Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Monique Freund, Catherine Ziessel og Ketty for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) og af Grant ANR-17-CE14-0001-01 til Henri.de la. Salle.

Protokoller, der omfattede dyr, blev udført i overensstemmelse med CREMEAS's komité for etik i dyreforsøg ved universitetet i Strasbourg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Tilladelsesnummer: E67-482-10).
1. Indsamling af museben
<ol><li>Ofre dyret i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer. BEMÆRK: De data, der præsenteres i dette manuskript, er hentet fra C57Bl/6 mus på 8 til 12 uger. Antallet af opnåede celler, og hyppig...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

Den metode, der er beskrevet i dette papir giver mulighed for udvinding og rensning af mus MEP og MKp. En vigtig parameter i optimeringen af protokollen var at opnå et tilstrækkeligt antal celler, der ville være kompatible med de fleste molekylære- og cellulære analyser. Den generelle praksis med indsamling af museben til hæmatoopoietisk celleudvinding består normalt i at høste både lårben og skinneben i hver mus. Bækkenbenet, en anden kilde til hæmatoopoietisk materiale, overses således ofte. Årsagerne til...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Blodplader produceres af megakaryocytter. Disse store polyploidceller er placeret i knoglemarven, og som for alle blodlegemer er de afledt af hæmatopoietiske stamceller (HSC)1. Den klassiske produktionsvej for megakaryocytter i knoglemarven stammer fra HSC og involverer generering af forskellige forfædre, der gradvist begrænser deres differentieringspotentiale2. Den første stamfader underskrive forpligtelsen til megakaryocytisk afstamning er Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), en bipotent stamfader i stand til at producere både erythroid celler og megakaryocytter3,4,5. Mep'et producerer derefter en unipotent stamfader /forløber (MKp), der vil differentiere sig til en moden megakaryocyt, der er i stand til at producere blodplader. De mekanismer, der er involveret i dannelsen af disse forfædre, samt deres differentiering og modning til megakaryocytter er komplekse og kun delvist forstået. Desuden er det stadig uklart, om parlamentsmedlemmets forskelligartethed med hensyn til differentieringspotentiale og disse cellers iboende engagementsniveau er uensartet. For at dechifrere disse processer er det vigtigt at opnå (eller få adgang til) rensede populationer af MEP og MKp til fine molekylære og enkeltcelleanalyser.
Flere undersøgelser har vist særlige kombinationer af celleoverflade markører til identifikation af forfædre forpligtet til megakaryocytisk afstamning i musen6,7,8. Ud fra disse blev der udtænkt en metode, der gjorde det muligt at rense MEP og MKp fra mus. Denne metode blev optimeret til at opnå celler i tilstrækkeligt antal og kvalitet til et stort antal analyser. Med etiske overvejelser i tankerne, og for at minimere antallet af dyr, der er involveret i forsøgene, vi fremkaldte at høste knoglemarven fra lårbenet og skinnebenet, og også fra iliac crest. Denne knogle indeholder en høj frekvens og antallet af hæmatoopoietic forfædre og er det meste af tiden beskadiget under lang knogle høst. Præsenteret her er en detaljeret metode til pålidelig indsamling af denne knogle.
Det andet optimeringskriterier er at producere stærkt rensede cellepopulationer. Fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) er en metode til valg for at opnå rensede populationer af celler af interesse. Men lave udbytter nås, når cellepopulationen af interesse er meget sjælden. Det er derfor nødvendigt med berigningsprocedurer. I denne protokol blev en negativ udvælgelsesprocedure valgt ved hjælp af magnetiske perler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

Knoglemarvs megakaryocytter er store polyploidceller, der sikrer produktionen af blodplader. De stammer fra hæmatopoietiske stamceller gennem megakaryopoiesis. De sidste faser af denne proces er komplekse og involverer klassisk de bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) og unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). Disse populationer går forud for dannelsen af bona fide megakaryocytter, og som sådan kunne deres isolation og karakterisering give mulighed for en robust og upartisk analyse af megakaryocytdannelse. Denne protokol præsenterer i detaljer proceduren for indsamling af hæmatoopoietiske celler fra musebenmarv, berigelse af hæmatoopoietiske forfædre gennem magnetisk udtømning og endelig en cellesorteringsstrategi, der giver stærkt rensede MEP- og MKp-populationer. For det første opsamles knoglemarvsceller fra lårbenet, skinnebenet, og også iliaca crest, en knogle, der indeholder et stort antal hæmatopoietic forfædre. Brugen af iliac crest knogler drastisk øger det samlede celletal opnået pr mus og dermed bidrager til en mere etisk brug af dyr. En magnetisk afstamning udtømning blev optimeret ved hjælp af 450 nm magnetiske perler giver en meget effektiv celle sortering af flow cytometri. Endelig præsenterer protokollen mærknings- og gatingstrategien for sortering af de to stærkt rensede megakarycyt stamfaderpopulationer: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) og MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Denne teknik er let at gennemføre og giver nok cellulært materiale til at udføre i) molekylær karakterisering for en dybere viden om deres identitet og biologi, ii) in vitro differentiering assays, der vil give en bedre forståelse af mekanismerne for modning af megakaryocytter, eller iii) in vitro modeller af interaktion med deres mikromiljø.

