Name: control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

Bu çalışma, Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (RGPIN-2015-05114 ve RGPIN-2020-05881), Manchester Üniversitesi ve Toronto Üniversitesi Ortak Araştırma Fonu ve Toronto Üniversitesi XSeed Programı tarafından desteklenmiştir. C.T. NSERC USRA bursu ile desteklendi.

1. Kapaklı ön işleme
<ol><li>Waterman-Storer, 199825'teaçıklandığı gibi gıcırtılı temiz kapaklar hazırlayın.</li>
	<li>% 1 (3-aminopropil)trimetoksisilane (APTMS) çözeltisi hazırlayın ve çözeltideki kapakları hafif ajitasyonla 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kapakların çözeltide serbestçe hareket etmesinden emin olun.</li>
	<li>Kapak örtülerini her biri 5 dakika boyunca dH2O ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>% 0,5 glutaraldehit (GA) çözeltisi hazırlayın v...

<ol>
	<li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila.">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li><li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells.">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li><li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility.">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li><li>Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development.">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration:+Integrating+Signals+from+Front+to+Back.">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells.">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels.">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+Movements:+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts.">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry.">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+Processing:+Surface,+Micro-,+and+Nanoscale+Processing.">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li><li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions.">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers.">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li><li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli.">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li><li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth.">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li><li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., J&#246;nsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control.">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li><li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf.">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li><li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications:+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization.">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).</li><li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization:+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix.">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning.">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/Organelle+Motility+Assays.">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li><li>Inou&#233;, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).</li><li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion.">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+(&#181;P-hPST)+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening.">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (&#181;P-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).</li><li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment.">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).</li></ol>

Yukarıdaki sonuçlar, tanımlanan IR lazer destekli mikropatterning (mikrofotofopatterning) protokolünün, hücre şeklinin ve sitoskeletal mimarinin manipülasyonu sağlayan çeşitli şekillerde tekrarlanabilir yapışık desenler sağladığını göstermektedir. Mikrofotoğrafçılığın hem öncesinde hem de sonrasında çok sayıda mikropatterning yöntemi geliştirilmiş olsa da, bu yöntem çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, genellikle sadece Mühendislik bölümlerinde bulunan özel ekipman ve temiz ...

