Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

この研究は、コノート基金の新調査官賞(S.P.、カナダイノベーション財団、NSERCディスカバリー補助金プログラム)(RGPIN-2015-05114とRGPIN-2020-05881)、マンチェスター大学とトロント大学共同研究基金、トロント大学XSeedプログラムによって支援されました。C.T.はNSERC USRAフェローシップによって支えられていました。

1. カバースリップ前処理
<ol><li>ウォーターマンストア、199825に記載されているようにキーキークリーンなカバーリップを準備します。</li>
	<li>1%(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)溶液を調製し、穏やかな攪拌で10分間溶液中のカバーリップをインキュベートします。カバーリップがソリューション内で自由に動かされることを確認します。</li>
	<li>カバーリップをd...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells.">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li><li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility.">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li><li>Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development.">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration:+Integrating+Signals+from+Front+to+Back.">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells.">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels.">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+Movements:+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts.">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+Processing:+Surface,+Micro-,+and+Nanoscale+Processing.">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li><li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions.">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers.">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li><li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli.">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li><li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth.">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li><li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., J&#246;nsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control.">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li><li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf.">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li><li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications:+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization.">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).</li><li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization:+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix.">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

上記の結果は、記述されたIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞形状および細胞骨格アーキテクチャの操作を可能にする様々な形状の再現可能な付着パターンを提供することを示している。マイクロフォトパターニングのデビュー前と後の両方で多くのマイクロパターン化法が開発されてきたが、この方法には複数の利点がある。第一に、通常は...

細胞形状は、組織形態形成1、細胞遊び出し2、細胞増殖3、遺伝子発現4などの基本的な生物学的プロセスの重要な決定因子である。細胞形状の変化は、細胞膜を変形させる細胞骨格の動的再配置と、細胞に及ぶ外力などの外的要因と、細胞細胞および細胞マトリックス接着の幾何学的形状との間の複雑なバランスによって駆動される。例えば、間葉系細胞の移動は、血漿膜を前方に押し出し、広いラメリポディア6を作成する先端に密なアクチンネットワークを重合し、アクトミオシン収縮は細胞の狭い後縁を引き込んで現在位置7,8から細胞を取り外す。このような特殊な細胞骨格構造を摂動するようなシグナル伝達事象を破壊し、細胞の移動を遅くする9.また、胃の中での上皮シートの曲げには、細胞とその隣人がくさび状の10になる原因となるアクトミオシンベースの尖語狭窄が必要です。これらの研究は細胞形状の重要性を強調しているが、細胞形状の固有の不均一性は、形態を機能に結びつけるメカニズムを特定する努力を妨げている。
このため、細胞の形状を操作するための数多くのアプローチが過去30年間に開発されました。これらのアプローチは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を防汚表面にパターン化して細胞接着幾何学的形状を3次元型で拘束するか、または細胞接着幾何学を制御することによって、その目標を達成する、マイクロパターニング11と呼ぶ技術である。ここでは、長年にわたって人気を集めている技術の数を確認します。
もともとマイクロエレクトロニクスアプリケーションのアプローチとして開拓されたソフトリソグラフィベースのマイクロコンタクト印刷は、明らかにカルトのお気に入り12になっています。マスターウエハは、まずフォトレジスト被覆シリコン基板の領域を光照射に選択的に露出させることによって作製され、パターン化された表面13を残す。次いで、PDMSなどのエラストマーをマスターウエハに注ぎ、ECMタンパク質を所望の基質11,14に移すソフトな「スタンプ」を生成する。製造されると、マスターウエハを使用して、再現性の高いマイクロパターン12を生じさせる多くのPDMSスタンプをキャストすることができる。しかし、長いフォトリソグラフィプロセスのためにパターンを容易に調整することはできません。このプロセスには、生物学部門では一般的に利用できない高度に特殊な機器とクリーンルームも必要です。
最近では、深いUVを用いたダイレクト印刷は、従来のリソグラフィーベースのアプローチによってもたらされる限界を回避することが報告されている。深いUV光は、ポリL-リジン-移植-ポリエチレングリコールでコーティングガラスカバースリップの選択的領域にフォトマスクを介して向けられる。深部UVにさらされた化学基は、感光リンカーを使用せずに光変換され、ECMタンパク質15の結合を可能にする。感光リンカーの欠如は、パターン化されたカバーリップが7ヶ月以上室温で安定したままであることを可能にします15.この方法はクリーンルームおよびフォトリソグラフィ装置の使用を避け、より少ない専門訓練を必要とする。しかし、フォトマスクの要件は、パターンの容易に利用可能な変更を必要とする実験のための実質的なハードルをまだ提起します。
また、2D表面にECMタンパク質を制御して細胞の形状を操作する方法に加えて、細胞を3D微細構造に閉じ込めることで細胞形状を制御する方法も模索しています。多くの研究は、胚、細菌、酵母および植物16、17、18、19における形状依存性生物学的プロセスを調査するために、2Dではなく、PDMSチャンバーを生成するために、上記のソフトリソグラフィーベースのアプローチを適応させた。二光子重合(2PP)はまた、ナノメートル分解能20で複雑な3Dヒドロゲル足場を作り出すことができる微細加工技術としてリードを取った。2PPは、2光子吸着の原理に依存しており、フェムト秒パルスで送達される2つの光子は、光重合体21の局所重合を可能にする分子(この場合は光発合剤)によって同時に吸収される。この技術は、ヒト組織のネイティブECM構造を模倣する3D足場を印刷するために多用されており、細胞22に低い光化学的損傷を誘導することが示されている。
10年前のマイクロフォトパターニングのデビューにより、研究者はアクセス不能で特殊な機器を避けながらマイクロパターンを製造する機会を得ました。マイクロフォトパターン化は、赤外線レーザー23,24を用いて活性ガラス表面に被覆されたポリビニルアルコール(PVA)の選択的領域を熱的に除去することにより、ミクロンスケールのパターンを作成する。PVAではなく下層ガラス表面のみを取り付けるECMタンパク質は、制御された拡散ダイナミクスと細胞形状を可能にする生化学的手掛かりとして機能します。また、パターンをリアルタイムで容易に変更できるため、柔軟性も高くなります。ここでは、商用のマルチフォトンイメージングシステムを用いてマイクロフォトパターニングのステップバイステッププロトコルを提供する。記述されたプロトコルは大きいパターンの急速で自動化された製造のために設計されている。これらのパターンは、細胞-ECM接着の幾何学的形状を拘束することによって、細胞形状を効率的に制御することを実証した。最後に、記述されたパターン化技術がアクチン細胞骨格の組織とダイナミクスを調節することを実証する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

