Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا مونيك فرويند وكاثرين زيسيل وكيتي على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة العامة لمناهضة الانتخابات ومنظمة أطباء بلا حدود، وغرانت ANR-17-CE14-0001-01 إلى Henri.de la. سال.

وقد أجريت بروتوكولات تشمل الحيوانات وفقا للجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). رقم التصريح: E67-482-10).
1. جمع العظام الماوس
<ol><li>التضحية بالحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. ملاحظة: تم ا?...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

الطريقة الموصوفة في هذه الورقة يسمح لاستخراج وتنقية الماوس MEP و MKp. وكان من السمات الهامة في تحسين البروتوكول الحصول على عدد كاف من الخلايا التي من شأنها أن تكون متوافقة مع معظم المقايسات الجزيئية والخلوية. عادة ما تتكون الممارسة العامة لجمع عظام الفأر لاستخراج الخلايا المكونة للدم في حصا?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة. وتقع هذه الخلايا الكبيرة متعددة الأضلاع في نخاع العظام وبالنسبة لجميع خلايا الدم فهي مشتقة من الخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. المسار الكلاسيكي لإنتاج megakaryocytes في نخاع العظام ينبع من HSC وينطوي على جيل من السلف المختلفة التي تقيد تدريجيا إمكاناتها التمايز2. أول سلف التوقيع على الالتزام النسب megakaryocytic هو Megakaryocyte-Erythrocyte السلف (MEP)، سلف ثنائي القدرة قادرة على إنتاج كل من خلايا الغدة الدرقية وmegakaryocytes3،4،5. ثم تنتج وزارة التربية والميكارسين سلف وحيد القدرة / السلائف (MKp) التي سوف تفرق إلى megakaryocyte ناضجة قادرة على إنتاج الصفائح الدموية. الآليات التي ينطوي عليها توليد هؤلاء السلف ، فضلا عن تمايزها ونضوجها في الخلايا العملاقة معقدة ومفهومة جزئيا فقط. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدم تجانس السكان MEP من حيث إمكانات التمايز ومستوى الالتزام الجوهري لهذه الخلايا لا تزال غير واضحة. ولفك رموز هذه العمليات، من الضروري الحصول على (أو الوصول إلى) مجموعات منقى من MEP و MKp لإجراء تحليلات جزيئية وخلايا واحدة دقيقة.
وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعات معينة من علامات سطح الخلية لتحديد السلف ملتزمة النسب megakaryocytic في الماوس6،7،8. من هذه تم ابتكار طريقة تسمح لتنقية MEP و MKp من الفئران. تم تحسين هذه الطريقة للحصول على خلايا في عدد كاف ونوعية لعدد كبير من المقايسات. مع الاعتبارات الأخلاقية في الاعتبار، ومن أجل تقليل عدد الحيوانات المشاركة في التجارب، ونحن استحثت لحصاد نخاع العظم من عظم الفخذ والساق، وأيضا من قمة الحرقفي. يحتوي هذا العظم على تردد عال وعدد من السلف الدموية ومعظم الوقت معطوب أثناء حصاد العظام الطويل. هنا هو طريقة مفصلة لجمع موثوق بها من هذه العظام.
المعيار الثاني للتحسين هو إنتاج مجموعات خلايا عالية النقاء. الفلورسنت تنشيط فرز الخلية (FACS) هو وسيلة للاختيار من أجل الحصول على السكان تنقية من الخلايا ذات الاهتمام. ومع ذلك، يتم الوصول إلى غلة منخفضة عندما يكون السكان الخلية من الفائدة نادرة جدا. ولذلك فإن إجراءات الإثراء ضرورية. في هذا البروتوكول، تم اختيار إجراء اختيار سلبي باستخدام الخرز المغناطيسي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