Hücre şekli doku morfogenez1,hücre göçü2,hücre çoğalması3ve gen ekspresyasyonu4gibi temel biyolojik süreçlerin önemli bir belirleyicisidir. Hücre şeklindeki değişiklikler, plazma zarını deforme eden sitoskeletonun dinamik yeniden düzenlenmesi ile hücreye uygulanan dış kuvvetler ve hücre-hücre ve hücre matrisi yapışıklıklarının geometrisi gibi dış etkenler arasındaki karmaşık bir denge tarafından yönlendirilir5. Örneğin, mezenkimal hücrelerin geçirilmesi, plazma zarını ileri iten ve geniş bir lamellipodia6oluşturan öncü kenarda yoğun bir aksin ağını polimerize eder, aktomiyosin kontraktilitesi hücreyi mevcut konumundan ayırmak için hücrenin dar sondaki kenarını geri alır7,8. Bu tür özel sitoskeletal yapılara yol açan sinyalizasyon olaylarını bozmak şekil ve polariteyi perturbs ve hücre göçunu yavaşlatır9. Ek olarak, gastrülasyon sırasında epitel tabaka bükme, hücrelerin ve komşularının kama şeklinde olmasına neden olan aktomiyosin bazlı apikal daralma gerektirir10. Bu çalışmalar hücre şeklinin önemini vurgulasa da, hücre şeklindeki doğal heterojenlik, morfolojiyi işleve bağlayan mekanizmaları belirleme çabalarını sonafettir.
Bu amaçla, son otuz yılda hücre şeklini manipüle etmek için çok sayıda yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, hücreyi üç boyutlu bir kalıpla kısıtlayarak veya hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin birtifasyon yüzeyine desenli birikmesi yoluyla hücresel yapışma geometrisini kontrol ederek amaçlarına ulaşır, mikropatterning11olarak adlandırılan bir teknik. Burada, yıllar boyunca popülerlik kazanan bir dizi tekniği gözden geçireceğiz.
Başlangıçta mikroelektronik uygulamalar için bir yaklaşım olarak öncü olan yumuşak litografi tabanlı mikrokontact baskı, kesin olarak kült bir favori haline gelmiştir12. Bir ana gofret ilk olarak fotoresist kaplı silikon substratın alanlarını fotoirradiasyona seçici olarak maruz bırakarak, desenli bir yüzey bırakarak imal edilir13. PDMS gibi bir elastomer, ECM proteinlerini istenen bir substrat11,14'eaktaran yumuşak bir "damga" oluşturmak için ana gofrete dökülür. Üretildikten sonra, yüksek oranda tekrarlanabilir mikropatterns12'yeyol açan birçok PDMS damgası dökmek için bir ana gofret kullanılabilir. Ancak uzun fotolitografi süreci nedeniyle desenler kolayca ayarlanamamaktadır. Bu işlem ayrıca biyoloji bölümlerinde tipik olarak bulunmayan son derece özel ekipman ve temiz odalar gerektirir.
Daha yakın zamanda, derin UV kullanarak doğrudan baskının geleneksel litografi tabanlı yaklaşımların getirdiği sınırlamaları atlattıği bildirilmiştir. Derin UV ışığı, bir fotomask aracılığıyla poli-L-lizinaşılı-polietilen glikol ile kaplanmış bir cam örtünün seçici alanlarına yönlendirilir. Derin UV'ye maruz kalan kimyasal gruplar, ECM proteinlerinin bağlanmasını sağlamak için ışığa duyarlı bağlayıcılar kullanılmadan fotokonverte edilir15. Işığa duyarlı bağlayıcıların olmaması, desenli kapak altlıkların yedi aydan fazla oda sıcaklığında sabit kalmasını sağlar15. Bu yöntem temiz odaların ve fotolithografi ekipmanlarının kullanılmasını önler ve daha az özel eğitim gerektirir. Bununla birlikte, foto maskeler gereksinimi, desenlerde kolayca kullanılabilir değişiklikler gerektiren deneyler için hala önemli bir engel teşkil etmektedir.
ECM proteinlerinin 2B yüzeyde kontrollü birikmesi yoluyla hücre geometrisini manipüle eden yöntemlere ek olarak, diğerleri hücreleri 3D mikroyapılara hapsederek hücre şeklini kontrol etmeye çalışır. Birçok çalışma, yukarıda açıklanan yumuşak litografi tabanlı yaklaşımı embriyolarda, bakterilerde, mayalarda ve bitkilerde şekle bağlı biyolojik süreçleri araştırmak için 2D, PDMS odaları yerine 3D üretmek için uyarlamıştır16,17,18,19. İki fotonlu polimerizasyon (2PP), nanometre çözünürlüğü20olan karmaşık 3D hidrojel iskeleler oluşturabilen bir mikrofabrikasyon tekniği olarak da öne geçti. 2PP, femtosaniye darbelerde verilen iki fotonun aynı anda bir molekül tarafından emildiği iki foton adsorpsiyon ilkelerine dayanır - bu durumda fotokilatör - fotopolimerlerin yerel polimerizasyonunu sağlayan21. Bu teknik, insan dokusunun yerel ECM yapılarını taklit eden 3D iskeleleri yazdırmak için yoğun olarak almıştır ve hücrelere düşük fotokimyasal hasar verdiği gösterilmiştir22.
10 yıl önce mikrofotoğrafçılığın piyasaya çıkışı, araştırmacılara erişilemeyen ve özel ekipmanlardan kaçınırken mikropatternler uydurma fırsatı verdi. Mikrofotopatterning, kızılötesi lazer23,24kullanarak aktif cam yüzeylere kaplanmış poli-vinil alkolün (PVA) seçici bölgelerini termal olarak kaldırarak mikron ölçeğinde desenler oluşturur. PVA'yı değil, sadece alttaki cam yüzeyi bağlayan ECM proteinleri, kontrollü yayılma dinamiklerini ve hücre şeklini etkinleştirmek için biyokimyasal ipuçları olarak hizmet eder. Desenler gerçek zamanlı olarak kolayca değiştirilebildiğinden, bu yöntem aynı zamanda üstün esneklik sunar. Burada, ticari bir çoklu foton görüntüleme sistemi kullanarak mikrofotoğrafterning'in adım adım protokolünü sağlıyoruz. Açıklanan protokol, büyük desenlerin hızlı ve otomatik bir şekilde imal edilmesi için tasarlanmıştır. Hücre-ECM yapışıklıklarının geometrisini kısıtlayarak bu desenlerin hücre şeklini verimli bir şekilde kontrol ettiğini gösterdik. Son olarak, açıklanan desenleme tekniğinin aktin sitoskeletonunun organizasyonuna ve dinamiklerine göre modüle ettiğini gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Apo LWD Water Dipping Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm Cell Culture Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-586</td>
			<td>Polysterene, TC treated, vented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>62248</td>
			<td>1mg/mL dihydrochloride solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serine Albumin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ALB005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FC010</td>
			<td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>610077</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12380</td>
			<td>568nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td>22 &#215; 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td>25% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>6025-1-29</td>
			<td>37% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium &#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4408S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Photon Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R MP+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3672S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Version 5.21.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7525-1-29</td>
			<td>70% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Version 21.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alchohol)</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td>MW 89000-98000, 98% hydrolyzed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Secondary Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4412S</td>
			<td>Goat, 488nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-876</td>
			<td>Alsoknown as analog rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td>4.1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td>0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