マイクロパターニングは、自然な細胞間変動から生じる合併症を回避しながら、細胞コンパートメントの形態と機能の間の関係を研究するために使用される細胞生物学コミュニティで確立された技術です。細胞形状を標準化するために、セルは3D金型に閉じ込められるか、接着的な島を通して接着幾何学のために制御されます。しかし、フォトリソグラフィとディープUVエッチングに基づく従来のマイクロパターニング技術は、クリーンルームや特殊な設備に大きく依存しています。ここでは、市販の撮像システムで簡便に設定できる、ドイルらから改変された赤外線レーザー支援マイクロパターン化技術(マイクロフォトパターン化)を提示する。このプロトコルでは、ニコンA1R MP+イメージングシステムを使用して、ポリビニルアルコールコーティングカバーリップ上のプリセット領域をアブラプターする赤外線(IR)レーザーを介してミクロン精度のマイクロパターンを生成します。ハードウェアオートフォーカスを搭載していないシステムでは、高効率かつ精度の高いパターン製作を可能にするカスタムスクリプトを採用しています。我々は、このIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞が排他的に取り付け、所望の形状を取る定義されたパターンをもたらすことを示す。さらに、セル形状の標準化により、多数の細胞からのデータを平均化することができる。このプロトコルで生成されたパターンは、高解像度のイメージングと定量分析と組み合わせて、比較的高いスループット画面に使用して、形態と機能の間のリンクを媒介する分子プレーヤーを識別することができます。

マイクロパターン化によって得られる実験データの質は、パターンの品質に大きく依存する。上記の方法で生成されるパターンの品質を決定するために、最初に反射率顕微鏡を使用して、カバースリップの写真のアブスレート領域の形状と大きさを評価しました。個々のパターンはアブレーションマスクと非常によく似ており、透明なボーダーと、光を均一に反射する表面を表示しているこ?...

