Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskudd RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund, og University of Toronto XSeed Program. C.T. ble støttet av NSERC USRA fellowship.

1. Forbehandling av deksler
<ol><li>Forbered knirkende rene deksler som beskrevet i Waterman-Storer, 199825.</li>
	<li>Forbered 1% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS) løsning og inkuber dekslene i løsningen i 10 min med mild agitasjon. Pass på at dekslene beveger seg fritt i løsningen.</li>
	<li>Vask dekslene to ganger med dH2O i 5 min hver.</li>
	<li>Forbered 0,5% glutaraldehyd (GA) løsning og inkuber dekslene i løsningen i 30 min på en shaker. For 25 deksler, bruk 50 ml g...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells.">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li><li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility.">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li><li>Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development.">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration:+Integrating+Signals+from+Front+to+Back.">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells.">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels.">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+Movements:+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts.">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+Processing:+Surface,+Micro-,+and+Nanoscale+Processing.">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li><li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions.">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers.">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li><li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli.">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li><li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth.">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li><li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., J&#246;nsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control.">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li><li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf.">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li><li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications:+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization.">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).</li><li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization:+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix.">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

Resultatene ovenfor viser at den beskrevne IR-laserassisterte mikropatterningsprotokollen (mikrofotopatterning) gir reproduserbare tilhengermønstre i ulike former som muliggjør manipulering av celleform og cytoskeletal arkitektur. Selv om mange mikropatterningsmetoder har blitt utviklet både før og etter debuten av mikrofotopatterning, har denne metoden flere fordeler. For det første krever det ikke spesialisert utstyr og renrom som vanligvis bare finnes i ingeniøravdelinger. Faktisk, etter hvert som multifotonmikr...

