Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קונוט פרס חוקר חדש S.P., קנדה קרן לחדשנות, NSERC דיסקברי גרנט התוכנית (מענקים RGPIN-2015-05114 ו RGPIN-2020-05881), אוניברסיטת מנצ'סטר ואוניברסיטת טורונטו קרן המחקר המשותף, ואוניברסיטת טורונטו XSeed תוכנית. C.T. נתמך על ידי מלגת USRA NSERC.

1. כיסויים לעיבוד מקדים
<ol><li>הכינו כיסויים נקיים וחורקים כמתואר בווטרמן-סטוריר, 199825.</li>
	<li>הכן 1% (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS) פתרון דגירה את ה-coverslips בתמיסה במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. ודא כי coverslips לנוע בחופשיות בפתרון.</li>
	<li>לשטוף מכסה פעמיים עם dH2O במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>הכינו 0.5...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells.">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li><li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility.">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li><li>Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development.">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration:+Integrating+Signals+from+Front+to+Back.">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells.">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels.">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+Movements:+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts.">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+Processing:+Surface,+Micro-,+and+Nanoscale+Processing.">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li><li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions.">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers.">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li><li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli.">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li><li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth.">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li><li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., J&#246;nsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control.">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li><li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf.">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li><li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications:+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization.">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).</li><li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization:+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix.">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

התוצאות לעיל מראות כי פרוטוקול micropatterning בסיוע לייזר IR המתואר (microphotopatterning) מספק דפוסים חסידים לשחזור של צורות שונות המאפשר מניפולציה של צורת התא וארכיטקטורה cytoskeletal. למרות ששיטות micropatterning רבות פותחו הן לפני ואחרי הופעת הבכורה של microphotopatterning, שיטה זו בעלת מספר יתרונות. ראשית, היא אינה דורשת צי...