خلايا نخاع العظم الضخمة هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة تضمن إنتاج الصفائح الدموية. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال megakaryopoiesis. المراحل النهائية من هذه العملية معقدة وتنطوي كلاسيكيا على السلف Megakaryocyte-Erythrocyte ثنائي القدرة (MEP) وسلفات Megakaryocyte أحادية القدرة (MKp). هذه المجموعات السكانية تسبق تشكيل الخلايا الضخمة حسنة النية ، وعلى هذا النحو ، يمكن عزلها وتوصيفها تسمح للتحليل قوية وغير متحيزة لتشكيل megakaryocyte. يقدم هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراء لجمع الخلايا الدموية من نخاع عظم الفأر ، وإثراء السلف الدموية من خلال الاستنفاد المغناطيسي وأخيرا استراتيجية فرز الخلايا التي تسفر عن مجموعات MEP و MKp شديدة النقاء. أولا، يتم جمع خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ، والساق، وأيضا قمة الحرقفي، وهو العظم الذي يحتوي على عدد كبير من السلف الدموية. استخدام عظام قمة الحرقفي يزيد بشكل كبير من إجمالي عدد الخلايا التي تم الحصول عليها لكل فأر، وبالتالي يساهم في استخدام أكثر أخلاقية للحيوانات. تم تحسين استنفاد النسب المغناطيسي باستخدام حبات مغناطيسية 450 نانومتر مما يسمح لفرز الخلايا بكفاءة عالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وأخيرا ، فإن البروتوكول يقدم وضع العلامات وgating استراتيجية لفرز اثنين من السكان السلف megakaryocyte تنقية عالية : MEP (لين--SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9خافت)وMKP (لين-- SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9مشرق ). هذه التقنية سهلة التنفيذ وتوفر ما يكفي من المواد الخلوية لأداء 1) التوصيف الجزيئي لمعرفة أعمق لهويتها وبيولوجيتها ، 2) في اختبارات التمايز المختبري ، من شأنها أن توفر فهما أفضل لآليات نضوج الخلايا العملاقة ، أو 3) في نماذج المختبر للتفاعل مع بيئتها الدقيقة.

تم إجراء تحليل Phenotypic للخلايا التي تم تحديدها على أنها MEP و MKp عن طريق قياس التدفق الخلوي. وسمت الخلايا بأجسام مضادة مضانة مترافقة مع CD41a وCD42c، وهي علامات كلاسيكية للنساب الضخمة والصفائح الدموية. وأعرب عن كل من علامات من قبل خلايا السكان MKP في حين لم يتم الكشف عن هذه العلامات حتى الآن على سطح خ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

تصف هذه الطريقة تنقية التدفق الخلوي ل MEP و MKp من عظام الفخذ والساق وعظام الحوض.

عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

عزل المجموعات السكانية الرئيسية Megakaryocyte السلف، يسمح للتحليل الدقيق للتسلسل الهرمي النسب في ثقافة الخلية على المقايسات الجزيئية، حتى مستوى الخلية الواحدة. يجمع هذا البروتوكول بين ممارسة أكثر أخلاقية من خلال تقليل عدد الحيوانات المطلوبة ، في عملية فعالة لفرز الخلايا من مجموعات MEP و MKP. للعظم، وجمع رذاذ الجسم من ثمانية إلى 12 أسبوعا C57 الأسود ستة الماوس، مع 70٪الإيثانول.استخدام مقص لجعل نقطة 5-1 سنتيمتر شق الجلد، عمودي على العمود الفقري. وتمزيق الجلد حول الجسم كله، عن طريق سحبه إلى أسفل. ضع وجه الفأرة لأسفل على لوحة التشريح ، ثم حدد عظام الحوض عن طريق انزلاق الأصابع أو المقص ، على طول العمود الفقري المكشوف ، من أعلى إلى أسفل.لتحديد موقع قمة الحرقفي، حدد عثرة صغيرة في المنطقة القطنية بالقرب من الأطراف الخلفية. بعد وضع مقص موازية للعمود الفقري، ضد الفقرات، وعلى مقربة من عثرة قمة الحرقفي، والمضي قدما في قطع العضلات على طول الجانب من العمود الفقري فوق عظم الحوض، عن طريق انزلاق مقص على طول الفقرات، وصولا الى الذيل. ثم قطع بين الفقرات وقمة الحرقفي، والبقاء على مقربة من الفقرات قدر الإمكان.وقطع العضلات المتبقية لفصل الطرف من الجسم. نقل الأطراف المنفصلة إلى سطح نظيف. بعد التخلص من بقية الجسم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، استخدم ملقط ومشرط لفضح عظام الحوض والفخذ والظنبوب، عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة بها.استخدم ملقطا للاحتفاظ بالطرف القاصي من عظم الفخذ ، وخلع رأس الفخذ بعناية من عظم الحوض ، عن طريق تقطيع العضلات بلطف حول المفصل بمشرط. كشط قبالة العضلات المتبقية من عظم الحوض، وقطع في منتصف التجويف الذي عقد رأس الفخذ. الحفاظ على الهيليوم والتخلص من الجانب رقيقة الثلاثي من العظام.باستخدام مشرط، وإزالة الأنسجة المتبقية حول الهيليوم، ووضع العظام تنظيفها في برنامج تلفزيوني عقيم تكملها 2٪ مصل العجل حديثي الولادة. ثم استخدم مقص لقطع القدم من الساق في الكاحل. عقد الجزء السفلي من الساق مع ملقط، كشط العضلات حتى نحو الركبة.تجاهل الشظية. ثم جعل قطع عبر الهضبة الظنبوبية مع مشرط، ووضع الساق في برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS. بعد إزالة الأنسجة المتبقية حول عظم الفخذ، عقد الجانب العلوي من عظم الفخذ مع ملقط، ووضع شفرة مشرط في قاعدة الرضفة.تطبيق قوة نحو الرضفة، بالتوازي مع عظم الفخذ لفصل الرضفة. ثم ضع عظم الفخذ، في برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS. في خزانة تدفق صفح، نقل العظام إلى طبق بيتري عقيمة مليئة برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS.استخدام مشرط لقطع رأس عظم الفخذ. ملء حقنة ملليلتر واحد مع برنامج تلفزيوني معقم 2٪ NBCS، وإرفاق إبرة قياس 21، إلى منفذ. ثم ملء أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر مع اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS.عقد عظم الفخذ مع ملقط، إدراج الإبرة في الأخدود اليسار، بعد إزالة الرضفة عن طريق تطبيق التناوب، وضمان أن يتم إدراج الإبرة تماما في العظام، حتى شطبة. بعد إدخال الإبرة، نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 2٪NBCS. ثم الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS، من الحقنة حتى العظام واضحة.إزالة الإبرة من عظم الفخذ، وإدراجه في حفرة في الجانب الآخر، حيث كان رأس عظم الفخذ. بعد الاستغناء عن المخزن المؤقت وقرصنة، تجاهل العظام. لقمة الحرقفي والساق، استخدم ملقط لعقد العظام وإدراج الإبرة بلطف في الجانب المفتوح، عن طريق تطبيق التناوب.ضمان إدخال الإبرة بالكامل في العظم، حتى الشارف. ثم نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS. الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS من الحقنة حتى العظام واضحة.تمرير كل تعليق الخلية من خلال غطاء 40 ميكرون مصفاة الخلية, وضعت على أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر عقيمة, وإضافة 500 ميكرولتر من PBS 2٪ NBCS. خصص 100 ميكرولتر من تعليق الخلية كنخاع عظمي كامل. ثم تخزينه على الجليد لإجراء تلطيخ.