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Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

ここで示すプロトコルは、哺乳類細胞内の細胞骨格構造を研究するために細胞形状を標準化するマイクロパターンの自動製作を可能にする。このユーザーフレンドリーな技術は市販のイメージ投射システムと設定することができ、標準的な細胞生物学の実験室にアクセスできない専門の装置を要求しない。

赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

マイクロパターニングは、細胞の形状と細胞間機械の活動との関係を理解するために科学者によって採用される強力な技術です。いくつかの技術は、研究者が細胞の形状を調節することを可能にしますが、これらの技術は、多くの場合、いくつかの生物学の研究室にアクセスできない特殊な機器を必要とします。このビデオでは、市販のマルチフォトンイメージングシステムでマイクロパターン化を自動化するために必要な手順について説明します。このプロトコルの利点の 1 つは、特殊な機器の使用を回避することです。また、フォトマスクを再作製することなくパターンを容易に変更することもできます。当社の画像処理ツールは、タンパク質の代表的な分布を公平かつ自動化された方法で反映した平均細胞画像を生成します。実験ではカバーリップを使用していますが、自動ワークフローではスライドやガラス底の皿をパターン化することもできます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、システムがイメージを作成し、正しい焦点面を識別し、自動化された方法でパターンを識別するために適切な顕微鏡のセットアップが重要であるため、重要です。指示に従ってPVA溶液を準備する。8 つのパーツ PVA に 1 つのパーツ HCL を追加します。チューブを慎重に数回反転して混ぜます。小さなペトリ皿に溶液の2ミリリットルを注ぎ、液体にきれいな前処理カバースリップを水没させます。シェーカーで室温で5分間インキュベートします。慎重に溶液からカバースリップを取り外します。カバースリップスピナーを使用して、40秒間コートを回転させます。その間に、ピンセットをきれいにします。カバースリップを箱に移し、一晩で4度乾かします。顕微鏡ソフトウェアをオンにします。まず、レーザーラインを750ナノメートルに設定します。次に、イメージという新しい光学式構成を設定します。これは、反射光を通してカバースリップをイメージ化することを可能にするベースライン光学構成です。他のオプションをデフォルトのままにして、適切な目標を選択します。この光の構成でハードウェア設定を構成します。赤外線レーザーを刺激レーザーとして設定します。光の経路にビームスプリッタを配置し、IRレーザーを使用してイメージングします。ガルヴァーノスキャナユニットと適切なDスキャン検出器を選択します。カバースリップ上の小さなフィーチャをキャプチャするのに十分なスキャン サイズとドウェル時間を選択します。[IR レーザーを使用]ボックスがオンになっていることを確認します。取得レーザーパワーと検出器感度を調整して、カバースリップ表面の明るい、しかし飽和していない画像を得る。スキャンエリアウィンドウで、ズームを1に設定して、視野全体をキャプチャします。オプティカル構成を保存します。今度は、顕微鏡が焦点を合わせ、ROIマスクをロードし、自動化された方法でパターンを生成できるようにする一連の光学的構成を設定します。最初の光学式構成により、現在の視野に自動焦点を当てるために使用される受託者マーカーを印刷することができます。画像光学構成を複製し、それを名前変更, 印刷受託マーカー.このステップでは印刷中なので、光路からビームスプリッターを移動し、適切な二色鏡に置き換えます。時間を節約するために、スキャンの最小サイズを選択します。このステップではイメージングが不要なので、検出器感度をゼロに設定します。印刷を可能にするには、レーザーパワーを上げます。スキャンエリアウィンドウで、ズームを最大に設定し、スキャンエリアを視野の中央に配置します。次に、PVA サーフェスの不均等を考慮して Z スタック実験を設定します。Z 位置の移動を相対位置に設定します。適切な Z デバイスを選択します。次に、画像光学構成を複製し、オートフォーカスの名前を変更します。スキャンの最小サイズを選択し、スキャン領域ウィンドウのズーム倍率を小さくして、視野が受託マーカーよりわずかに大きくなるようにします。これにより、カバースリップ上の他の小さなフィーチャーが自動焦点を妨げなくなります。[デバイス]メニューで、[自動フォーカス設定]を選択します。Z スタック実験でスキャンの厚さを設定します。顕微鏡はこの範囲をスキャンし、受託者マーカーを使用して最もよい焦点面を見つける。次に、イメージ光学構成を複製し、その名前を変更して ROI を読み込みます。この光学式構成で撮影した画像にマスクがロードされるため、ROMIマスクと同じスキャンサイズを設定します。