. Kehren Sie zu Imaging und Scan zurück.Glasschäden zeigen, dass das Etikett erfolgreich gedruckt wurde. Verschieben Sie die Bühne um ein bis zwei Sichtfelder, um Glaspartikel zu vermeiden. Scannen zur Bestätigung.Öffnen Sie im Gerätemenü das Bühnenbewegungsmakro. Setzen Sie die Variablen M und N auf die gewünschte Anzahl von Sichtfelden, die gemustert werden. Speichern Sie das Makro, und führen Sie es aus.Wechseln Sie nach Abschluss der Musterung zur optischen Konfiguration des Bildes und scannen Sie die Muster. Musterinseln in jedem Sichtfeld sollten klare Grenzen haben und das Licht gleichmäßig reflektieren. Muster, die dunkler und ungleichmäßig erscheinen, deuten auf eine unvollständige PVA-Entfernung hin.Dies ist in der Regel auf unzureichende Laserleistung oder falsche Fokusebene zurückzuführen. Ist die Laserleistung zu hoch eingestellt, kann dies auch dazu führen, dass die PVA sprudelt. Nach dem Plattieren von Zellen auf Coverlips sollten sich die Zellen ausbreiten und die Form des Musters annehmen.Dies ist ein Immunfluoreszenzbild eines menschlichen Fibroblasten, der auf einem Armbrustmuster plattiert ist. Die Zelle zeigt einen aktinreichen Rand von Lamellipodie. Dicke, ventrale Spannungsfasern entlang der beiden Seiten und dorsale Spannungsfasern, die durch Querbögen verbunden sind.Myosin-Lichterkette saß hinter dem dichten Lamellipodia-Rand und zeigte ein streifiges Muster entlang von Aktinbündeln. Mit unserem benutzerdefinierten Bildverarbeitungstool haben wir ein gemitteltes Bild unserer interessierenden Proteine erstellt. Dieses Bild zeigt, dass die oben beschriebenen Aktinstrukturen über eine große Anzahl von Mustern konsistent sind.Obwohl wir nach der Mittelung einzelne Strukturen von Myosin verlieren, bleibt die Lokalisierung entlang von Aktinbündeln erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, einen Micro-Patterning-Workflow mit einem kommerziell erhältlichen Multiphotonensystem mit minimalem manuellen Aufwand einzurichten. Es ist wichtig, die Laserleistung für Ihr eigenes System zu optimieren, um unvollständige Muster oder PVA zu vermeiden Maximale Effizienz kann durch Anpassung der Parameter in Autofokus- und Mikrostrukturierungsschritten erreicht werden.Neben der Untersuchung zellulärer Signalwege mit Zellmorphologie kann diese Technik auch auf das Screening von Medikamenten und andere Anwendungen angewendet werden, die empfindlich auf Variationen der Zellform reagieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Forschung

Biotechnik

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Vorhersage des Gen-Silens durch die räumlich-zeitliche Kontrolle der siRNA-Freisetzung von photoreaktiven polymeren Nanocarriern

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Erste 3D Cluster Zellkontrolle in einem Hybrid Gel Cube Gerät für wiederholbare Muster Formationen

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Synthese von Nahinfrarot emittierenden Gold-Nanoclustern für biologische Anwendungen

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Dual Raster-Scanning Photoakustischer Kleintier-Imager für Vaskuläre Visualisierung

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...