Celleform er en nøkkeldeterminant for grunnleggende biologiske prosesser som vevsmorfogenese1, cellemigrering2, celleproliferasjon3og genuttrykk4. Endringer i celleformen drives av en intrikat balanse mellom dynamiske omorganiseringer av cytoskjelettet som deformerer plasmamembranen og ekstrinsiske faktorer som eksterne krefter som utøves på cellen og geometrien til cellecelle- og cellematriseadhesjoner5. Migrerende mesenchymale celler, for eksempel, polymeriserer et tett aktinnettverk i forkant som skyver plasmamembranen fremover og skaper en bred lamellipodia6, mens actomyosin-kontraktilitet trekker tilbake cellens smale etterfølgende kant for å løsne cellen fra sin nåværende posisjon7,8. Forstyrrende signalhendelser som gir opphav til slike spesialiserte cytoskeletale strukturer, perturberer form og polaritet og bremser cellemigrasjon9. I tillegg krever epitelplatebøying under gastrulation actomyosin-basert apikal innsnevring som får celler og deres naboer til å bli kileformede10. Selv om disse studiene fremhever viktigheten av celleform, har den iboende heterogeniteten i celleformen beheftet med å identifisere mekanismer som forbinder morfologi for å fungere.
For dette formål har mange tilnærminger for å manipulere celleform blitt utviklet i løpet av de siste tre tiårene. Disse tilnærmingene oppnår sitt mål ved enten å begrense cellen med en tredimensjonal mugg eller kontrollere cellulær vedheftgeometri gjennom mønstret avsetning av ekstracellulære matriseproteiner (ECM) på en antifouling overflate, en teknikk kalt mikropatterning11. Her vil vi gjennomgå en rekke teknikker som har blitt populære gjennom årene.
Opprinnelig banebrytende som en tilnærming for mikroelektroniske applikasjoner, har myk litografibasert mikrokontaktutskrift utvetydig blitt en kultfavoritt12. En masterskive fremstilles først ved å selektivt eksponere områder av et fotoresistbelagt silisiumsubstrat til fotoirradiering, og etterlater seg en mønstret overflate13. En elastomer, for eksempel PDMS, helles deretter på hovedskiven for å generere et mykt "stempel" som overfører ECM-proteiner til ønsket substrat11,14. Når den er fabrikkert, kan en masterskive brukes til å kaste mange PDMS-frimerker som gir opphav til svært reproduserbare mikropatterner12. Mønstrene kan imidlertid ikke justeres lett på grunn av den lange fotolittografiprosessen. Denne prosessen krever også høyt spesialisert utstyr og renrom som vanligvis ikke er tilgjengelige i biologiavdelinger.
Mer nylig har direkte utskrift ved hjelp av dyp UV blitt rapportert å omgå begrensninger som tradisjonelle litografibaserte tilnærminger utgjør. Dypt UV-lys ledes gjennom en fotomaske til selektive områder av englassdekslerlip belagt med poly-L-lysin-podet -polyetylenglykol. Kjemiske grupper utsatt for dyp UV er fotokonvertert uten bruk av lysfølsomme linkers for å muliggjøre binding av ECM-proteiner15. Mangelen på lysfølsomme linkers gjør det mulig for mønstrede deksler å holde seg stabile ved romtemperatur i over syv måneder15. Denne metoden unngår bruk av renrom og fotolitografiutstyr og krever mindre spesialisert opplæring. Kravet til fotomasker utgjør imidlertid fortsatt et betydelig hinder for eksperimenter som krever lett tilgjengelige endringer i mønstre.
I tillegg til metoder som manipulerer cellegeometri gjennom kontrollert avsetning av ECM-proteiner på en 2D-overflate, søker andre å kontrollere celleform ved å begrense celler i 3D-mikrostrukturer. Mange studier har tilpasset den myke litografibaserte tilnærmingen beskrevet ovenfor for å generere 3D, i stedet for 2D, PDMS-kamre for å undersøke formavhengige biologiske prosesser i embryoer, bakterier, gjær og planter16,17,18,19. To-foton polymerisasjon (2PP) har også tatt ledelsen som en mikrofabrikasjonsteknikk som kan skape komplekse 3D hydrogel stillaser med nanometeroppløsning20. 2PP er avhengig av prinsippene for to-foton adsorpsjon, hvor to fotoner levert i femtosecond pulser absorberes samtidig av et molekyl - fotoinitiator i dette tilfellet - som muliggjør lokal polymerisering av fotopolymerer21. Denne teknikken har blitt tungt brukt til å skrive ut 3D stillaser som etterligner de innfødte ECM-strukturene i menneskelig vev og har vist seg å indusere lav fotokjemisk skade på celle22.
Debuten av mikrofotopattering for 10 år siden ga forskere muligheten til å fremstille mikropatterns samtidig som de unngår utilgjengelig og spesialisert utstyr. Mikrofotopatterning skaper mønstre på mikronskalaen ved å termisk fjerne selektive områder av poly-vinylalkohol (PVA) belagt på aktiverte glassflater ved hjelp av en infrarød laser23,24. ECM-proteiner som bare fester den underliggende glassoverflaten og ikke PVA, fungerer da som biokjemiske signaler for å muliggjøre kontrollert spredningsdynamikk og celleform. Denne metoden gir også overlegen fleksibilitet siden mønstre lett kan endres i sanntid. Her tilbyr vi en trinnvis protokoll for mikrofotopatterning ved å bruke et kommersielt flerfoton bildebehandlingssystem. Den beskrevne protokollen er designet for rask og automatisert fabrikasjon av store mønstre. Vi demonstrerte at disse mønstrene effektivt kontrollerer celleformen ved å begrense geometrien til celle-ECM-vedheft. Til slutt viser vi at den beskrevne mønsterteknikken modulerer organiseringen og dynamikken i aktincytoskjelettet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

