Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (bolsas RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program. C.T. foi apoiado pela bolsa NSERC USRA.

1. Pré-processamento de clipes de cobertura
<ol><li>Prepare tampas limpas como descrito em Waterman-Storer, 199825.</li>
	<li>Prepare 1% (3-aminopropil)trimethoxysilane (APTMS) solução e incubar as tampas na solução por 10 minutos com agitação suave. Certifique-se de que as tampas se movam livremente na solução.</li>
	<li>Lavar tampas duas vezes com dH2O por 5 min cada.</li>
	<li>Prepare a solução de glutaraldeído (GA) de 0,5% e incubar as tampas na solução por 30 min em...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. 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D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

Os resultados acima demonstram que o protocolo de micropatterse assistida por laser IR (microfotopatterning) fornece padrões aderentes reprodutíveis de várias formas que permitem a manipulação da forma celular e da arquitetura citoesquelletal. Embora inúmeros métodos de micropatterning tenham sido desenvolvidos antes e depois da estreia da microfotopatterning, este método possui várias vantagens. Em primeiro lugar, não requer equipamentos especializados e salas de limpeza que geralmente são encontradas apenas ...

A forma celular é um determinante fundamental de processos biológicos fundamentais, como morfogênesetecidual 1,migração celular2,proliferação celular3e expressão genética4. As mudanças na forma celular são impulsionadas por um intrincado equilíbrio entre rearranjos dinâmicos do citoesqueleto que deforma a membrana plasmática e fatores extrínsecos, como forças externas exercidas sobre a célula e a geometria das aderências celular-célula e matriz celular5. Migrando células mesenquimais, por exemplo, polimeriza uma densa rede de actina na borda principal que empurra a membrana plasmática para a frente e cria uma lamellipodialarga 6, enquanto a contratilidade da actomyosina retrai a estreita borda de arrasto da célula para desprender a célula de sua posição atual7,8. Eventos de sinalização disruptor que dão origem a tais estruturas citoesqueletal especializadas perturbam a forma e a polaridade e retardam a migração celular9. Além disso, a dobra da folha epitelial durante a gastrição requer constrição apical baseada em atomyosina que faz com que as células e seus vizinhos se tornem em forma de cunha10. Embora esses estudos destaquem a importância da forma celular, a heterogeneidade inerente na forma celular tem sobrecarregado os esforços para identificar mecanismos que conectam a morfologia ao funcionamento.
Para isso, inúmeras abordagens para manipular a forma celular foram desenvolvidas nas últimas três décadas. Essas abordagens atingem seu objetivo, restringindo a célula com um molde tridimensional ou controlando a geometria de adesão celular através da deposição padronizada de proteínas de matriz extracelular (ECM) em uma superfície anti-envelhecimento, uma técnica chamada micropatterning11. Aqui vamos rever uma série de técnicas que ganharam popularidade ao longo dos anos.
Originalmente pioneira como uma abordagem para aplicações microeletrônicas, a impressão de microcontatos baseada em litografia macia tornou-se inequivocamente uma12favorita do culto . Um wafer mestre é fabricado pela primeira vez expondo seletivamente áreas de um substrato de silício revestido de fotoresistista à fotoirradição, deixando para trás uma superfície padronizada13. Um elastômero, como o PDMS, é então derramado no wafer mestre para gerar um "carimbo" macio que transfere proteínas ECM para um substrato desejado11,14. Uma vez fabricado, um wafer mestre pode ser usado para lançar muitos selos PDMS que dão origem a micropatters altamente reprodutíveis12. No entanto, os padrões não podem ser facilmente ajustados devido ao longo processo de fotolitografia. Esse processo também requer equipamentos altamente especializados e salas de limpeza que não estão tipicamente disponíveis nos departamentos de Biologia.
Mais recentemente, a impressão direta usando UV profundo tem sido relatada para contornar limitações impostas por abordagens tradicionais baseadas em litografia. A luz UV profunda é direcionada através de uma máscara fotográfica para áreas seletivas de um deslizamento de vidro revestido com poli-L-lisina-enxerto-polietileno glicol. Grupos químicos expostos a UV profundo são fotoconvertidos sem o uso de linkers fotosensíveis para permitir a vinculação de proteínas ECM15. A falta de linkers fotosensíveis permite que as tampas padronizadas permaneçam estáveis à temperatura ambiente por mais de setemeses 15. Este método evita o uso de salas de limpeza e equipamentos fotolitografia e requer treinamento menos especializado. No entanto, a exigência de fotomasks ainda representa um obstáculo substancial para experimentos que requerem mudanças prontamente disponíveis nos padrões.
Além de métodos que manipulam a geometria celular através da deposição controlada de proteínas ECM em uma superfície 2D, outros buscam controlar a forma celular confinando células em microestruturas 3D. Muitos estudos adaptaram a abordagem à base de litografia macia descrita acima para gerar câmaras PDM 3D, em vez de 2D, para investigar processos biológicos dependentes da forma em embriões, bactérias, leveduras e plantas16,17,18,19. A polimerização de dois fótons (2PP) também assumiu a liderança como uma técnica de microfabização que pode criar andaimes complexos de hidrogel 3D com resolução de nanômetros20. O 2PP baseia-se nos princípios da adsorção de dois fótons, onde dois fótons entregues em pulsos femtosegundos são absorvidos simultaneamente por uma molécula - fotoinitidora neste caso - que permite a polimerização local dos fotopolímeros21. Esta técnica tem sido fortemente empregada para imprimir andaimes 3D que imitam as estruturas nativas de ECM do tecido humano e tem sido mostrado para induzir baixo dano fotoquímico às células22.
A estreia da microfotopattering há 10 anos deu aos pesquisadores a oportunidade de fabricar micropatterns, evitando equipamentos inacessíveis e especializados. A microfotopattering cria padrões na escala de mícrons removendo termicamente regiões seletivas de álcool poli-vinil (PVA) revestidos em superfícies de vidro ativadas usando um laser infravermelho23,24. As proteínas ECM que anexam apenas a superfície de vidro subjacente e não o PVA servem como pistas bioquímicas para permitir a dinâmica de propagação controlada e a forma celular. Este método também oferece flexibilidade superior, uma vez que os padrões podem ser facilmente alterados em tempo real. Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo de microfotopatterning usando um sistema comercial de imagem multifótons. O protocolo descrito foi projetado para fabricação rápida e automatizada de grandes padrões. Demonstramos que esses padrões controlam eficientemente a forma celular, restringindo a geometria das aderências célula-ECM. Por fim, demonstramos que a técnica de padronização descrita modula a organização e a dinâmica do citoesqueleto actin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