צורת התא היא דטרמיננטה מרכזית של תהליכים ביולוגיים בסיסיים כגון מורפוגנזהשל רקמות 1, נדידת תאים2, התפשטות תאים3, וביטויגנים 4. שינויים בצורת התא מונעים על ידי איזון מורכב בין סידורים מחדש דינמיים של הציטוסקלטון המעוותים את קרום הפלזמה וגורמים חיצוניים כגון כוחות חיצוניים המופעלים על התא לבין הגיאומטריה של הידבקויות תאים ומטריצת תאים5. תאים mesenchymal נודדים, למשל, polymerize רשת actin צפוף בקצה המוביל שדוחף את קרום הפלזמה קדימה ויוצר lamellipodia רחב6, בעוד התכווצות actomyosin נסוגה הקצה הנגרר הצר של התא כדי לנתק את התא ממיקומו הנוכחי7,8. שיבוש אירועי איתות שמעוררים מבנים ציטוסקלים מיוחדים כאלה מפריעים לצורה ולקוטביות ומאטים את נדידת התאים9. בנוסף, כיפוף גיליון אפיתל במהלך gastrulation דורש התכווצות apical מבוסס actomyosin שגורם לתאים ושכניהם להיות טריז בצורת10. למרות שמחקרים אלה מדגישים את החשיבות של צורת התא, ההטרוגניות הטבועה בצורת התא הכבידה על המאמצים לזהות מנגנונים המחברים מורפולוגיה לתפקוד.
למטרה זו, גישות רבות כדי לתפעל את צורת התא פותחו בשלושת העשורים האחרונים. גישות אלה להשיג את מטרתם על ידי הגבלת התא עם עובש תלת מימדי או שליטה גיאומטריה הידבקות הסלולר באמצעות תצהיר בדוגמת של חלבונים מטריצה חוץ תאית (ECM) על משטח antifouling, טכניקה הנקראת micropatterning11. כאן נסקור מספר טכניקות שצברו פופולריות לאורך השנים.
במקור היה חלוץ כגישה ליישומים מיקרואלקטרוניקה, הדפסת מיקרו-טכנולוגיה רכה המבוססת על ליתוגרפיה הפכה באופן חד משמעי לפולחן מועדף12. רקיק מאסטר מפוברק תחילה על ידי חשיפה סלקטיבית של אזורים של מצע סיליקון מצופה פוטורסיסטי לצילום, ומשאיר אחריו משטח בדוגמת13. אלסטומר, כגון PDMS, נשפך לאחר מכן על הוופל הראשי כדי ליצור "חותמת" רכה המעבירה חלבוני ECM למצע הרצוי11,14. לאחר ייצור, רקיק הורים יכול לשמש כדי להטיל בולים רבים PDMS כי להוליד micropatterns לשחזור מאוד12. עם זאת, לא ניתן להתאים את הדפוסים בקלות בשל תהליך הפוטוליטוגרפיה הממושך. תהליך זה דורש גם ציוד וחדרים נקיים מיוחדים מאוד שאינם זמינים בדרך כלל במחלקות ביולוגיה.
לאחרונה, הדפסה ישירה באמצעות UV עמוק דווח לעקוף מגבלות שהוצגו על ידי גישות מבוססות ליתוגרפיה מסורתית. אור UV עמוק מופנה דרך פוטומסק לאזורים סלקטיביים של כיסוי זכוכית מצופה פולי-L-ליצין-מושתל- פוליאתילן גליקול. קבוצות כימיות החשופות ל- UV עמוק מומרות ללא שימוש במקשרים רגישים לאור כדי לאפשר איגוד של חלבוני ECM15. היעדר קישורים רגישים לאור מאפשר לכיסויים בדוגמאות להישאר יציבים בטמפרטורת החדר במשך יותר משבעה חודשים15. שיטה זו נמנעת משימוש בחדרים נקיים ובציוד פוטוליטוגרפיה ודורשת הכשרה פחות מיוחדת. עם זאת, הדרישה לפוטומסקים עדיין מהווה משוכה משמעותית לניסויים הדורשים שינויים זמינים בדפוסים.
בנוסף לשיטות לתפעל גיאומטריה של תאים באמצעות תצהיר מבוקר של חלבוני ECM על משטח דו-ממדי, אחרים מבקשים לשלוט בצורת התא על ידי הגבלת תאים במיקרו-מבנים תלת-ממדיים. מחקרים רבים התאימו את הגישה הרכה המבוססת על ליתוגרפיה המתוארת לעיל כדי ליצור תלת מימד, ולא דו מימדי, תאי PDMS כדי לחקור תהליכים ביולוגיים תלויי צורה בעוברים, חיידקים, שמרים וצמחים16,17,18,19. פולמור דו פוטון (2PP) לקח גם את ההובלה כטכניקת microfabrication שיכול ליצור פיגומים הידרוג'ל 3D מורכבים עם רזולוציה ננומטר20. 2PP מסתמך על העקרונות של ספיחה של שני פוטון, שבו שני פוטונים המועברים בפולסים femtosecond נספגים בו זמנית על ידי מולקולה - photoinitiator במקרה זה - המאפשר פולמור מקומי של פוטופולימרים21. טכניקה זו שימשה בכבדות כדי להדפיס פיגומים 3D המחקים את המבנים המקומיים ECM של רקמה אנושית הוכח לגרום נזק פוטוכימי נמוך לתאים22.
הופעת הבכורה של microphotopatterning לפני 10 שנים נתן לחוקרים את ההזדמנות לפברק micropatterns תוך הימנעות ציוד נגיש ומתמחה. Microphotopatterning יוצר דפוסים בסולם מיקרון על ידי הסרה תרמית אזורים סלקטיביים של פולי ויניל אלכוהול (PVA) מצופה על משטחי זכוכית פעילים באמצעות לייזר אינפרא אדום23,24. חלבוני ECM המחברים רק את משטח הזכוכית המשמש כבסיס ולא PVA משמשים כרמזים ביוכימיים כדי לאפשר דינמיקה של התפשטות מבוקרת וצורת תא. שיטה זו מציעה גם גמישות מעולה שכן דפוסים ניתן לשנות בקלות בזמן אמת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד של microphotopatterning באמצעות מערכת הדמיה רב פוטון מסחרית. הפרוטוקול המתואר מיועד לייצור מהיר ואוטומטי של דפוסים גדולים. הוכחנו כי דפוסים אלה שולטים ביעילות בצורת התא על ידי הגבלת הגיאומטריה של הידבקויות תאים-ECM. לבסוף, אנו מראים כי טכניקת דפוס המתוארת מווסתת את הארגון ואת הדינמיקה של ציטוסקלטון actin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

