Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Monique Freund, Catherine Ziessel et Ketty pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), et par Grant ANR-17-CE14-0001-01 à Henri.de la. Salle.

Les protocoles impliquant des animaux ont été réalisés conformément au Comité CREMEAS d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg. Numéro de permis : E67-482-10).
1. Collecte d’os de souris
<ol><li>Sacrifier l’animal conformément aux directives institutionnelles. NOTE: Les données présentées dans ce manuscrit ont été obtenues à partir de souris C57Bl/6 âg...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

La méthode décrite dans cet article permet l’extraction et la purification de MEP et MKp de souris. Un paramètre important dans l’optimisation du protocole était d’obtenir un nombre suffisant de cellules qui seraient compatibles avec la plupart des essais moléculaires et cellulaires. La pratique générale de la collecte d’os de souris pour l’extraction de cellules hématopoïétiques consiste généralement à prélever à la fois les fémurs et les tibias de chaque souris. L’os pelvien, autre source de...

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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes. Ces grandes cellules polyploïdes sont situées dans la moelle osseuse et comme pour toutes les cellules sanguines, elles sont dérivées de cellules souches hématopoïétiques (CSH)1. La voie classique de production de mégacaryocytes dans la moelle osseuse provient du HSC et implique la génération de différents progéniteurs qui restreignent progressivement leur potentiel de différenciation2. Le premier progéniteur signant l’engagement envers la lignée mégacaryocytaire est le Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), un progéniteur bipotent capable de produire à la fois des cellules érythroïdes et des mégacaryocytes3,4,5. Le MEP produit alors un progéniteur/précurseur unipotent (MKp) qui va se différencier en un mégacaryocyte mature capable de produire des plaquettes. Les mécanismes impliqués dans la génération de ces progéniteurs, ainsi que leur différenciation et leur maturation en mégacaryocytes sont complexes et seulement partiellement compris. En outre, l’hétérogénéité de la population de MEP en termes de potentiel de différenciation et le niveau d’engagement intrinsèque de ces cellules ne sont pas encore clairs. Pour déchiffrer ces processus, il est essentiel d’obtenir (ou d’avoir accès à) des populations purifiées de MEP et de MKp pour des analyses moléculaires fines et unicellulaires.
Plusieurs études ont démontré des combinaisons particulières de marqueurs de surface cellulaire pour l’identification des progéniteurs engagés dans la lignée mégacaryocytaire chez la souris6,7,8. À partir de ceux-ci, une méthode a été conçue permettant la purification du MEP et du MKp à partir de souris. Cette méthode a été optimisée pour obtenir des cellules en nombre et en qualité adéquats pour un grand nombre d’essais. Avec des considérations éthiques à l’esprit, et afin de minimiser le nombre d’animaux impliqués dans les expériences, nous avons obtenu de prélever la moelle osseuse du fémur et du tibia, ainsi que de la crête iliaque. Cet os contient une fréquence et un nombre élevés de progéniteurs hématopoïétiques et est la plupart du temps endommagé lors de la récolte d’os longs. Présenté ici est une méthode détaillée pour la collecte fiable de cet os.
Le deuxième critère d’optimisation est de produire des populations cellulaires hautement purifiées. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une méthode de choix afin d’obtenir des populations purifiées de cellules d’intérêt. Cependant, de faibles rendements sont atteints lorsque la population cellulaire d’intérêt est très rare. Des procédures d’enrichissement sont donc nécessaires. Dans ce protocole, une procédure de sélection négative a été choisie à l’aide de billes magnétiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

Les mégacaryocytes de la moelle osseuse sont de grandes cellules polyploïdes qui assurent la production de plaquettes sanguines. Ils proviennent de cellules souches hématopoïétiques par le biais de la mégacaryopoïèse. Les dernières étapes de ce processus sont complexes et impliquent classiquement les progéniteurs bipotents mégacaryocytes-érythrocytaires (MEP) et les progéniteurs mégacaryocytaires unipotents (MKp). Ces populations précèdent la formation de mégacaryocytes de bonne foi et, à ce titre, leur isolement et leur caractérisation pourraient permettre une analyse robuste et impartiale de la formation de mégacaryocytes. Ce protocole présente en détail la procédure de collecte des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris, l’enrichissement des progéniteurs hématopoïétiques par épuisement magnétique et enfin une stratégie de tri cellulaire qui donne des populations de MEP et de MKp hautement purifiées. Tout d’abord, les cellules de la moelle osseuse sont prélevées sur le fémur, le tibia et la crête iliaque, un os qui contient un grand nombre de progéniteurs hématopoïétiques. L’utilisation d’os de la crête iliaque augmente considérablement le nombre total de cellules obtenues par souris et contribue ainsi à une utilisation plus éthique des animaux. Une déplétion de la lignée magnétique a été optimisée à l’aide de billes magnétiques de 450 nm permettant un tri cellulaire très efficace par cytométrie en flux. Enfin, le protocole présente la stratégie d’étiquetage et de contrôle pour le tri des deux populations de progéniteurs mégacarytaires hautement purifiés : MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) et MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Cette technique est facile à mettre en œuvre et fournit suffisamment de matériel cellulaire pour effectuer i) la caractérisation moléculaire pour une connaissance plus approfondie de leur identité et de leur biologie, ii) les tests de différenciation in vitro, qui permettront de mieux comprendre les mécanismes de maturation des mégacaryocytes, ou iii) les modèles in vitro d’interaction avec leur microenvironnement.