O micropatterning é uma técnica estabelecida na comunidade de biologia celular usada para estudar conexões entre a morfologia e a função dos compartimentos celulares, contornando complicações decorrentes de variações naturais célula-célula. Para padronizar a forma celular, as células são confinadas em moldes 3D ou controladas para geometria adesiva através de ilhas adesivas. No entanto, técnicas tradicionais de micropattering baseadas na fotolitografia e gravura UV profunda dependem fortemente de salas limpas ou equipamentos especializados. Aqui apresentamos uma técnica de micropatterning assistida por laser infravermelho (microfotopatterning) modificada a partir de Doyle et al. que pode ser convenientemente configurada com sistemas de imagem disponíveis comercialmente. Neste protocolo, usamos um sistema de imagem Nikon A1R MP+ para gerar micropatterns com precisão de mícula através de um laser infravermelho (IR) que abla regiões predefinidas em tampas revestidas de álcool poli-vinil. Empregamos um script personalizado para permitir a fabricação automatizada de padrões com alta eficiência e precisão em sistemas não equipados com um foco automático de hardware. Mostramos que este protocolo de micropatterning assistido a laser IR (microfotopatterning) resulta em padrões definidos aos quais as células se conectam exclusivamente e assumem a forma desejada. Além disso, dados de um grande número de células podem ser mediados devido à padronização da forma celular. Padrões gerados com este protocolo, combinados com imagens de alta resolução e análise quantitativa, podem ser usados para telas de rendimento relativamente altas para identificar jogadores moleculares mediando a ligação entre forma e função.

A qualidade dos dados experimentais obtidos através da micropattersão depende em grande parte da qualidade dos padrões. Para determinar a qualidade dos padrões gerados com o método acima, primeiro usamos microscopia de reflectância para avaliar a forma e o tamanho das áreas abladas da foto do deslizamento de tampas. Descobrimos que cada padrão individual era muito semelhante à máscara de ablação e exibia pensionistas claros e uma superfície que refletia a luz uniformemente(Figura 2B</str...

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Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

O protocolo aqui apresentado permite a fabricação automatizada de micropatterns que padronizam a forma celular para estudar estruturas citoesquelletais dentro de células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar pode ser configurada com sistemas de imagem disponíveis comercialmente e não requer equipamentos especializados inacessíveis aos laboratórios de biologia celular padrão.