Micropatterning היא טכניקה מבוססת בקהילת הביולוגיה של התא המשמשת לחקר קשרים בין המורפולוגיה והתפקוד של תאים תאיים תוך עקיפת סיבוכים הנובעים מווריאציות טבעיות של תא לתא. כדי לתקנן את צורת התא, התאים מוגבלים בתבניות תלת-ממדיות או נשלטים עבור גיאומטריה דביקה דרך איים דביקים. עם זאת, טכניקות micropatterning מסורתיות המבוססות על פוטוליטוגרפיה ותחיריט UV עמוק תלויות במידה רבה בחדרים נקיים או בציוד מיוחד. כאן אנו מציגים טכניקת מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום (microphotopatterning) שונה דויל ואח '. שניתן להגדיר בנוחות עם מערכות הדמיה זמין מסחרית. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במערכת הדמיה ניקון A1R MP+ כדי ליצור micropatterns עם דיוק מיקרון באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) כי ablates אזורים קבועים מראש על כיסויים מצופים אלכוהול פולי ויניל. אנו משתמשים בסקריפט מותאם אישית כדי לאפשר ייצור דפוסים אוטומטי ביעילות ובדיוק גבוהים במערכות שאינן מצוידות בפוקוס אוטומטי של חומרה. אנו מראים כי זה לייזר IR סייע micropatterning (microphotopatterning) הפרוטוקול תוצאות דפוסים מוגדרים אשר תאים לצרף באופן בלעדי ולקחת על הצורה הרצויה. יתר על כן, נתונים ממספר גדול של תאים ניתן ממוצע עקב סטנדרטיזציה של צורת התא. דפוסים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה, בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח כמותי, יכולים לשמש למסכי תפוקה גבוהים יחסית לזיהוי שחקנים מולקולריים המתווכים את הקשר בין צורה לתפקוד.

איכות הנתונים הניסיוניים המתקבלים באמצעות מיקרופטרנינג תלויה במידה רבה באיכות הדפוסים. כדי לקבוע את איכות הדפוסים שנוצרו בשיטה לעיל, השתמשנו לראשונה במיקרוסקופיית רפלקטיביות כדי להעריך את הצורה והגודל של האזורים המנוצלים של התמונה של ה- coverslip. גילינו שכל תבנית בודדת נראתה דומה מאוד למסכ...

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ייצור אוטומטי של מיקרופטרנים המתקננים את צורת התא כדי לחקור מבנים ציטוסקלטליים בתוך תאי יונקים. טכניקה ידידותית למשתמש זו ניתנת להגדרה עם מערכות הדמיה זמינות מסחרית ואינה דורשת ציוד מיוחד שאינו נגיש למעבדות סטנדרטיות לביולוגיה של התא.

שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Micropatterning היא טכניקה רבת עוצמה בשימוש על ידי מדענים כדי להבין קשרים בין צורת התא לבין הפעילות של מכונות בין תאיות. למרות מספר טכניקות לאפשר לחוקרים לווסת את צורת התא, טכניקות אלה לעתים קרובות דורשים ציוד מיוחד נגיש כמה מעבדות ביולוגיה. וידאו זה ידריך אותך לאורך השלבים הדרושים כדי להפוך micropatterning על מערכת הדמיה מולטי פוטון זמין מסחרית.אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא שהוא נמנע משימוש בציוד מיוחד. דפוסים ניתן גם לשנות בקלות ללא refabricating photomasks, שהוא בדרך כלל התהליך גוזל זמן רב ביותר micropatterning. כלי עיבוד התמונה שלנו יוצר תמונות תא ממוצעות המשקפות התפלגות מייצגת של חלבונים באופן לא משוחד ואוטומטי.למרות שאנו משתמשים בכיסויים בניסויים שלנו, זרימת העבודה האוטומטית גם מאפשרת לך לדפוס על שקופיות ומנות תחתית זכוכית. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שהגדרת מיקרוסקופ נכונה היא קריטית עבור המערכת כדי לדמות, לזהות את מישור המוקד הנכון, ואת התבנית באופן אוטומטי. הכן פתרון PVA כפי שהונחה.הוסף חלק אחד של HCL לשמונה חלקים PVA. הפוך את הצינור בזהירות כמה פעמים כדי לערבב. יוצקים שני מיליליטרים של הפתרון לתוך צלחת פטרי קטנה לטבול כיסוי מעובד מראש נקי לתוך הנוזל.דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות על שייקר. הסר בזהירות את ה- coverslip מהפתרון. השתמש ספינר coverslip לסובב את המעיל במשך 40 שניות.בינתיים, תנקה את פינצטה. מעבירים את הכיסוי לקופסה ומתייבשים בארבע מעלות למשך הלילה. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ.ראשית, הגדר את קו הלייזר ל-750 ננומטר. לאחר מכן הגדר תצורה אופטית חדשה בשם , תמונה. זוהי התצורה האופטית הבסיסית המאפשרת לנו לדמיין את הכיסוי באמצעות מחזירי אור.השאר אפשרויות אחרות כברירת מחדל ובחר את המטרה המתאימה. קבע את תצורת הגדרות החומרה תחת תצורה אופטית זו. הגדר את לייזר אינפרא אדום כלייזר הגירוי שלנו.מקם את מפצל הקרן בנתיב האור כדי להשתמש בלייזר IR להדמיה. בחר את יחידת הסורק של גלוונו ואת גלאי הסריקה D המתאים. בחר גודל סריקה וזמן השתהות שמספיק כדי ללכוד תכונות קטנות ב- coverslip.ודא שהתיבה השתמש בלייזר IR מסומנת. כוונן את עוצמת הלייזר של הרכישה ואת רגישות הגלאי כדי לקבל תמונה בהירה, אך לא רוויה, של משטח ה-coverslip. בחלון אזור הסריקה, הגדר מרחק מתצוגה לאחד כדי ללכוד את כל שדה התצוגה.שמור את התצורה האופטית. עכשיו נארגן סדרה של תצורות אופטיות שיאפשרו למיקרוסקופ להתמקד, לטעון את מסכת ההחזר על ההשקעה וליצור דפוסים באופן אוטומטי. התצורה האופטית הראשונה מאפשרת לנו להדפיס סמן נאמנות המשמש להתמקדות אוטומטית בשדה הראייה הנוכחי.שכפל את התצורה האופטית של התמונה ושנה את שמה, הדפס סמן נאמנות. מכיוון שאנו מדפיסים בשלב זה, הזז את מפצל הקרן מנתיב האור והחלף אותו במראה דיכרית מתאימה. בחר את גודל הסריקה הקטן ביותר כדי לחסוך זמן.מכיוון שלא נדרשת הדמיה בשלב זה, הגדר את רגישות הגלאי לאפס. הגבר את עוצמת הלייזר כדי לאפשר הדפסה. בחלון אזור הסריקה, הגדר את גודל התצוגה למקסימום והצב את אזור הסריקה במרכז שדה התצוגה.עכשיו אנחנו נארגן ניסוי מחסנית Z כדי להסביר כל אי אחידות במשטח PVA. הגדר את התנועה במיקום Z ליחסית. בחר את התקן Z המתאים.לאחר מכן, שכפל את התצורה האופטית של התמונה ושנה את שמה, מוקד אוטומטי. בחר את גודל הסריקה הקטן ביותר והקטן את מקדם גודל התצוגה בחלון אזור הסריקה כך שדה התצוגה יהיה מעט גדול יותר מסמן הנאמנות. פעולה זו מבטיחה שתכונות קטנות אחרות ב- coverslip לא יפריעו להתמקדות אוטומטית.בתפריט התקנים, בחר הגדרת מיקוד אוטומטי. הגדר את עובי הסריקה לזה בניסוי מחסנית Z. המיקרוסקופ יסרוק את הטווח הזה וימצא את מישור המוקד הטוב ביותר באמצעות סמן הנאמנות.לאחר מכן, שכפל את התצורה האופטית של התמונה ושנה את שמה, טען החזר על ההשקעה. הגדר את גודל הסריקה זהה לגודל מסיכת ההחזרה על ההשקעה מכיוון שהמסיכה תיטען על תמונה שצולמה בתצורה אופטית זו. השתמשנו בפיקסלים 2048 כדי להשיג איזון אופטימלי בין רזולוציה למהירות.