control of cell geometry through infrared laser assisted micropatterning

Mikropatterning, hücre biyolojisi topluluğunda, hücresel hücreden hücreye varyasyonlardan kaynaklanan komplikasyonları atlatırken hücresel bölmelerin morfolojisi ve işlevi arasındaki bağlantıları incelemek için kullanılan yerleşik bir tekniktir. Hücre şeklini standartlaştırmak için hücreler ya 3D kalıplara hapsedilir ya da yapışkan adalar aracılığıyla yapışkan geometri için kontrol edilir. Bununla birlikte, fotolithografiye ve derin UV gravürlerine dayanan geleneksel mikropatterning teknikleri büyük ölçüde temiz odalara veya özel ekipmanlara bağlıdır. Burada, piyasada bulunan görüntüleme sistemleriyle kolayca kurulabilen Doyle ve ark. Bu protokolde, poli-vinil alkol kaplı kapaklar üzerinde önceden ayarlanmış bölgeleri ablates bir kızılötesi (IR) lazer aracılığıyla mikron hassasiyeti ile mikropatterns üretmek için bir Nikon A1R MP + görüntüleme sistemi kullanıyoruz. Donanım otomatik odaklama ile donatılmış olmayan sistemlerde yüksek verimlilik ve doğrulukla otomatik desen üretimi sağlamak için özel bir komut dosyası kullanmaktadır. Bu IR lazer destekli mikropatterning (mikrofotofopatterning) protokolünün, hücrelerin özel olarak bağlandığı ve istenen şekli aldığı tanımlanmış desenlerle sonuçlandığını gösteriyoruz. Ayrıca, hücre şeklinin standardizasyonu nedeniyle çok sayıda hücreden elde edilen verilerin ortalaması alınabilir. Bu protokolle oluşturulan desenler, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve nicel analiz ile birlikte, form ve işlev arasındaki bağlantıya aracılık eden moleküler oyuncuları tanımlamak için nispeten yüksek aktarım hızı ekranları için kullanılabilir.

