Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

이 작품은 S.P.에 Connaught 기금 새로운 조사상에 의해 지원되었다, 혁신을위한 캐나다 재단, NSERC 디스커버리 보조금 프로그램 (보조금 RGPIN-2015-05114 및 RGPIN-2020-05881), 맨체스터 대학과 토론토 대학 공동 연구 기금, 토론토 XSeed 프로그램 대학. C.T.는 NSERC USRA 펠로우십의 지원을 받았습니다.

1. 커버 슬립 전처리
<ol><li>워터맨 스토어, 1998년 25에설명 된 대로 삐걱 거리는 깨끗한 커버립을 준비합니다.</li>
	<li>1% (3-aminopropyl) 트리메톡시실레인 (APTMS) 용액을 준비하고 부드러운 동요와 함께 10 분 동안 용액의 커버립을 배양. 커버립이 솔루션에서 자유롭게 이동해야 합니다.</li>
	<li>워시 커버립은 dH2O로 각각 5분 씩 두 번 커버합니다.</li>
	<li>0.5% 글루타랄데히드(GA)...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells.">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li><li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility.">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li><li>Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development.">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration:+Integrating+Signals+from+Front+to+Back.">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells.">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels.">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+Movements:+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts.">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+Processing:+Surface,+Micro-,+and+Nanoscale+Processing.">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li><li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions.">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers.">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li><li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli.">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li><li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth.">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li><li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., J&#246;nsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control.">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li><li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf.">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li><li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications:+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization.">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).</li><li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization:+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix.">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

상기 결과는 기술된 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포 형상 및 세포골격계 건축의 조작을 가능하게 하는 다양한 형상의 재현가능한 부착 패턴을 제공한다는 것을 보여준다. 마이크로포토패싱이 시작되기 전과 이후에 수많은 마이크로패턴 방법이 개발되었지만, 이 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, 일반적으로 엔지니어링 부서 내에서만 발견되는 특수 장?...