עכשיו אנחנו נגדיר את התצורה האופטית המשמשת לתבנית הכיסוי. שכפל את התצורה האופטית של סמן הנאמנות המודפס ושנה את שמו, Micropattern. הגדר את פקטור גודל התצוגה לאחת.הגדל את כוח לייזר גירוי כדי ablate PVA. בחר מהירות סריקה מתאימה. בחלון גירוי ND, להגדיר ניסוי גירוי ND.הוסף כמה שלבים ללוח הזמנים וקבע כל אחד בגירוי. ודא שאזור הגירוי ומשך הזמן נכונים. באותו חלון, הפעל את פונקציית הזזת השלב הראשי Z לפני כל שלב.זה שוב מסביר את כל הסטיות בכיוון Z. לבסוף, הגדר תצורה אופטית כדי ליצור תווית גלויה על ה-coverslip שיכולה לעזור לנו לאתר את התבניות. שכפל את סמן הנאמנות של ההדפסה ושנה את שמו, משטח תווית.הגדל את עוצמת הלייזר באופן משמעותי והגדר זום לאחד. מעבירים את הכיסוי מצופה PVA למחזיק. למיקרוסקופ זקוף, ודאו שפני השטח של PVA פונים כלפי מטה.מוסיפים מים לפינות כדי לייצב את הכיסוי. הר המחזיק על במת המיקרוסקופ. מנמיכים את המטרה ומוסיפים מים ביניהם.בתוכנת המיקרוסקופ, הפעל את תריס הלייזר של IR ובצע יישור אוטומטי לפני הדפוס. עבור לתצורה האופטית של התמונה. סרוק את שדה הראייה תוך הקרבה איטית של המטרה לכיסוי.בהתחלה, התמונה תיראה עמומה מאוד. קירבו את המטרה לכיסוי עד שהבהירות של התמונה תגדל מעט. זהו משטח הכיסוי הפונה למטרה.המשך להזיז את המטרה עד שהבהירות תפחת ותעלה שוב. זה משטח PVA שאנחנו דפוס. התמקד בכל תכונה קטנה, כגון פגמים או אבק, והגדר אפס בכונן Z.עבור לתצורה האופטית של משטח התווית. לחץ על לכידה. חזור להדמיה וסריקה.נזקי זכוכית מראים שהתווית הודפסה בהצלחה. להזיז את הבמה על ידי אחד לשני שדות הראייה כדי למנוע חלקיקי זכוכית. סרוק כדי לאשר.בתפריט התקנים, פתח את מאקרו תנועת הבמה. הגדר את המשתנים M ו- N למספר הרצוי של שדות תצוגות שיעצבו. שמור והפעל את המאקרו.לאחר השלמת התבניות, עבור לתצורה האופטית של התמונה וסרוק את התבניות. לאיי דפוס בכל שדה ראייה צריכים להיות גבולות ברורים ולשקף אור באופן שווה. תבניות שנראות כהות ולא אחידות מרמזות על הסרת PVA לא שלמה.זה בדרך כלל בגלל כוח לייזר מספיק או מישור מוקד שגוי. אם כוח לייזר מוגדר גבוה מדי, זה יכול גם לגרום PVA לבועה. לאחר ציפוי תאים על coverslips, תאים צריכים להתפשט ולקחת על הצורה של התבנית.זוהי תמונת כשל חיסוני של פיברובלסט אנושי מצופה בדפוס קשת. התא מציג שפה עשירה במעשה של lamellipodia. סיבי לחץ עבים וגחוניים לאורך שני הצדדים וסיבי הלחץ הגבי המחוברים באמצעות קשתות רוחביות.שרשרת אור מיוסין ישב מאחורי שפת lamellipodia צפופה והציג דפוס מפוספס לאורך חבילות actin. באמצעות כלי עיבוד התמונה המותאם אישית שלנו, יצרנו תמונה ממוצעת של חלבוני העניין שלנו. תמונה זו מראה כי מבני actin המתוארים לעיל עקביים על פני מספר רב של דפוסים.למרות שאנו מאבדים מבנים בודדים של מיוסין לאחר ממוצע, זה לוקליזציה לאורך חבילות actin נשמר. לאחר צפייה בסרטון וידאו זה, אתה אמור להיות מסוגל להגדיר זרימת עבודה מיקרו דפוס באמצעות מערכת multiphoton זמין מסחרית עם עבודה ידנית מינימלית. חשוב למטב את עוצמת הלייזר עבור המערכת שלך כדי למנוע יצירת דפוסים לא שלמים או יעילות מרבית PVA ניתן להשיג על ידי התאמת הפרמטרים פוקוס אוטומטי ו micropatterning צעדים.בנוסף לחקירת מסלולים תאיים המערבים מורפולוגיה של תאים, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על הקרנת סמים ויישומים אחרים הרגישים לווריאציות בצורת התא.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

חיזוי השתקת ג &#39;ין באמצעות שליטה Spatiotemporal של siRNA שחרור מ תגובה תגובה פולימרית פולימרית

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

סינתזה של כמעט אינפרא-אדום פליטת מזהב ננו אשכולות עבור יישומים ביולוגיים

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

הקלת הדם נישא תא מצורף שתלים מתכת באמצעות CD47 נגזר פפטיד אימוביליזציה

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

צילום כפול של בעלי חיים קטנים פוטואקוסטיים לסריקת רסטר לפריטים חזותיים של כלי דם

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...