Mikropatterning yoluyla elde edilen deneysel verilerin kalitesi büyük ölçüde kalıpların kalitesine bağlıdır. Yukarıdaki yöntemle oluşturulan desenlerin kalitesini belirlemek için ilk olarak kapak kapağının fotoğraf ablated alanlarının şeklini ve boyutunu değerlendirmek için reflektans mikroskopisini kullandık. Her bir desenin ablasyon maskesine çok benzediğini ve şeffaf yatılılar ve ışığı düzgün bir şekilde yansıtan bir yüzey sergilediğini gördük (Şekil 2B</...

Watch this Scientific Journal Video about Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning at JoVE.com

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Burada sunulan protokol, memeli hücrelerindeki sitoskeletal yapıları incelemek için hücre şeklini standartlaştıran mikropatternlerin otomatik olarak üretilmesini sağlar. Bu kullanıcı dostu teknik, piyasada bulunan görüntüleme sistemleri ile kurulabilir ve standart hücre biyolojisi laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipman gerektirmez.

Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Mikropatterning, hücre şekli ve hücreler arası makinelerin aktivitesi arasındaki bağlantıları anlamak için bilim adamları tarafından kullanılan güçlü bir tekniktir. Çeşitli teknikler araştırmacıların hücre şeklini modüle etmesine izin verse de, bu teknikler genellikle bazı biyoloji laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipmanlar gerektirir. Bu video, piyasada bulunan çok sesli görüntüleme sisteminde mikropatterning'i otomatikleştirmek için gereken adımlarda size rehberlik edecektir.Bu protokolün bir avantajı, özel ekipman kullanımından kaçınmasıdır. Desenler, genellikle mikropatterning'de en çok zaman alan işlem olan foto maskeleri yeniden yorumlamadan kolayca değiştirilebilir. Görüntü işleme aracımız, proteinlerin tarafsız ve otomatik bir şekilde temsili dağılımını yansıtan ortalama hücre görüntüleri oluşturur.Deneylerimizde coverlips kullanmamıza rağmen, otomatik iş akışı slaytlar ve cam tabanlı yemekler üzerinde desen yapmanıza da olanak tanır. Sistemin otomatik bir şekilde görüntülenerek doğru odak düzlemini ve desenini tanımlaması için uygun mikroskop kurulumu kritik olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir. PVA çözümünü belirtildiği gibi hazırlayın.Sekiz parça PVA'ya bir bölüm HCL ekleyin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez dikkatlice ters çevirin. Çözeltinin iki mililitresini küçük bir Petri kabına dökün ve sıvıya temiz bir ön işlemeli kapak batırın.Oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda beş dakika kuluçkaya yatır. Kapak kapağını çözeltiden dikkatlice çıkarın. Ceketi 40 saniye döndürmek için kapak döndürücü spinner kullanın.Bu arada, cımbızları temizle. Kapak kapağını bir kutuya aktarın ve gece boyunca dört derecede kurutun. Mikroskop yazılımını açın.İlk olarak, lazer hattını 750 nanometreye ayarlayın. Ardından Image adlı yeni bir optik yapılandırma ayarlayın. Bu, kapak çizgisini yansıtıcılar aracılığıyla görüntüleyenemizi sağlayan temel optik yapılandırmadır.Diğer seçenekleri varsayılan olarak bırakın ve uygun hedefi seçin. Bu optik yapılandırma altında donanım ayarlarını yapılandırın. Kızılötesi lazeri stimülasyon lazerimiz olarak ayarlayın.Görüntüleme için IR lazeri kullanmak için ışın ayırıcıyı ışık yoluna yerleştirin. Galvano tarayıcı birimini ve uygun D tarama dedektörünü seçin. Kapak üzerindeki küçük özellikleri yakalamak için yeterli olan bir tarama boyutu ve çalışma süresi seçin.IR Lazer Kullan kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Kapak tabanı yüzeyinin parlak, ancak doygun olmayan bir görüntüsünü elde etmek için alım lazer gücünü ve dedektör hassasiyetini ayarlayın. Tarama alanı penceresinde, tüm görüş alanını yakalamak için yakınlaştırmayı bire ayarlayın.Optik yapılandırmayı kaydedin. Şimdi mikroskobun odaklanmasını, yatırım getirisi maskesini yüklemesini ve otomatik bir şekilde desenler üretmesini sağlayacak bir dizi optik yapılandırma kuracağız. İlk optik yapılandırma, mevcut görüş alanına otomatik odaklanmak için kullanılan güven verici bir işaretleyici yazdırmamızı sağlar.Görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Güven verici işaretleyiciyi yazdırın. Bu adımda yazdırdığımız için, ışın ayırıcıyı ışık yolundan dışarı taşıyın ve uygun bir dikroik ayna ile değiştirin. Zaman kazanmak için en küçük tarama boyutunu seçin.Bu adımda görüntülemeye gerek olmadığından dedektör hassasiyetini sıfır olarak ayarlayın. Yazdırmayı etkinleştirmek için lazer gücünü artırın. Tarama alanı penceresinde yakınlaştırmayı maksimum olarak ayarlayın ve tarama alanını görüş alanının ortasına yerleştirin.Şimdi PVA yüzeyindeki düzensizliği hesaba katmak için bir Z-stack deneyi kuracağız. Z konumundaki hareketi göreli olarak ayarlayın. Uygun Z cihazını seçin.Ardından, görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Otomatik odaklama. En küçük tarama boyutunu seçin ve tarama alanı penceresindeki yakınlaştırma faktörünü azaltın, böylece görüş alanı güven verici işaretçiden biraz daha büyüktür. Bu, kapak kapağındaki diğer küçük özelliklerin otomatik odaklamayı engellememesini sağlar.Aygıtlar menüsünde Otomatik Odaklama kurulumu'nu seçin. Z yığını denemesinde tarama kalınlığını buna ayarlayın. Mikroskop bu aralığı tarayacak ve güven verici işaretleyiciyi kullanarak en iyi odak düzlemini bulacaktır.Ardından, görüntü optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Yatırım Getirisini Yükle. Maske bu optik yapılandırmayla çekilen bir görüntüye yüklendiğinden, tarama boyutunu yatırım getirisi maskesininkiyle aynı şekilde ayarlayın. Çözünürlük ve hız arasında optimum dengeyi sağlamak için 2048 piksel kullandık.Şimdi kapak tonlarını desenlamak için kullanılan optik konfigürasyonu kuracağız. Baskı güven verici işaretleyici optik yapılandırmasını çoğaltın ve yeniden adlandırın, Micropattern. Yakınlaştırma faktörünü bir olarak ayarlayın.PVA'yı alevlendirmek için stimülasyon lazer gücünü artırın. Uygun bir tarama hızı seçin. ND stimülasyon penceresinde, bir ND stimülasyon deneyi ayarlayın.Zaman çizelgesine birkaç aşama ekleyin ve her biri stimülasyonda ayarlayın. Stimülasyon alanının ve süresinin doğru olduğundan emin olun. Aynı pencerede, her aşamadan önce sahne taşı ana Z işlevini etkinleştirin.Bu yine Z yönünde herhangi bir sapmayı hesaba hazırlar. Son olarak, kapak kapağında desenleri bulmamıza yardımcı olabilecek görünür bir etiket yapmak için bir optik yapılandırma ayarlayın. Yazdırma güven verici işaretçisi çoğaltın ve yeniden adlandırın, Etiket yüzeyi.Lazer gücünü önemli ölçüde artırın ve yakınlaştırmayı bire ayarlayın. PVA kaplı kapak kapağını bir tutucuya aktarın. Dik bir mikroskop için PVA yüzeyinin aşağı bakan olduğundan emin olun.Kapak boruyu stabilize etmek için köşelere su ekleyin. Tutucuyu mikroskop aşamasına monte edin. Hedefi düşür ve aralara su ekleyin.Mikroskop yazılımında, IR lazer deklanşöre açın ve desenlemeden önce otomatik hizalama gerçekleştirin. Görüntü optik yapılandırmasına geçin. Hedefi yavaşça kapak kılıfı ile yaklaştırırken görüş alanını tarayın.