Fænotypisk analyse af de celler, der blev identificeret som MEP og MKp, blev udført af flowcytometri. Cellerne blev mærket med fluorescens konjugeret antistoffer mod CD41a og CD42c, klassiske markører af megakaryotetik og blodplade slægter. Begge markører blev udtrykt af cellerne i MKp-populationen, mens disse markører endnu ikke er påvist på overfladen af cellerne i MEP-populationen (Figur 4Ai,4Aii). Polyploidy er et kendetegn for megakaryocytter. DNA-indholdet af ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Denne metode beskriver rensningen ved flowcytometri af MEP og MKp fra mus lårben, skinneben og bækken knogler.

Isolering af Mouse Megakaryocyte Forfædre

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Isoleringen af centrale Megakaryocyte Stamfader populationer, giver mulighed for en fin analyse af slægt hierarki i cellekultur på molekylære assays, op til den enkelte celle niveau. Denne protokol kombinerer en mere etisk praksis ved at minimere antallet af dyr, der kræves, i en effektiv proces til cellesortering af MEP- og MKP-populationer. For knogle, indsamling spray kroppen af en otte til 12 uger gammel C57 sort seks mus, med 70% ethanol.Brug en saks til at gøre et punkt fem til en centimeter snit af huden, vinkelret på rygsøjlen. Og riv huden rundt om hele kroppen, ved at trække den ned. Placer musen med forsiden nedad på dissektionsblokken, og find derefter bækkenbenene ved at glide fingre eller saks langs den udsatte rygsøjle fra top til bund.For at finde iliaca crest, identificere den lille bump i lænderegionen nær bagbenene. Efter at have placeret saksen parallelt med rygsøjlen, mod ryghvirvlerne, og tæt på iliac crest bump, fortsætte med at skære musklerne langs siden af rygsøjlen over bækkenbenet, ved at skubbe saksen langs ryghvirvlerne, ned til halen. Derefter skæres mellem ryghvirvlerne og iliaca crest, opholder sig så tæt på ryghvirvlerne som muligt.Og skær de resterende muskler for at løsne lemmerne fra kroppen. Overfør de fritliggende lemmer til en ren overflade. Efter at kassere resten af kroppen i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer, bruge sammentrækninger og skalpeller til at udsætte bækken, lårben, og tibiale knogler, ved at fjerne omgivende væv.Brug sammentrækninger til at holde den distale ende af lårbenet, og forsigtigt forvrede lårbenet hovedet fra bækkenbenet, ved forsigtigt at skære musklerne omkring artikulation med en skalpel. Skrab de resterende muskler fra bækkenbenet, og skær i midten af hulrummet, der holdt lårbenet hovedet. Hold ilium og kassere den trekantede tynde side af knoglen.Brug en skalpel, fjern restvævet omkring ilium, og placer den rensede knogle i steril PBS suppleret med 2% Newborn Calf Serum. Brug derefter en saks til at afskære foden fra benet ved anklen. Hold den nederste del af skinnebenet med sammentømerne, skrab musklen op mod knæet.Kassér fibulaen. Derefter foretage et snit over tibial plateau med skalpel, og placere skinnebenet i steril PBS 2% NBCS. Efter fjernelse af restvæv omkring lårbenet, holde oversiden af lårbenet med sammenkævninger, og placere skalpelbladet i bunden af knæskallen.Påfør en kraft mod knæskallen, parallelt med lårbenet for at løsne knæskallen. Placer derefter lårbenet, i steril PBS 2% NBCS. I et laminar flow kabinet overføres knoglerne til en steril petriskål fyldt med steril PBS 2%NBCS.Brug en skalpel til at skære hovedet af lårbenene. Fyld en milliliter sprøjte med steril PBS 2% NBCS, og fastgør en 21 gauge nål, til stikkontakten. Fyld derefter et fem milliliter polypropylenrør med to milliliter steril PBS 2%NBCS.Hold lårbenet med sammenkrump, sæt nålen i rillen til venstre, efter at knæskallen er fjernet ved at anvende rotation, hvilket sikrer, at nålen er helt indsat i knoglen, op til facet. Efter nålen indsættelse, overføre knoglen med nålen i røret, der indeholder to milliliter af PBS 2%NBCS. Derefter dispensere og aspirere PBS 2% NBCS, fra sprøjten, indtil knoglen er klar.Fjern nålen fra lårbenet, og sæt den i hullet på den modsatte side, hvor lårbenet hovedet var. Efter dispensering og aspirating bufferen, kassere knoglen. For iliac crest og skinneben, bruge sammenkøjninger til at holde knoglen og forsigtigt indsætte nålen i den åbne side, ved at anvende rotation.Sørg for, at nålen er helt indsat i knoglen, op til facet. Overfør derefter knoglen med nålen ind i røret, der indeholder to milliliter PBS 2%NBCS. Dispenser