세포 형상은 조직 형태발생1,세포 이동2,세포 증식3및 유전자 발현4와같은 근본적인 생물학적 과정의 주요 결정자이다. 세포 형상의 변화는 혈장 막과 세포 세포 및 세포 매트릭스 유착의 기하학과 같은 외장 적 인자를 변형시키는 세포 골격의 동적 재배열 사이의 복잡한 균형에 의해 구동된다5. 예를 들어, 중간엽 세포를 마이그레이션하는 것은 플라즈마 멤브레인을 앞으로 밀어 내고 넓은 라멜리포디아6을생성하는 최첨단 액틴 네트워크를 중합하고, actomyosin 수축은 세포의 좁은 후행 가장자리를 후퇴시켜 현재 위치7,8에서세포를 분리한다. 이러한 특수 시토셀레탈 구조를 초래하는 신호 이벤트를 방해하여 모양과 극성을 분산시키고 세포 이동9을느리게 합니다. 또한, 위화 중에 상피 시트굽힘은 세포와 이웃이 쐐기 모양10이되는 원인이 되는 actomyosin 기반 의 정압 수축을 필요로 한다. 이 연구 결과는 세포 모양의 중요성을 강조하더라도, 세포 모양에 있는 내재된 이질성은 기능에 형태학을 연결하는 기계장치를 확인하기 위하여 노력을 방해했습니다.
이를 위해 지난 3년 동안 세포 모양을 조작하기 위한 수많은 접근법이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 세포세포를 3차원 몰드로 제한하거나 세포외 매트릭스(ECM) 단백질의 패턴 침착을 통해 세포 부착 기하학을 제어하는 것으로 목표를 달성하며,마이크로패터닝(11)이라고불리는 기술이다. 여기에서 우리는 수년에 걸쳐 인기를 얻은 기술의 숫자를 검토합니다.
원래 마이크로 전자 응용 프로그램에 대한 접근 으로 개척, 소프트 리소그래피 기반 마이크로 접촉 인쇄는 명백하게 컬트좋아하는되고있다 12. 마스터 웨이퍼는 먼저 포토레지스트 코팅 실리콘 기판의 영역을 광조사에 선택적으로 노출시켜 패턴표면(13)을남겨두고 제작된다. PDMS와 같은 탄성중합체는 마스터 웨이퍼에 부어 ECM 단백질을 원하는기판(11,14)으로전달하는 부드러운 "스탬프"를 생성한다. 일단 제작되면 마스터 웨이퍼를 사용하여 많은 PDMS 스탬프를 캐스팅하여 매우 재현 가능한 마이크로패턴(12)을유발할 수 있습니다. 그러나 긴 포토리소그래피 프로세스로 인해 패턴을 쉽게 조정할 수 없습니다. 이 과정은 또한 생물학 부에서 일반적으로 사용할 수없는 고도로 전문화된 장비와 클린룸이 필요합니다.
최근에는 딥 UV를 이용한 직접 인쇄는 기존의 리소그래피 기반 접근법에 의해 야기되는 한계를 우회하는 것으로 보고되었습니다. 딥 UV 광은 포토마스크를 통해 폴리 L-리신-이식-폴리에틸렌 글리콜으로 코팅된 유리 커버슬립의 선택적영역으로 전달됩니다. 깊은 UV에 노출된 화학 군은 ECM단백질(15)의결합을 가능하게 하기 위해 감광성 링커를 사용하지 않고 광변환된다. 감광성 링커가 부족하여 패턴 커버립이 7개월 이상 실온에서 안정적으로 유지될 수있습니다. 이 방법은 클린룸과 포토리소그래피 장비의 사용을 방지하고 덜 전문적인 교육이 필요합니다. 그러나 포토마스크에 대한 요구 사항은 여전히 패턴의 쉽게 사용할 수 있는 변경이 필요한 실험에 상당한 장애물이 됩니다.
2D 표면에 ECM 단백질의 제어 된 증착을 통해 세포 기하학을 조작하는 방법 외에도, 다른 3D 미세 구조에 세포를 제한하여 세포 모양을 제어하는 방법을 추구한다. 많은연구는 배아, 박테리아, 효모 및 식물16,17,18,19에서모양 의존성 생물학적 과정을 조사하기 위해 2D, PDMS 챔버가 아닌 3D를 생성하기 위해 위에서 설명한 소프트 리소그래피 기반접근법을조정하였다. 2-광자 중합(2PP)은 또한 나노미터분해능(20)을가진 복잡한 3D 하이드로겔 스캐폴드를 생성할 수 있는 미세 제조 기술로 주도권을 잡았다. 2PP는 펨토초 펄스에서 전달되는 두 개의 광자가 동시에 흡수되는 2광광흡착의 원리에 의존하며, 이 경우광중합체(21)의국소 중합화를 가능하게 한다. 이 기술은 인간 조직의 네이티브 ECM 구조를 모방하는 3D 스캐폴드를 인쇄하기 위해 크게 사용되었으며세포(22)에낮은 광화학적 손상을 유도하는 것으로 나타났다.
10년 전 마이크로포토패싱의 데뷔는 연구원들에게 접근이 불가능하고 특수장비가 없는 동시에 마이크로패턴을 제작할 수 있는 기회를 제공했습니다. 마이크로포토패터닝은 적외선레이저(23,24)를이용하여 활성화된 유리 표면에 코팅된 폴리비닐 알코올(PVA)의 선택적 영역을 열적으로 제거하여 미크로톤 스케일에 패턴을 생성한다. PVA가 아닌 기본 유리 표면만을 부착하는 ECM 단백질은 제어된 확산 역학 및 세포 모양을 가능하게 하는 생화학적 단서역할을 합니다. 이 방법은 패턴을 실시간으로 쉽게 변경할 수 있기 때문에 뛰어난 유연성을 제공합니다. 여기서, 우리는 상업적다광화상 영상을 이용하여 마이크로포토패싱의 단계별 프로토콜을 제공한다. 설명된 프로토콜은 대형 패턴의 신속하고 자동화된 제조를 위해 설계되었습니다. 우리는 이러한 패턴이 세포-ECM 접착력의 형상을 제한하여 셀 모양을 효율적으로 제어한다는 것을 입증했습니다. 마지막으로, 설명된 패터닝 기술이 액틴 세포골격의 조직과 역학을 조절한다는 것을 입증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

