Name: in vitro induction of human dental pulp stem cells toward pancreatic lineages
Uploaded: 2021-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages at JoVE.com

SK, WR og QDL ble støttet av Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO og PP ble støttet av Chulalongkorn Academic Advancement into Its2 nd Century Project. CS ble støttet av et forskningsstøttende stipend fra Fakultet for veterinærvitenskap, Chulalongkorn Academic Advancement into Its2 nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University og Government Research Fund.

Dette arbeidet ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen og godkjent av Human Research Ethics Committee, Det odontologiske fakultet, Chulalongkorn University. Humane DPSCer (hDPSCer) ble isolert fra humant tannmassevev ekstrahert fra både premolarer og molarer på grunn av visdomstenneproblemer. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene under en godkjent protokoll (HREC-DCU 2018/054).
1. Integrativ induksjonsprotokoll
<ol><li>Fremstilling av lentiviral vektor som bærer PDX1...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+diabetes+atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Danaei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National,+regional,+and+global+trends+in+fasting+plasma+glucose+and+diabetes+prevalence+since+1980:+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+370+country-years+and+2.7+million+participants.">National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants.</a> Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).</li><li>Diabetes Care. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+hypoglycemia+in+diabetes.">Minimizing hypoglycemia in diabetes.</a> Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).</li><li>Health Quality Ontario. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+an+evidence-based+analysis.">Islet transplantation: an evidence-based analysis.</a> Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).</li><li>Brennan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+of+the+Edmonton+protocol+of+islet+transplantation+in+the+United+States.">Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States.</a> American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).</li><li>Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+encapsulation:+Physiological+possibilities+and+limitations.">Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations.</a> Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).</li><li>Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Producing+Cell+Transplantation+Platform+for+Veterinary+Practice.">Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice.</a> Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).</li><li>Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feasibility+study+of+an+in+vitro+differentiation+potential+toward+insulin-producing+cells+by+dental+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells.">A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).</li><li>Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+protocols+for+an+in+vitro+generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+dental+pulp+stem+cells.">Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).</li><li>Kuncorojakti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate/Pluronic+F127-based+encapsulation+supports+viability+and+functionality+of+human+dental+pulp+stem+cell-derived+insulin-producing+cells.">Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).</li><li>Ritz-Laser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+the+beta-cell+specific+transcription+factor+Pdx1+inhibits+glucagon+gene+transcription.">Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription.</a> Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).</li><li>Pampusch, M. S., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+and+expansion+of+primary+T+cells+in+nine+days+with+maintenance+of+central+memory+phenotype.">Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li><li>Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+transfection+efficiency+of+pIDUA/nanoemulsion+complexes+in+a+mucopolysaccharidosis+type+I+murine+model.">Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).</li><li>Balak, J. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+ex+vivo+lentiviral+transduction+of+primary+human+pancreatic+exocrine+cells.">Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).</li><li>Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinations+of+Activin+A+or+nicotinamide+with+the+pancreatic+transcription+factor+PDX1+support+differentiation+of+human+amnion+epithelial+cells+toward+a+pancreatic+lineage.">Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage.</a> Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).</li><li>Spaeth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+novel+role+for+the+Pdx1+transcription+factor+in+islet+&#946;-Cell+maturation+and+proliferation+during+weaning.">Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet &#946;-Cell maturation and proliferation during weaning.</a> Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).</li><li>Bastidas-Ponce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxa2+and+Pdx1+cooperatively+regulate+postnatal+maturation+of+pancreatic+&#946;-cells.">Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic &#946;-cells.</a> Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).</li><li>Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX1,+Neurogenin-3,+and+MAFA:+critical+transcription+regulators+for+beta+cell+development+and+regeneration.">PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 240 (2017).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+and+transcriptome+profiling+of+progenitor-like+colonies+derived+from+adult+mouse+pancreas.">Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 172 (2017).</li><li>Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hrabe+de+Angelis,+M.+Modeling+coexistence+of+oscillation+and+Delta/Notch-mediated+lateral+inhibition+in+pancreas+development+and+neurogenesis.">Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis.</a> Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).</li><li>Xu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+promotes+the+differentiation+of+human+dental+pulp+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+for+improving+the+diabetes+therapy.">Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+under+microgravity+conditions-use+of+stem+cells+and+specialized+cells.">Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).</li><li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells.">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).</li><li>Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+pancreatic+development.">Notch signaling in pancreatic development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).</li><li>Motoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+specific+soluble+factors+promotes+the+functional+maturation+of+transcription+factor-mediated,+pancreatic+transdifferentiated+cells.">Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells.</a> PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).</li><li>Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+pancreatic+acinar+cells+dedifferentiate+into+an+embryonic+progenitor-like+state+in+3D+suspension+culture.">Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).</li><li>Wedeken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+murine+pancreatic+progenitors+require+epidermal+growth+factor+and+nicotinamide+for+self-renewal+and+differentiation+in+a+serum-+and+conditioned+medium-free+culture.">Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture.</a> Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).</li><li>Trott, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+self-renewing+pancreatic+progenitors+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).</li><li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+EMSC-islet+co-localizing+composites+for+xenogeneic+porcine+islet+transplantation.">Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).</li><li>Gauthaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-embryonic+human+Wharton's+jelly+stem+cells+do+not+induce+tumorigenesis,+unlike+human+embryonic+stem+cells.">Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells.</a> Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).</li><li>Schiesser, J. V., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+beta+cells+from+human+pluripotent+stem+cells:+are+we+there+yet.">Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).</li><li>Chmielowiec, J., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+and+expansion+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors.">In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors.</a> The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).</li></ol>