Mikropatterning er en etablert teknikk i cellebiologisamfunnet som brukes til å studere sammenhenger mellom morfologi og funksjon av cellulære rom mens omgå komplikasjoner som oppstår fra naturlige celle-til-celle variasjoner. For å standardisere celleformen er cellene enten begrenset i 3D-former eller kontrollert for limgeometri gjennom klebende øyer. Imidlertid er tradisjonelle mikropatterningsteknikker basert på fotolitografi og dyp UV-etsning sterkt avhengig av rene rom eller spesialisert utstyr. Her presenterer vi en infrarød laserassistert mikropatteringsteknikk (mikrofotopatterning) modifisert fra Doyle et al. som enkelt kan settes opp med kommersielt tilgjengelige bildesystemer. I denne protokollen bruker vi et Nikon A1R MP+ bildebehandlingssystem for å generere mikropatterns med mikronpresisjon gjennom en infrarød (IR) laser som ablates forhåndsinnstilte regioner på poly-vinyl alkoholbelagte deksler. Vi bruker et tilpasset skript for å muliggjøre automatisert mønsterproduksjon med høy effektivitet og nøyaktighet i systemer som ikke er utstyrt med en maskinvare-autofokus. Vi viser at denne IR-laserassisterte mikropatterningsprotokollen (mikrofotopatterning) resulterer i definerte mønstre som celler utelukkende fester seg til og tar på seg ønsket form. Videre kan data fra et stort antall celler beregnes i gjennomsnitt på grunn av standardisering av celleform. Mønstre generert med denne protokollen, kombinert med høyoppløselig bildebehandling og kvantitativ analyse, kan brukes til relativt høye gjennomstrømningsskjermer for å identifisere molekylære spillere som formidler koblingen mellom form og funksjon.

Kvaliteten på de eksperimentelle dataene oppnådd gjennom mikropatterning er i stor grad avhengig av kvaliteten på mønstrene. For å bestemme kvaliteten på mønstre generert med metoden ovenfor, brukte vi først refleksmikroskopi for å vurdere formen og størrelsen på de ablerte områdene på omslagsslipet. Vi fant at hvert enkelt mønster så veldig likt ablasjonsmasken og viste klare boarders og en overflate som reflekterte lys jevnt (Figur 2B). En rekke former og størrelser kan skr...

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Protokollen som presenteres her muliggjør automatisert fabrikasjon av mikropatterner som standardiserer celleform for å studere cytoskeletale strukturer i pattedyrceller. Denne brukervennlige teknikken kan settes opp med kommersielt tilgjengelige bildesystemer og krever ikke spesialisert utstyr utilgjengelig for standard cellebiologiske laboratorier.