Micropatterning은 자연적인 세포 대 세포 변이에서 발생하는 합병증을 우회하면서 세포 구획의 형태와 기능 사이의 연결을 연구하는 데 사용되는 세포 생물학 커뮤니티에서 확립 된 기술입니다. 세포 모양을 표준화하기 위해 세포는 3D 금형에 국한되거나 접착제 섬을 통해 접착제 형상을 제어합니다. 그러나 포토리소그래피와 딥 UV 에칭을 기반으로 하는 기존의 마이크로패턴 기술은 클린룸이나 특수 장비에 크게 의존합니다. 여기서 우리는 도일 외에서 변형된 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝 기술(microphotopatterning)을 제시하여 시판되는 이미징 시스템으로 편리하게 설정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Nikon A1R MP+ 이미징 시스템을 사용하여 폴리 비닐 알코올 코팅 커버립의 사전 설정 영역을 축산하는 적외선(IR) 레이저를 통해 미크론 정밀도로 마이크로패턴을 생성합니다. 우리는 하드웨어 자동 초점이 장착되지 않은 시스템에서 고효율과 정확도로 자동화 된 패턴 제작을 가능하게하기 위해 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 우리는 이 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포가 독점적으로 부착하고 원하는 모양을 취하는 정의된 패턴을 초래한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 셀 형상의 표준화로 인해 많은 수의 세포로부터의 데이터를 평균화할 수 있다. 고해상도 이미징 및 정량 분석과 결합된 이 프로토콜과 함께 생성된 패턴은 상대적으로 높은 처리량 스크린에 사용하여 형태와 기능 간의 연결을 중재하는 분자 플레이어를 식별할 수 있습니다.

마이크로패터닝을 통해 얻은 실험 데이터의 품질은 패턴의 품질에 크게 좌우됩니다. 위의 방법으로 생성 된 패턴의 품질을 결정하기 위해 먼저 반사 현미경 검사를 사용하여 커버 슬립의 사진 압착 영역의 모양과 크기를 평가했습니다. 우리는 각 개별 패턴이 절제 마스크와 매우 유사하게 보였고 선명한 보더와 균일하게 빛을 반사하는 표면을 표시한 것으로나타났습니다(그림 2B)....

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Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