Å oppnå høyere IPC-produksjon fra MSCer spiller en viktig rolle i diabetesbehandling. De kritiske trinnene i den integrative protokollen er avhengige av kvaliteten på cellene som skal brukes til transduksjon og kvaliteten på transinduserte celler. Noen cellekrav som bør kontrolleres for vellykket transduksjon, sikrer cellehelse, cellebankstyring og celler er i mitotisk aktiv tilstand. Videre spiller overvåking av levedyktigheten til transinduserte celler også en viktig rolle. Mindre vellykket transduksjon er for?...

Diabetes mellitus er en pågående global bekymring. En rapport fra International Diabetes Federation (IDF) anslo at den globale forekomsten av diabetes ville øke fra 151 millioner i 2000 til 415 millioner i 20151,2. Den siste epidemiologibaserte studien har spådd at den estimerte verdensomspennende diabetesprevalensen vil øke fra 451 millioner i 2017 til 693 millioner i 20451. Suksessen med bukspyttkjertel holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen ble først demonstrert i 2000, da det ble vist å opprettholde endogen insulinproduksjon og stabilisere den normoglykemiske tilstanden hos type I diabetikere3. Imidlertid står anvendelsen av Edmonton-protokollen fortsatt overfor et flaskehalsproblem. Det begrensede antallet kadaveriske bukspyttkjerteldonorer er hovedproblemet siden hver pasient med type I diabetes krever minst 2-4 holmedonorer. Videre kan langvarig bruk av immundempende midler forårsake livstruende bivirkninger4,5. For å løse dette har utviklingen av en potensiell terapi for diabetes det siste tiåret hovedsakelig fokusert på generering av effektive insulinproduserende celler (IPCer) fra ulike kilder tilstamceller 6.
Stamceller ble en alternativ behandling i mange sykdommer, inkludert diabetes type I, som skyldes tap av betaceller. Transplantasjon av IPCer er den nye lovende metoden for å kontrollere blodsukker hos disse pasientene7. To tilnærminger for å generere IPCer, integrative og ikke-integrative induksjonsprotokoller, presenteres i denne artikkelen. Induksjonsprotokollen etterlignet den naturlige utviklingsprosessen for bukspyttkjertelen for å få de modne og funksjonelle IPCene8,9.
For denne studien var hDPSCer preget av strømningscytometri for MSC-overflatemarkørdeteksjon, multilineage differensieringspotensial og RT-qPCR for å bestemme uttrykket av stemnessegenskap og proliferative genmarkører (data ikke vist)8,9,10. hDPSCer ble indusert mot definitiv endoderm, bukspyttkjertel endoderm, bukspyttkjertel endokrine og bukspyttkjertel beta-celler eller IPCer (Figur 1), henholdsvis7. For å indusere cellene ble en tre-trinns induksjonstilnærming brukt som en ryggradsprotokoll. Denne protokollen ble kalt en ikke-integrativ protokoll. Når det gjelder integrativ protokoll, ble den essensielle transkripsjonsfaktoren for bukspyttkjertelen, PDX1, overekspressert i hDPSCer etterfulgt av induksjon av overutpresset PDX1 i hDPSCer ved hjelp av en tretrinns differensieringsprotokoll. Forskjellen mellom ikke-integrativ og integrativ protokoll er overekspressering av PDX1 i integrativ protokoll og ikke i den ikke-integrative protokollen. Pankreasdifferensiering ble sammenlignet mellom de integrative og ikke-integrative protokollene i denne studien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corporation, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#174; 60 mm TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning&#174;</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon&#174; Ultra-15 Centrifugal Filter</td>
			<td>Merck Millipore, USA</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pWPT-PDX1 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12256</td>
			<td>Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-step Induction Protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A Recombinant Human Protein</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>GF300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon-like peptide (GLP)-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAAs)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-treated cell culture dish, 60mm</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30701011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro induction of human dental pulp stem cells toward pancreatic lineages