Kontroll av cellegeometri gjennom infrarød laserassistert mikropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Mikropatterning er en kraftig teknikk som brukes av forskere for å forstå sammenhenger mellom celleform og aktiviteten til intercellulære maskiner. Selv om flere teknikker tillater forskere å modulere celleform, krever disse teknikkene ofte spesialisert utstyr utilgjengelig for noen biologilaboratorier. Denne videoen vil lede deg gjennom trinnene som er nødvendige for å automatisere mikropattering på et kommersielt tilgjengelig flerfotonavbildningssystem.En fordel med denne protokollen er at den unngår bruk av spesialisert utstyr. Mønstre kan også enkelt endres uten å refabricating fotomasker, som vanligvis er den mest tidkrevende prosessen i mikropatterning. Bildebehandlingsverktøyet vårt genererer gjennomsnittlige cellebilder som gjenspeiler en representativ distribusjon av proteiner på en objektiv og automatisert måte.Selv om vi bruker coverlips i eksperimentene våre, lar den automatiserte arbeidsflyten deg også mønster på lysbilder og glassbunnsretter. Visuell demonstrasjon av denne metoden er viktig siden riktig mikroskopoppsett er avgjørende for at systemet skal kunne images, identifisere riktig fokusplan og mønster på en automatisert måte. Forbered PVA-oppløsningen som instruert.Legg til en del HCL i åtte deler PVA. Snu røret forsiktig et par ganger for å blande. Hell to milliliter av løsningen i en liten Petri-tallerken og senk en ren forbehandlet dekslerlip inn i væsken.Inkuber ved romtemperatur i fem minutter på en shaker. Fjern forsiktig dekslene fra løsningen. Bruk coverlip-spinneren til å spinne frakk i 40 sekunder.I mellomtiden rengjør pinsettene. Overfør dekslene til en boks og tørk ved fire grader over natten. Slå på mikroskopprogramvaren.Sett først laserlinjen til 750 nanometer. Sett deretter opp en ny optisk konfigurasjon kalt Image. Dette er den grunnleggende optiske konfigurasjonen som lar oss avbilde dekslene gjennom reflekser.La andre alternativer være standard, og velg riktig målsetting. Konfigurer maskinvareinnstillingene under denne optiske konfigurasjonen. Still inn den infrarøde laseren som vår stimuleringslaser.Plasser strålesplitteren i lysbanen for å bruke IR-laseren til avbildning. Velg Galvano-skannerenheten og den aktuelle D-skannedetektoren. Velg en skannestørrelse og oppholdstid som er tilstrekkelig til å fange opp små funksjoner på dekslene.Kontroller at det er merket av for Bruk IR-laser. Juster anskaffelseslaserens effekt og detektorfølsomhet for å oppnå et lyst, men ikke mettet bilde, av dekslene. I skanneområdevinduet setter du zoom til en for å fange opp hele synsfeltet.Lagre den optiske konfigurasjonen. Nå setter vi opp en rekke optiske konfigurasjoner som lar mikroskopet fokusere, laste inn ROI-masken og generere mønstre på en automatisert måte. Den første optiske konfigurasjonen lar oss skrive ut en fiduciary markør som brukes til å fokusere automatisk på det nåværende synsfeltet.Dupliser den optiske konfigurasjonen av bildet og gi det nytt navn, Skriv ut fiduciary-markør. Siden vi skriver ut i dette trinnet, flytter du strålesplitteren ut av lysbanen og erstatter den med et passende dikroisk speil. Velg den minste skannestørrelsen for å spare tid.Siden det ikke er nødvendig med bildebehandling i dette trinnet, setter du detektorfølsomheten til null. Øk laserkraften for å aktivere utskrift. I skanneområdevinduet setter du zoom til maksimum og plasserer skanneområdet midt i synsfeltet.Nå skal vi sette opp et Z-stack-eksperiment for å ta høyde for ujevnheter i PVA-overflaten. Sett bevegelsen i Z-posisjonen til relativ. Velg riktig Z-enhet.Deretter dupliserer du den optiske konfigurasjonen av bildet og gir det nytt navn, Autofokus. Velg den minste skannestørrelsen, og reduser zoomfaktoren i skanneområdevinduet slik at synsfeltet er litt større enn fiduciary-markøren. Dette sikrer at andre små funksjoner på dekslene ikke forstyrrer autofokusering.Velg Automatisk fokusoppsett på Enheter-menyen. Sett skannetykkelsen til det i Z-stack-eksperimentet. Mikroskopet vil skanne gjennom dette området og finne det beste fokusplanet ved hjelp av fiduciary markøren.Deretter dupliserer du den optiske bildekonfigurasjonen og gir den nytt navn, Last inn avkastning. Angi skannestørrelsen som er identisk med roi-maskens, fordi masken skal lastes inn i et bilde som er tatt med denne optiske konfigurasjonen. Vi brukte 2048 piksler for å oppnå en optimal balanse mellom oppløsning og hastighet.Nå skal vi sette opp den optiske konfigurasjonen som brukes til å mønstre dekslene. Dupliser den optiske konfigurasjonen for utskriftsfiduciary-markøren og gi den nytt navn, Micropattern. Sett zoomfaktoren til en.