마이크로패터닝은 세포 모양과 세포 간 기계의 활동 사이의 연결을 이해하기 위해 과학자들이 사용하는 강력한 기술입니다. 몇몇 기술은 연구원이 세포 모양을 조절하는 것을 허용하더라도, 이 기술은 수시로 몇몇 생물학 실험실에 접근할 수 없는 특화된 장비를 요구합니다. 이 비디오는 시판되는 다광화상 이미징 시스템에서 마이크로패터닝을 자동화하는 데 필요한 단계를 안내합니다.이 프로토콜의 한 가지 장점은 특수 장비의 사용을 피한다는 것입니다. 또한 일반적으로 마이크로패턴에서 가장 시간이 많이 소요되는 공정인 포토마스크를 재구성하지 않고도 패턴을 쉽게 변경할 수 있습니다. 당사의 이미지 처리 도구는 공정하고 자동화된 방식으로 단백질의 대표적인 분포를 반영하는 평균 세포 이미지를 생성합니다.실험에서 커버립을 사용하지만 자동화된 워크플로우를 사용하면 슬라이드와 유리 바닥 접시에 패턴을 표시할 수도 있습니다. 적절한 현미경 설정이 시스템이 올바른 초점 평면을 식별하고 자동화 된 방식으로 패턴을 식별하는 데 매우 중요하기 때문에이 방법의 시각적 데모는 중요합니다. 지시에 따라 PVA 솔루션을 준비합니다.8개 부품 PVA에 HCL 1부를 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 혼합하려면 몇 번 반전하십시오. 용액 2밀리리터를 작은 페트리 접시에 붓고 깨끗한 전처리된 커버슬립을 액체에 담급니다.셰이커에서 실온에서 5분간 배양하세요. 조심스럽게 솔루션에서 커버 슬립을 제거합니다. 커버슬립 스피너를 사용하여 40초 동안 코트를 회전시십시오.그 동안, 핀셋을 청소. 커버슬립을 상자에 옮기고 하룻밤 사이에 4도건조합니다. 현미경 소프트웨어를 켭니다.먼저 레이저 라인을 750나노미터로 설정합니다. 그런 다음 이미지라는 새 광학 구성을 설정합니다. 이것은 우리가 반사체를 통해 커버 슬립을 이미지 할 수있는 기준 광학 구성입니다.다른 옵션을 기본값으로 두고 적절한 목표를 선택합니다. 이 광학 구성에서 하드웨어 설정을 구성합니다. 적외선 레이저를 자극 레이저로 설정합니다.광선 스플리터를 광선 경로에 배치하여 이미징을 위해 IR 레이저를 사용합니다. 갈바노 스캐너 장치와 적절한 D 스캔 감지기를 선택합니다. 커버슬립의 작은 피처를 캡처하기에 충분한 스캔 크기와 거주 시간을 선택합니다.IR 레이저 사용 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 커버슬립 표면의 밝지만 포화되지 않은 이미지를 얻기 위해 획득 레이저 전력 및 검출기 민감도를 조정합니다. 스캔 영역 창에서 확대/축소를 하나로 설정하여 전체 시야 필드를 캡처합니다.광학 구성을 저장합니다. 이제 현미경이 집중되고 ROI 마스크를 로드하며 자동화된 방식으로 패턴을 생성할 수 있는 일련의 광학 구성을 설정합니다. 첫 번째 광학 구성을 통해 현재 시야에 자동 초점을 맞추는 데 사용되는 수탁마커를 인쇄할 수 있습니다.이미지 광학 구성을 복제하고 이름을 바꾸면 신탁 마커를 인쇄합니다. 이 단계에서 인쇄하기 때문에 빔 스플리터를 라이트 경로 밖으로 이동하고 적절한 이색 거울로 바꿉을 바꿉시다. 시간을 절약하기 위해 가장 작은 스캔 크기를 선택합니다.이 단계에서는 이미징이 필요하지 않으므로 검출기 감도를 0으로 설정합니다. 인쇄를 가능하게 하는 레이저 전력을 늘립니다. 스캔 영역 창에서 확대/축소를 최대로 설정하고 스캔 영역을 시야 중간에 배치합니다.이제 PVA 표면의 고르지 못한 현상을 설명하기 위해 Z 스택 실험을 설정합니다. Z 위치에서 상대적으로 이동을 설정합니다. 적절한 Z 장치를 선택합니다.그런 다음 이미지 광학 구성을 복제하고 이름을 바꾸면 자동 초점입니다. 가장 작은 스캔 크기를 선택하고 스캔 영역 창의 줌 계수를 줄여 뷰 필드가 신탁 마커보다 약간 더 큽니다. 이렇게 하면 커버슬립의 다른 작은 기능이 자동 초점 작업을 방해하지 않습니다.장치 메뉴에서 자동 초점 설정을 선택합니다. Z 스택 실험에서 스캔 두께를 설정합니다. 현미경은이 범위를 통해 스캔하고 신탁 마커를 사용하여 최고의 초점 평면을 찾을 것입니다.그런 다음 이미지 광학 구성을 복제하고 이름을 바꾸면 ROI로드합니다. 마스크가 이 광학 구성으로 촬영한 이미지에 로드되므로 ROI 마스크와 동일한 스캔 크기를 설정합니다. 우리는 해상도와 속도 사이의 최적의 균형을 달성하기 위해 2048 픽셀을 사용했다.이제 커버슬립을 패턴화하는 데 사용되는 광학 구성을 설정합니다. 