解像度と速度の最適なバランスを実現するために、2048ピクセルを使用しました。次に、カバースリップのパターン化に使用する光学式構成を設定します。印刷受託者マーカー光学構成を複製し、それを名前変更する、マイクロパターン。ズーム倍率を 1 に設定します。PVAを減退させるために刺激レーザーパワーを増加させます。適切なスキャン速度を選択します。ND刺激ウィンドウで、ND刺激実験を設定します。時間スケジュールにいくつかのフェーズを追加し、刺激でそれぞれを設定します。刺激領域と持続時間が正しいことを確認します。同じウィンドウで、ステージ移動のメイン Z 関数を各フェーズの前に有効にします。この場合も、Z 方向の偏差が含まれます。最後に、パターンの特定に役立つカバースリップに目に見えるラベルを作成する光学式構成を設定します。印刷受託マーカーを複製し、それを名前を変更,ラベルサーフェス。レーザーパワーを大幅に増加させ、ズームを1に設定します。PVAコーティングされたカバースリップをホルダーに移します。直立顕微鏡の場合は、PVA表面が下向きであることを確認します。カバースリップを安定させるためにコーナーに水を加えます。ホルダーを顕微鏡ステージに取り付けます。目的を下げ、その間に水を加えます。顕微鏡ソフトでは、IRレーザーシャッターをオンにして、パターニングの前に自動調整を行います。イメージ光構成に切り替えます。カバースリップにゆっくりと目的を近づけながら、視野をスキャンします。最初は、画像が非常に薄暗く表示されます。画像の明るさがわずかに高くなるまで、目的をカバースリップに近づけます。これは、目的に向いているカバースリップサーフェスです。明るさが減少し、再び増加するまで、目的を移動し続けます。これは我々がパターン化するPVA表面です。カバースリップの欠陥やほこりなどの小さな機能に焦点を当て、Zドライブにゼロを設定します。ラベル表面の光学構成に切り替えます。[キャプチャ]をクリックします。イメージングとスキャンに戻ります。ガラスの破損は、ラベルが正常に印刷されたことを示しています。ガラス粒子を避けるために、ステージを 1 ~ 2 つの視野で移動します。確認するためにスキャンします。デバイスメニューで、ステージ移動マクロを開きます。変数 M と N を、パターン化するビューのフィールドの必要な数に設定します。マクロを保存して実行します。パターニングが完了したら、画像光学構成に切り替えてパターンをスキャンします。各視野のパターンアイランドは、明確な境界線を持ち、光を均等に反射する必要があります。暗く不均一に見えるパターンは、不完全な PVA 除去を示唆しています。これは通常、レーザーパワーが不十分であるか、または誤った焦点面が原因です。レーザーパワーが高すぎると、PVAが泡立つ原因となる可能性もあります。細胞を覆わす上でめっきした後、細胞は広がり、パターンの形を取る必要があります。クロスボウパターンにメッキされたヒト線維芽細胞の蛍光画像です。セルはラメリポディアのアクチンが豊富な縁を表示します。両側に沿った厚い腹側応力繊維と、横円弧によって接続された後部応力繊維。ミオシン軽鎖は密なラメリポディアリムの後ろに座り、アクチンバンドルに沿って縞模様を表示した。カスタム画像処理ツールを使用して、目的のタンパク質の平均画像を生成しました。この画像は、上記のアクチン構造が多数のパターンにわたって一貫していることを示しています。我々は、平均化した後にミオシンの個々の構造を失うが、それはアクチンバンドルに沿って局在化が保存されています。このビデオを見た後、最小限の手作業で市販のマルチフォトンシステムを使用してマイクロパターニングワークフローを設定できるはずです。不完全なパターンを生成しないように、またはPVA最大効率を自動焦点とマイクロパターン化のステップでパラメータを調整することによって達成できるように、システム用のレーザーパワーを最適化することが重要です。細胞形態を含む細胞経路の調査に加えて、この技術は、細胞の形状の変化に敏感な薬物スクリーニングおよび他のアプリケーションにも適用することができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

赤外線マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化することにより、全身質量分析イメージング（IR-MALDESI）

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

光応答性高分子ナノキャリアからのsiRNA放出の時空間制御による遺伝子サイレンシングの予測

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

近赤外線発光金ナノクラスターの生物応用のための合成

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

血管可視化のための二重ラスター走査光音響小動物イメージャー

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...