Øk stimuleringslaserkraften for å fyre opp PVA. Velg riktig skannehastighet. I ND-stimuleringsvinduet setter du opp et ND-stimuleringseksperiment.Legg til noen faser i tidsplanen og sett hver ved stimulering. Sørg for at stimuleringsområdet og varigheten er riktig. I samme vindu aktiverer du trinnflyttings hoved-Z-funksjonen før hver fase.Dette står igjen for eventuelle avvik i Z-retningen. Til slutt setter du opp en optisk konfigurasjon for å lage en synlig etikett på dekslene som kan hjelpe oss med å finne mønstrene. Dupliser fiduciary-merket for utskrift og gi den nytt navn, Etikettoverflate.Øk laserkraften betraktelig og sett zoom til en. Overfør den PVA-belagte dekslen på en holder. For et oppreist mikroskop, sørg for at PVA-overflaten vender ned.Tilsett vann i hjørnene for å stabilisere dekslene. Monter holderen på mikroskopstadiet. Senk målet og tilsett vann i mellom.I mikroskopprogramvaren slår du på IR-laserlukkeren og utfører automatisk justering før du mønstrer. Bytt til den optiske konfigurasjonen av bildet. Skann synsfeltet mens du sakte flytter målet nærmere dekslene.Først vil bildet virke ekstremt svakt. Flytt målet nærmere dekslene til lysstyrken i bildet øker litt. Dette er dekslene som står overfor målet.Fortsett å flytte målsettingen til lysstyrken minker og øker igjen. Dette er PVA-overflaten som vi vil mønstre. Fokuser på en hvilken som helst liten funksjon, for eksempel coverlip ufullkommenheter eller støv, og sett null på Z-stasjonen.Bytt til den optiske konfigurasjonen av etikettoverflaten. Klikk på Capture. Gå tilbake til bildebehandling og skanning.Glassskader viser at etiketten er skrevet ut. Flytt scenen med ett til to synsfelt for å unngå glasspartikler. Skann for å bekrefte.Åpne trinnbevegelsesmakroen på enheter-menyen. Sett variablene M og N til ønsket antall synsfelt som skal mønstres. Lagre og kjør makroen.Når mønsteret er fullført, bytter du til den optiske bildekonfigurasjonen og skanner gjennom mønstrene. Mønsterøyer i hvert synsfelt bør ha klare grenser og reflektere lyset jevnt. Mønstre som ser mørkere og ujevne ut, antyder ufullstendig PVA-fjerning.Dette skyldes vanligvis utilstrekkelig lasereffekt eller feil fokusplan. Hvis laserstrømmen er satt for høyt, kan det også føre til at PVA bobler. Etter plating celler på coverlips, celler bør spre seg og ta på seg formen av mønsteret.Dette er et immunfluorescence bilde av en menneskelig fibroblast belagt på et armbrøst mønster. Cellen viser en aktinrik kant av lamellipodia. Tykke, ventrale stressfibre langs de to sidene og dorsale stressfibre forbundet med tverrgående buer.Myosin lyskjede satt bak den tette lamellipodia-kanten og viste et strikket mønster langs aktinbunter. Ved hjelp av vårt tilpassede bildebehandlingsverktøy genererte vi et gjennomsnittlig bilde av våre proteiner av interesse. Dette bildet viser at aktinstrukturene beskrevet ovenfor er konsekvente på tvers av et stort antall mønstre.Selv om vi mister individuelle strukturer av myosin etter gjennomsnittet, er det lokalisering langs aktinbunter er bevart. Etter å ha sett denne videoen, bør du kunne sette opp en mikromønsterarbeidsflyt ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig flerfotonsystem med minimalt manuelt arbeid. Det er viktig å optimalisere laserkraften for ditt eget system for å unngå å generere ufullstendige mønstre, eller PVA Maksimal effektivitet kan oppnås ved å justere parametrene i autofokuserings- og mikropatteringstrinn.I tillegg til å undersøke cellulære veier som involverer cellemorfologi, kan denne teknikken også brukes på narkotikascreening og andre applikasjoner som er følsomme for variasjoner i celleform.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generasjon av alliansefrie Funksjonell Myocardial Tissue Gjennom Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selektiv Cell Elimination fra Mixed 3D Kultur Ved hjelp av en nær-infrarødt Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Hele kroppen massespektrometri Imaging av Infrared Matrix-assistert Laser desorpsjon electrospray ionisering (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og montering av 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Forutsi gensletting gjennom spatiotemporal kontroll av siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Første 3D celle klynge kontroll i en Hybrid Gel kube enhet for repeterbare mønster formasjoner

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Mønstre geometrien av menneskelige embryonale Stamcelle kolonier på kompatible underlag for å kontrollere vevs nivået mekanikk

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Syntese av nær-infrarød emitting gull nanoklynger for biologiske applikasjoner

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Reduksjon av blodbårne celletilbehør til metallimplantater gjennom CD47-avledet peptidimmobilisering

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Dual Raster-Skanning Fotoakustisk Små-Animal Imager for vaskulær visualisering

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...