인쇄 신탁 마커 광학 구성을 복제하고 마이크로 패턴의 이름을 바꿉니다. 확대/축소 계수를 하나로 설정합니다.PVA를 축하하는 자극 레이저 전력을 증가시다. 적절한 스캔 속도를 선택합니다. ND 자극 창에서 ND 자극 실험을 설정합니다.시간 일정에 몇 단계를 추가하고 각 단계를 자극시 설정합니다. 자극 영역과 지속 시간이 올바른지 확인합니다. 동일한 창에서 스테이지 이동 주 Z 함수를 각 단계 앞에 사용하도록 설정합니다.이것은 다시 Z 방향으로 의 편차를 설명합니다. 마지막으로, 패턴을 찾는 데 도움이 될 수 있는 커버 슬립에 표시되는 레이블을 만들기 위해 광학 구성을 설정합니다. 인쇄 수탁 마커를 복제하고 레이블 표면의 이름을 바꿉니다.레이저 전력을 크게 늘리고 줌을 하나로 설정합니다. PVA 코팅 커버슬립을 홀더에 옮기. 직립 현미경의 경우 PVA 표면이 아래로 향하도록 하십시오.커버슬립을 안정화하기 위해 모서리에 물을 추가합니다. 현미경 단계에 홀더를 마운트합니다. 목표를 낮추고 그 사이에 물을 추가합니다.현미경 소프트웨어에서 IR 레이저 셔터를 켜고 패터닝 전에 자동 정렬을 수행합니다. 이미지 광학 구성으로 전환합니다. 목표를 커버슬립에 가깝게 천천히 이동시키면서 시야를 스캔합니다.처음에는 이미지가 매우 어둡게 나타납니다. 이미지 밝기가 약간 증가할 때까지 목표를 커버슬립에 더 가깝게 이동합니다. 이것은 목표에 직면 하는 커버 슬립 표면.밝기가 감소하고 다시 증가할 때까지 목표를 계속 이동합니다. 이것은 우리가 패턴 것입니다 PVA 표면입니다. 커버슬립 결함이나 먼지와 같은 작은 기능에 초점을 맞추고 Z 드라이브에 0을 설정합니다.레이블 표면 광학 구성으로 전환합니다. 캡처를 클릭합니다. 이미징으로 돌아가서 스캔합니다.유리 손상은 라벨이 성공적으로 인쇄되었음을 보여줍니다. 유리 입자를 피하기 위해 스테이지를 1~2개의 뷰 필드로 이동합니다. 확인을 스캔합니다.장치 메뉴에서 스테이지 이동 매크로를 엽니다. 변수 M과 N을 패턴화할 원하는 뷰 필드 수로 설정합니다. 매크로를 저장하고 실행합니다.패터닝이 완료되면 이미지 광학 구성으로 전환하고 패턴을 스캔합니다. 각 시야의 패턴 섬은 명확한 테두리를 가지고 있고 빛을 고르게 반사해야합니다. 어둡고 고르지 않은 패턴은 불완전한 PVA 제거를 제안합니다.이것은 일반적으로 부족한 레이저 힘 또는 잘못된 초점 평면 때문입니다. 레이저 전력이 너무 높게 설정되면 PVA가 거품을 일으킬 수도 있습니다. 커버립에 세포를 도금 한 후, 세포는 확산패턴의 모양을 취해야 한다.이것은 석궁 패턴에 도금된 인간 섬유아세포의 면역형광 이미지입니다. 셀은 라멜리포디아의 액틴이 풍부한 림을 표시합니다. 양쪽을 따라 두껍고 복부 스트레스 섬유와 횡가로 연결된 등쪽 응력 섬유.미오신 라이트 체인은 조밀한 라멜리포디아 림 뒤에 앉아 액틴 번들을 따라 줄무늬 패턴을 보였다. 맞춤형 이미지 처리 도구를 사용하여 평균적인 관심 단백질 이미지를 생성했습니다. 이 이미지는 위에서 설명한 액틴 구조가 많은 수의 패턴에서 일관되다는 것을 보여줍니다.평균 화 후 미신의 개별 구조를 잃지만 액틴 번들을 따라 국소화가 보존됩니다. 이 비디오를 시청한 후 최소한의 수동 작업으로 상용 멀티포토른 시스템을 사용하여 마이크로 패터닝 워크플로우를 설정할 수 있어야 합니다. 불완전한 패턴을 생성하지 않도록 자신의 시스템에 대한 레이저 전력을 최적화하거나 PVA 최대 효율은 자동 초점 및 마이크로 패터닝 단계의 매개 변수를 조정하여 달성 될 수있다.세포 형태와 관련 된 세포 통로 조사 하는 것 외에도, 이 기술은 또한 약물 선별 및 세포 모양의 변이에 민감한 다른 응용 프로그램에 적용 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

연구

생체공학

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

광 반응성 고분자 나노 캐리어로부터의 siRNA 방출의 시공간 조절을 통한 유전자 침묵 예측

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

생물학적 응용 을 위한 근적외선 방출 금 나노클러스터의 합성

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

혈관 시각화를 위한 이중 래스터 스캐닝 광음향 소형 동물 이미지

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...