og aspirer PBS 2%NBCS fra sprøjten, indtil knoglen er klar.Pass alle celle suspension gennem en 40 mikron celle si cap, placeret på en steril fem milliliter polystyren rør, og tilsæt 500 mikroliter af PBS 2% NBCS. Sæt 100 mikroliter af celleops suspensionen som total knoglemarv. Opbevar det derefter på is til farvningsproceduren.Pellet den filtrerede suspension ved centrifugering. Efter at have kasseret supernatanten skal pellet genbruges i en frisklavet primær antistofcocktail med inkubationen på is i 30 til 45 minutter. Sæt 10 mikroliter af celleops suspensionen til et sterilt fem milliliter polystyrenrør, mærket Lin Pores Fraction, og tilsæt 90 mikroliter PBS 2% NBCS.I mellemtiden forberede en perler til magnetisk udtømning, ved at genoplive dem i hætteglasset, med grundig vortexing i 30 sekunder. Overfør et volumen af perler svarende til to perler pr mål celle, i en fem milliliter polypropylen rør, og vask perlerne to gange, med PBS 2% NBCS, ved at placere rør på magneten. Efter fjernelse af vaskebufferen med en steril glaspastaurpipette skal perlerne genbruges i 500 mikroliter steril PBS 2%NBCS.For det første trin af magnetisk udtømning tilsættes 250 mikroliter af perler på pellet af vaskede celler og inkuberer med blid blanding i fem minutter på is. Tilsæt derefter to milliliter steril PBS 2% NBCS, med blid blanding, og læg røret i magneten i to minutter. Fortsæt med at indsamle den ikke-magnetiske fraktion med en steril glas pasteur pipette.Og for det andet trin af magnetisk udtømning, tilføje det til de resterende 250 mikroliter af magnetiske perler. Placer røret forseglet med paraffin på en rørrulle i 20 minutter ved fire grader Celsius. Tilsæt derefter to milliliter steril PBS 2% NBCS med blid blanding.Og læg røret med magneten i to minutter. Saml den ikke-magnetiske fraktion i et sterilt fem milliliter polypropylenrør, mærket, ikke-magnetisk Lin Neg Fraction, med en steril glas pastreur pipette, og fortsæt med cellesortering megakaryocytter forfædre, som beskrevet i tekstmanuskriptet. For gating strategi for celle sortering, i Lin Neg befolkning, de celler, der udtrykker C-kit, og en lav til ingen udtryk for Sca-1 eller CD16/32 antigen er valgt.I denne population identificeres MEP som CD150-positive og CD9-dim-celler. MKP som CD150 positive, og CD9 lyse celler. I den repræsentative Flow Cytometry Analysis, celler identificeret som MEP og Mkp, blev mærket med fluorescens konjugaterede antistoffer for CD41a, og CD42c klassiske markører, af megakaryocytiske og blodplade slægter.Begge markører blev udtrykt af cellerne i MKp-populationen og blev ikke påvist på overfladen af cellerne i MEP-populationen. DNA-indholdet af de sorterede megakaryocytter viste, at cellerne for det meste er 2n for MEP-befolkningen. Og en lille del af MKP-cellerne er fremmede.Højere ploidy celler blev ikke signifikant opdaget i disse populationer. I semi-solid clonogenic assays, CFU-MK blev opdaget i både MEP og MKp populationer. BFU-E blev ikke påvist i MKp-populationen, men detekteret i MEP og CD150 negative CD9 dim stamcellepopulation.Mikroskopisk observation på den tredje differentieringsdag viser, at MEP og MKp hovedsagelig producerede megakaryocytter, identificeret som store celler. Megakaryocytter opnået efter tre dages kultur, blev identificeret ved hjælp af CD41 og CD42c udtryk, og repræsenterer 54, og 82% af de celler, der produceres fra MEP og MKp cellepopulationer, henholdsvis. Ploidy af megakaryocytter produceret, var større fra megakaryocyt stammer fra MKp befolkning, sammenlignet med MEP befolkning.Kun de celler, der stammer fra MKp-populationen, var i stand til proplatelet emission, hvilket tyder på et mere avanceret modningsfase for MKp-populationen. Brugen af bækkenbenet, drastisk stiger til celletal, mens to-trins magnetisk udtømning forbedrer effekten af slægten udtømning. Denne protokol giver mulighed for efterfølgende kultur af MEP og MKp-population af enkeltceller, som sammen med transskriptomisk og proteomisk analyse helt sikkert skal dechifrere de involverede mekanismer, gennemføres biogenese.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Mouse Dorsal Forebrain Explant Isolation

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af Neonatal Mouse cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering og Fysiologisk Analyse af Mouse cardiomyocytter

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...