Fra og med 2000 sto suksessen med bukspyttkjertel holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen for å behandle type I diabetes mellitus fortsatt overfor noen hindringer. Disse inkluderer det begrensede antallet kadaveriske bukspyttkjerteldonorer og langvarig bruk av immundempende midler. Mesenchymale stamceller (MSCer) har blitt ansett for å være en potensiell kandidat som en alternativ kilde til holmelignende cellegenerering. Våre tidligere rapporter har med hell illustrert etableringen av induksjonsprotokoller for differensiering av humane tannmasse stamceller (hDPSCs) til insulinproduserende celler (IPCer). Induksjonseffektiviteten varierte imidlertid sterkt. I dette dokumentet demonstrerer vi sammenligningen av hDPSCs pankreatisk induksjonseffektivitet via integrativ (mikroenvironmental og genetisk manipulering) og ikke-integrativ (mikroenvironmental manipulering) induksjonsprotokoller for å levere hDPSC-avledede IPCer (hDPSC-IPCer). Resultatene antyder tydelig induksjonseffektivitet for både induksjonsmetodene når det gjelder 3-dimensjonal kolonistruktur, utbytte, bukspyttkjertel mRNA-markører og funksjonell egenskap ved multidosering glukoseutfordring. Disse funnene vil støtte fremtidig etablering av en klinisk anvendelig IPC og bukspyttkjertellinjeproduksjonsplattform.

I denne artikkelen ble resultatene av begge induksjonsprotokollene sammenlignet. Diagrammene for begge induksjonsprotokollene er illustrert i Figur 2A,C. I begge protokollene ble evalueringen utført under et lysmikroskop, og bilder ble analysert med ImageJ. hDPSCer var i stand til å danne kolonilignende strukturer fra den første induksjonsdagen i begge induksjonsprotokollene. Koloniens morfologi var rund og tett, og alle kolonier fløt i kulturfartøyene gjennom hele indu...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages at JoVE.com

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

Denne protokollen presenterer en sammenligning mellom to forskjellige induksjonsprotokoller for differensiering av humane tannmasse stamceller (hDPSCer) mot bukspyttkjertel avstamninger in vitro: den integrerende protokollen og den ikke-integrative protokollen. Den integrerte protokollen genererer flere insulinproduserende celler (IPCer).

Introduksjon Induksjon av humane dentalmasse stamceller mot bukspyttkjertelen avstamninger