بيليه تعليق تصفيتها عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من الناموست، أعيد إنفاق بيليه في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية الطازجة، مع الحضانة على الجليد، لمدة 30 إلى 45 دقيقة. جانبا 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر معقمة، وصفت لين المسام كسر، وإضافة 90 ميكرولتر من PBS 2٪NBCS.وفي الوقت نفسه، وإعداد الخرز للنضوب المغناطيسي، عن طريق إعادة تعليق لهم في القارورة، مع دوامة شاملة لمدة 30 ثانية. نقل حجم من الخرز المقابلة لاثنين من الخرز لكل خلية الهدف، في أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر، وغسل الخرز مرتين، مع برنامج تلفزيوني 2٪NBCS، عن طريق وضع أنبوب على المغناطيس. بعد إزالة العازلة الغسيل مع ماصة المبستر الزجاج العقيم، resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS.للخطوة الأولى من الاستنفاد المغناطيسي، إضافة 250 ميكرولتر من الخرز على بيليه من الخلايا المغسولة، واحتضان مع خلط لطيف لمدة خمس دقائق على الجليد. ثم أضف اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS، مع خلط لطيف، ووضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقتين. المضي قدما لجمع كسر غير المغناطيسي مع ماصة المبستر الزجاج العقيم.وللخطوة الثانية من النضوب المغناطيسي، أضفه إلى 250 ميكرولتر المتبقية من الخرز المغناطيسي. ضع الأنبوب مختوما بالبارافين على أسطوانة أنبوبية ، لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم أضف اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS مع خلط لطيف.وضع الأنبوب مع المغناطيس لمدة دقيقتين. جمع الكسر غير المغناطيسي في أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر معقمة، وصفت، غير المغناطيسي لين كسر، مع ماصة المعجنات الزجاج العقيم، والمضي قدما في فرز الخلايا megakaryocytes السلف، كما هو موضح في المخطوطة النصية. بالنسبة لاستراتيجية gating لفرز الخلايا ، في السكان لين نيغ ، يتم تحديد الخلايا التي تعبر عن C - عدة ، وانخفاض إلى أي تعبير عن Sca - 1 أو CD16 / 32 مستضد.في هذه الفئات السكانية، يتم تحديد MEP كخلايا إيجابية CD150 وCD9 باهتة. وMKP كما CD150 إيجابية، وCD9 الخلايا الساطعة. في تحليل التدفق الخلوي التمثيلي ، وصفت الخلايا التي تم تحديدها على أنها MEP و Mkp ، بالأجسام المضادة المترافقة الفلورية ل CD41a ، والعلامات الكلاسيكية CD42c ، للنساب الضخمة والصفائح الدموية.تم التعبير عن كلتا العينتين من قبل خلايا مجموعة MKp ، ولم يتم اكتشافها على سطح خلايا سكان MEP. محتوى الحمض النووي للخلايا الضخمة فرزها، أظهرت أن الخلايا هي في الغالب 2n للسكان MEP. وجزء صغير من خلايا MKp غريبة.ولم يتم الكشف عن خلايا الحيل العالية بشكل كبير في هذه المجموعات السكانية. في المقايسات شبه الصلبة الكلونوجينية ، تم الكشف عن CFU-MK في كل من MEP و MKp. لم يتم الكشف عن BFU-E في السكان MKp، ولكن الكشف عنها في MEP و، CD150 السلبي CD9 السكان الخلية السلف خافت.تظهر الملاحظة المجهرية في اليوم الثالث من التمايز أن MEP و MKp أنتجا خلايا عملاقة بشكل رئيسي ، تم تحديدها كخلايا كبيرة. تم تحديد الخلايا الضخمة التي تم الحصول عليها بعد ثلاثة أيام من الثقافة ، باستخدام تعبير CD41 و CD42c ، وتمثل 54 ، و 82٪ من الخلايا المنتجة من مجموعات خلايا MEP و MKp ، على التوالي. كانت حيلة الخلايا الضخمة المنتجة ، أكبر من الخلايا الضخمة المشتقة من سكان MKp ، وقارنتها بسكان MEP.فقط الخلايا المشتقة من السكان MKp، كانت قادرة على انبعاث البربليتليت، مما يشير إلى مرحلة نضوج أكثر تقدما للسكان MKp. استخدام عظم الحوض ، يزيد بشكل كبير إلى عدد الخلايا ، في حين أن الاستنفاد المغناطيسي من خطوتين يحسن فعالية استنفاد النسب. يسمح هذا البروتوكول بالثقافة اللاحقة ل MEP و MKp من الخلايا المفردة ، والتي ، إلى جانب التحليل النسخي والبروتيوميكي ، سيتعين عليها بالتأكيد فك رموز الآليات المعنية ، والنشأة الحيوية المنفذة.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

خلية فأر أليف للكروم عزل الكظرية

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Mouse Dorsal Forebrain Explant Isolation

الماوس يزدرع الدماغ المقدم الظهرية العزل

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...