Controle da Geometria Celular através de Micropatterning Assistido por Laser Infravermelho

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Micropatterning é uma técnica poderosa empregada pelos cientistas para entender as conexões entre a forma celular e a atividade de máquinas intercelulares. Embora várias técnicas permitam aos pesquisadores modular a forma celular, essas técnicas muitas vezes requerem equipamentos especializados inacessíveis para alguns laboratórios de biologia. Este vídeo irá guiá-lo através das etapas necessárias para automatizar a micropatterning em um sistema de imagem multifon disponível comercialmente.Uma vantagem deste protocolo é que evita o uso de equipamentos especializados. Os padrões também podem ser facilmente alterados sem reabastecer as máscaras fotográficas, que é tipicamente o processo mais demorado no micropatterning. Nossa ferramenta de processamento de imagens gera imagens celulares médias que refletem uma distribuição representativa de proteínas de forma imparcial e automatizada.Embora usemos tampas em nossos experimentos, o fluxo de trabalho automatizado também permite que você padrone em slides e pratos de fundo de vidro. A demonstração visual deste método é importante, uma vez que a configuração adequada do microscópio é fundamental para que o sistema visualize, identifique o plano focal correto e o padrão de forma automatizada. Prepare a solução PVA conforme instruído.Adicione uma parte HCL a oito partes PVA. Inverta o tubo cuidadosamente algumas vezes para misturar. Despeje dois mililitros da solução em uma pequena placa de Petri e submerse uma tampa pré-processada limpa no líquido.Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos em um shaker. Remova cuidadosamente a tampa da solução. Use o girador de tampas para girar o casaco por 40 segundos.Enquanto isso, limpe a pinça. Transfira o deslizamento para uma caixa e seque a quatro graus durante a noite. Ligue o software do microscópio.Primeiro, coloque a linha laser em 750 nanômetros. Em seguida, configure uma nova configuração óptica chamada Imagem. Esta é a configuração óptica de linha de base que nos permite imaginar o deslizamento de cobertura através de refletidos.Deixe outras opções como padrão e selecione o objetivo apropriado. Configure as configurações de hardware sob esta configuração óptica. Coloque o laser infravermelho como nosso laser de estimulação.Coloque o divisor de feixe no caminho da luz para usar o laser IR para imagens. Selecione a unidade de scanner Galvano e o detector de varredura D apropriado. Selecione um tamanho de varredura e tempo de moradia suficientes para capturar pequenos recursos no deslizamento de cobertura.Certifique-se de que a caixa laser Use IR está verificada. Ajuste a potência do laser de aquisição e a sensibilidade do detector para obter uma imagem brilhante, mas não saturada, da superfície do deslizamento de tampas. Na janela da área de varredura, defina zoom para um para capturar todo o campo de visão.Salve a configuração óptica. Agora vamos configurar uma série de configurações ópticas que permitirão que o microscópio se concentre, carregue a máscara roi e gere padrões de forma automatizada. A primeira configuração óptica nos permite imprimir um marcador fiduciário usado para focar automaticamente no campo de visão atual.Duplicar a configuração óptica da imagem e renomeá-la, imprimir marcador fiduciário. Uma vez que estamos imprimindo nesta etapa, mova o divisor de feixe para fora do caminho da luz e substitua-o por um espelho dicroico apropriado. Selecione o menor tamanho de varredura para economizar tempo.Uma vez que nenhuma imagem é necessária nesta etapa, ajuste a sensibilidade do detector a zero. Aumente a potência do laser para permitir a impressão. Na janela da área de varredura, defina o zoom ao máximo e coloque a área de varredura no meio do campo de visão.Agora vamos configurar um experimento z-stack para explicar qualquer irregularidade na superfície PVA. Defina o movimento na posição Z para relativo. Selecione o dispositivo Z apropriado.Em seguida, duplicar a configuração óptica da imagem e renomeá-la, foco automático. Selecione o menor tamanho de varredura e diminua o fator de zoom na janela da área de varredura para que o campo de visão seja ligeiramente maior que o marcador fiduciário. Isso garante que outras pequenas características no deslizamento de cobertura não interfiram com o foco automático.No menu Dispositivos, selecione configuração Foco automático. Coloque a espessura do scan nisso no experimento da pilha Z. O microscópio irá escanear através deste intervalo e encontrar o melhor plano focal usando o marcador fiduciário.Em seguida, duplicar a configuração óptica da imagem e renomeá-la, carregar ROI. Defina o tamanho da varredura idêntico ao da