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

Denne videoen viser in vitro induksjon av humane tannmasse stamceller mot bukspyttkjertelen avstamninger. Stamceller gir en alternativ behandling i mange sykdommer, inkludert diabetes type I som forårsaker biolaging av betaceller. Transplantasjon av insulinproduserende celler vil være den nye lovende metoden for å forårsake livslang.I denne videoen beskrives to tilnærminger for å generere insulinproduserende celle, inkludert den integrative og ikke-integrative induksjonsprotokollen. Og i denne delen forklares integrasjonsprotokollen for å indusere insulinproduserende celler fra human tannmasse stamcelle. For induksjonsprotokollen er for blanding av den naturlige bukspyttkjertelen utviklingsprosessen.For å få det naturlige og det funksjonelle insulinproduserende cellene. For å generere insulinproduserende celler fra mesenchymale stamceller som tannmasse stamceller, brukes flertrinnsinduksjonsprotokoll. Mesenchymale stamceller brukes i ordet definitiv endoderm, bukspyttkjertel endoderm, bukspyttkjertel endokrine og deretter bukspyttkjertelen beta-celle eller insulinproduserende celler henholdsvis.For å indusere cellene, brukes tretrinns induksjonstilnærming som en ryggradsprotokoll. Den integrerte protokollen benyttet overutløpet av den essensielle transkripsjonsfaktoren for bukspyttkjertelen, PDX-1, av humane stamceller av tannmasse. Da vil PDX-1 over uttrykte stamceller bli ytterligere indusert ved hjelp av tre trinn differensieringsprotokoll.Potensialet for pankreasdifferensiering, ved den integrative protokollen, vil bli sammenlignet med den ikke-integrative protokollen som illustrert i animasjonen. Denne ideen ble utført i henhold til godkjent protokoll av Human Research Ethic Committee, Det odontologiske fakultet, Chulalongkorn University med pasientenes informerte samtykke. Denne protokollen startet med over utløp av PDX-1.Humane tannmasse stamceller i deler av 2 til 5, med 70-80% samløp, brukes til transduksjonen. Celler prøves og telles. Deretter sitter en million celler på transfeksjonsbeholderen og inkuberes over natten.24 timer senere legges nylaget antivirus som bærer PDX-1-genet til det dyrkede fartøyet i henhold til ønsket mangfold av infeksjon. De transfekterte cellene holdes deretter i inkubatoren i 24 timer. Deretter endres ferskt dyrket medium og vedlikeholdes i en annen 48 periode.Morfologi av transfekterte celler kontrolleres før bruk for videre induksjonstrinn. De humane tannmasse stamcellene med PDX-1 over utløp blir deretter Tryptimized og suspendert i det første bukspyttkjertelinduksjonsmediet, såkalt medium A.In dette trinnet, brukes lavt vedlegg dyrket kar. Morfologi av PDX-1 over uttrykte humane tannmasse stamceller på dag 3 etter medium A induksjon observeres.Celler med god morfologi vil deretter bli brukt til ytterligere induksjoner trinn. Neste trinn, det andre induksjonsmediet, såkalt medium B, legges til det kultiverte fartøyet. Morfologien til PDX-1 over uttrykte humane tannmasse stamceller på dag to etter at middels induksjon er observert.Celler med god morfologi vil da bli brukt til videre induksjonstrinn. Neste trinn, det tredje induksjonsmediet, såkalt medium C, legges til det kultiverte fartøyet. 5 dager senere observeres cellemorfologi.Cellekolonier samles inn for videre analyse. Inkludert kolonimorfologi og størrelse, pankreatisk genmarkøruttrykk og funksjonell egenskap angående glukose-stimulert C-peptidsekresjon eller GSCS-analyse. For den ikke-integrative induksjonsmetoden brukes tretrinns induksjonsprotokoll som er nevnt tidligere.En million celler blir suspendert på nytt i medium A og satt på lav tilknytningskulturfartøy. Deretter dyrket i tre dager. Etter at morfologien er sjekket, blir serier av induksjonsmedium, inkludert medium B og C, deretter lagt til det kultiverte fartøyet på henholdsvis dag tre og fem.På dag 10 observeres cellemorfologi. Cellekolonier samles inn for videre analyse, inkludert kolonimorfologi og størrelse, genmarkøruttrykk i bukspyttkjertelen og funksjonell egenskap angående glukose-stimulert C-peptidsekresjon eller GSCS-analyse. Resultatene av begge induksjonsprotokollene sammenlignes i begge protokollene.Humane tannmasse stamceller er i stand til å danne koloni som struktur siden den aller første dagen av induksjonen. Kolonienes utseende er rundt og tett. Alle koloniene flyter i kulturfartøyene gjennom hele induksjonsperioden.Det totale koloniantallet for den integrative induksjonsprotokollen er litt høyere enn for ikke-integrativ induksjon. Utviklingen under kolonistørrelse viser en gunstig trend, fra liten til mellomstor kolonidannelse ved integrativ induksjon, noe som er viktig for å redusere den nekrotiske kjernen inne i kolonien. Pankreas genmarkøranalyse viste at den integrerende induktive protokollen gir koloniene høy utløp av bukspyttkjertelmarkører, inkludert MAP-A, GLUT-2, insulin og GLP-1R, noe som tyder på differensiering mot de målte insulinproduserende cellene.Til funksjonen glukose C-peptid sekresjon er viktig. Resultatene viser at både induksjonsprotokollen gir koloniene god respons på glukoseutfordringen. Fra denne studien, både av bukspyttkjertelen induksjon protokoller er i stand til å generere insulinproduserende celler in vitro i form av bukspyttkjertelen markør utløp og funksjonell egenskap, protokollene viser en bedre kvalitet på insulinproduserende celledannelse.Foreslår trendene i menneskelige mesenchymale stamceller som menneskelig tannmasse stamcelle søknad i stamcellebasert diabetes behandling i nær fremtid.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Bruk av menneskelige perivaskulær stamceller for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og Transfeksjon i Human kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av epidermal vekstfaktorreseptor målrettede Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Bruk av en High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrofluid System for å utvikle muntlige Multi-arter Biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...