İlk başta, görüntü son derece soluk görünecektir. Görüntü parlaklığı biraz artana kadar hedefi kapak kılıfı yakınlaştırın. Bu, hedefe bakan kapaklı yüzeydir.Parlaklık azalana ve tekrar artana kadar hedefi hareket ettirmeye devam edin. Bu, modelleyeceğiz PVA yüzeyi. Kapak kusurları veya toz gibi herhangi bir küçük özelliğe odaklanın ve Z sürücüsünde sıfır ayarlayın.Etiket yüzeyi optik yapılandırmasına geçin. Yakala'ya tıklayın. Görüntüleme ve taramaya geri dönün.Cam hasarı etiketin başarıyla basıldığını gösterir. Cam parçacıklarını önlemek için sahne alanını bir ila iki görüş alanına taşıyın. Onaylamak için tarayın.Aygıtlar menüsünde sahne alanı hareketi makrosunu açın. M ve N değişkenlerini desenlenecek istenen görünüm alanı sayısına ayarlayın. Makroyu kaydedin ve çalıştırın.Desenleme tamamlandıktan sonra görüntü optik yapılandırmasına geçin ve desenleri tarayın. Her görüş alanındaki desen adaları net sınırlara sahip olmalı ve ışığı eşit olarak yansıtmalıdır. Daha koyu ve düzensiz görünen desenler eksik PVA kaldırmayı önerir.Bunun nedeni genellikle yetersiz lazer gücü veya yanlış odak düzlemidir. Lazer gücü çok yüksek ayarlanmışsa, PVA'nın kabarcık yapmasına da neden olabilir. Hücreleri kapak örtülerine kapaktan sonra, hücreler yayılmalı ve desenin şeklini almalıdır.Bu, yaylı tüfek deseni üzerine kaplanlanmış bir insan fibroblastının immünoresans görüntüsüdür. Hücre, aktiin bakımından zengin bir lamellipodia jantı görüntüler. İki tarafı kalın, ventral stres lifleri ve enine yaylarla birbirine bağlanmış sırt stres lifleri.Miyozin ışık zinciri yoğun lamellipodia jantının arkasına oturdu ve aksin demetleri boyunca çizgili bir desen sergiledi. Özel görüntü işleme aracımızı kullanarak, ilgi çekici proteinlerimizin ortalama bir görüntüsünü oluşturduk. Bu görüntü, yukarıda açıklanan aksin yapılarının çok sayıda desende tutarlı olduğunu gösterir.Ortalamadan sonra miyozin bireysel yapılarını kaybetmemize rağmen, aksin demetleri boyunca lokalizasyon korunur. Bu videoyu izledikten sonra, en az manuel çalışma ile piyasada bulunan bir multifotoğraf sistemi kullanarak bir mikro desenleme iş akışı kurabilmelisiniz. Tamamlanmamış desenler oluşturmaktan kaçınmak için lazer gücünü kendi sisteminiz için optimize etmek önemlidir veya otomatik odaklama ve mikropatterning adımlarındaki parametreleri ayarlayarak PVA Maksimum verimlilik elde edilebilir.Hücre morfolojisini içeren hücresel yolların araştırılmasının yanı sıra, bu teknik ilaç taramasına ve hücre şeklindeki varyasyonlara duyarlı diğer uygulamalara da uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Kızılötesi Matriks destekli lazer desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon tarafından tüm vücut Kütle Spektrometre Görüntüleme (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Fotoğrafa Duyarlı Polimerik Nanokarbonlardan SiRNA Salınımının Spatiotemporal Kontrolü ile Gen Silenceresinin Öngörülmesi

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Biyolojik Uygulamalar için Yakın Kızılötesi Yayan Altın Nanokümelerin Sentezi

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

CD47-Türetilmiş Peptid İmmobilizasyonu Ile Metal İmplantlara Kan Yoluyla Bulaşan Hücre Bağlılığının Azaltılması

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Vasküler Görselleştirme için Çift Raster Taramalı Fotoakoustik Küçük Hayvan Görüntüleyici

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...