máscara roi porque a máscara será carregada em uma imagem tirada com esta configuração óptica. Usamos 2048 pixels para alcançar um equilíbrio ideal entre resolução e velocidade.Agora vamos configurar a configuração óptica usada para padronizar o deslizamento de tampas. Duplique a configuração óptica do marcador fiduciário de impressão e renomeie-a, Micropattern. Defina o fator zoom para um.Aumente a potência do laser de estimulação para ablatar PVA. Selecione uma velocidade de varredura apropriada. Na janela de estimulação ND, configure um experimento de estimulação ND.Adicione algumas fases ao cronograma e defina cada uma em estimulação. Certifique-se de que a área de estimulação e a duração estão corretas. Na mesma janela, habilite a função Z principal de movimento de palco antes de cada fase.Isso explica novamente quaisquer desvios na direção Z. Finalmente, configure uma configuração óptica para fazer um rótulo visível no deslizamento de tampas que pode nos ajudar a localizar os padrões. Duplicar o marcador fiduciário de impressão duplicada e renomeá-lo, rotular superfície.Aumente significativamente a potência do laser e defina zoom para um. Transfira o deslizamento revestido de PVA para um suporte. Para um microscópio vertical, certifique-se de que a superfície do PVA de frente para baixo.Adicione água aos cantos para estabilizar o deslizamento de tampas. Monte o suporte no estágio do microscópio. Abaixe o objetivo e adicione água no meio.No software do microscópio, ligue o obturador a laser IR e realize o alinhamento automático antes da padronização. Mude para a configuração óptica da imagem. Escaneie o campo de visão enquanto move lentamente o objetivo mais perto da tampa.No início, a imagem aparecerá extremamente fraca. Mova o objetivo mais perto da mancha até que o brilho da imagem aumente ligeiramente. Esta é a superfície de deslizamento que está voltada para o objetivo.Continue a mover o objetivo até que o brilho diminua e aumente novamente. Esta é a superfície PVA que vamos padronizar. Concentre-se em qualquer pequeno recurso, como imperfeições de deslizamento de tampas ou poeira, e defina zero na unidade Z.Mude para a configuração óptica de superfície da etiqueta. Clique em Capture. Volte para a imagem e escaneie.Danos no vidro mostram que a etiqueta foi impressa com sucesso. Mova o palco por um a dois campos de visão para evitar partículas de vidro. Procure para confirmar.No menu dispositivos, abra a macro de movimento do palco. Defina as variáveis M e N ao número desejado de versões que serão padronizadas. Salve e execute a macro.Após a padronização ser concluída, mude para a configuração óptica da imagem e escaneie através dos padrões. Ilhas padrão em cada campo de visão devem ter fronteiras claras e refletir a luz uniformemente. Padrões que parecem mais escuros e irregulares sugerem remoção incompleta de PVA.Isso é geralmente devido à potência laser insuficiente ou plano focal incorreto. Se a potência do laser for muito alta, também pode fazer com que o PVA borbulhe. Após o revestimento de células em deslizamentos, as células devem se espalhar e assumir a forma do padrão.Esta é uma imagem de imunofluorescência de um fibroblasto humano banhado em um padrão de besta. A célula exibe uma borda rica em actina de lamellipodia. Fibras de estresse ventral grossas ao longo dos dois lados e fibras de estresse dorsal conectadas por arcos transversais.A corrente de luz de miosina sentou-se atrás da densa borda lamellipodia e exibiu um padrão estriado ao longo de feixes de actina. Usando nossa ferramenta personalizada de processamento de imagens, geramos uma imagem média de nossas proteínas de interesse. Esta imagem mostra que as estruturas de actina descritas acima são consistentes em um grande número de padrões.Embora percamos estruturas individuais de minosina após a média, é a localização ao longo de pacotes de actina é conservada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de configurar um fluxo de trabalho de micro padronização usando um sistema multifotônio comercialmente disponível com trabalho manual mínimo. É importante otimizar a potência laser para o seu próprio sistema para evitar a geração de padrões incompletos ou pva a máxima eficiência pode ser alcançada ajustando os parâmetros em etapas de foco automático e micropattering.Além de investigar vias celulares envolvendo morfologia celular, essa técnica também pode ser aplicada ao rastreamento de medicamentos e outras aplicações sensíveis às variações na forma celular.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Bioengenharia

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos

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Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

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