L’analyse phénotypique des cellules identifiées comme MEP et MKp a été réalisée par cytométrie en flux. Les cellules ont été marquées avec des anticorps conjugués par fluorescence contre CD41a et CD42c, marqueurs classiques des lignées mégacaryocytaires et plaquettaires. Les deux marqueurs ont été exprimés par les cellules de la population MKp alors que ces marqueurs ne sont pas encore détectés à la surface des cellules de la population MEP (Figure 4Ai, 4Aii</str...

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Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

L’isolement des populations clés de progéniteurs de mégacaryocytes permet une analyse fine de la hiérarchie de la lignée en culture cellulaire sur des tests moléculaires, jusqu’au niveau de la cellule unique. Ce protocole combine une pratique plus éthique en minimisant le nombre d’animaux requis, dans un processus efficace pour le tri cellulaire des populations de MEP et de MKP. Pour l’os, la collecte pulvérise le corps d’une souris C57 noire six âgée de huit à 12 semaines, avec 70% d’éthanol.Utilisez des ciseaux pour faire une incision de cinq à un centimètre de la peau, perpendiculaire à la colonne vertébrale. Et déchirer la peau autour de tout le corps, en la tirant vers le bas. Placez la souris face vers le bas sur le coussinet de dissection, puis localisez les os pelviens en faisant glisser des doigts ou des ciseaux, le long de la colonne vertébrale exposée, de haut en bas.Pour localiser la crête iliaque, identifiez la petite bosse dans la région lombaire près des membres postérieurs. Après avoir placé les ciseaux parallèlement à la colonne vertébrale, contre les vertèbres et près de la bosse de la crête iliaque, procédez à couper les muscles le long du côté de la colonne vertébrale au-dessus de l’os pelvien, en faisant glisser les ciseaux le long des vertèbres, jusqu’à la queue. Ensuite, coupez entre les vertèbres et la crête iliaque, en restant aussi près que possible des vertèbres.Et coupez les muscles restants pour détacher le membre du corps. Transférez les membres détachés sur une surface propre. Après avoir jeté le reste du corps conformément aux directives de l’établissement, utilisez des forceps et des scalpels pour exposer les os pelviens, fémoraux et tibiaux, en enlevant les tissus environnants.Utilisez une pince pour maintenir l’extrémité distale du fémur et disloquez soigneusement la tête fémorale de l’os pelvien, en tranchant doucement les muscles autour de l’articulation avec un scalpel. Grattez le muscle restant de l’os pelvien et coupez au milieu de la cavité qui maintenait la tête fémorale. Conservez l’ilium et jetez le côté mince triangulaire de l’os.À l’aide d’un scalpel, retirez les tissus résiduels autour de l’ilium et placez l’os nettoyé dans du PBS stérile complété par du sérum de veau nouveau-né à 2%. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le pied de la jambe à la cheville. En tenant la partie inférieure du tibia avec la pince, grattez le muscle vers le genou.Jetez le péroné. Ensuite, faites une coupe à travers le plateau tibial avec le scalpel et placez le tibia dans pbS stérile 2% NBCS. Après avoir enlevé les tissus résiduels autour du fémur, tenez la face supérieure du fémur avec une pince et placez la lame du scalpel à la base de la rotule.Appliquez une force vers la rotule, parallèlement au fémur pour détacher la rotule. Placez ensuite le fémur, dans pbS stérile 2% NBCS. Dans une armoire à flux laminaire, transférer les os dans une boîte de Petri stérile remplie de PBS stérile à 2% NBCS.Utilisez un scalpel pour couper la tête des fémurs. Remplissez une seringue d’un millilitre avec du PBS stérile à 2 % NBCS et fixez une aiguille de calibre 21 à la sortie. Remplissez ensuite un tube en polypropylène de cinq millilitres avec deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS.En tenant le fémur avec une pince, insérez l’aiguille dans la rainure gauche, après le retrait de la rotule en appliquant une rotation, en veillant à ce que l’aiguille soit complètement insérée dans l’os, jusqu’au biseau. Après l’insertion de l’aiguille, transférer l’os avec l’aiguille dans le tube contenant deux millilitres de PBS 2% NBCS. Ensuite, distribuez et aspirez le PBS 2% NBCS, de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair.Retirez l’aiguille du fémur et insérez-la dans le trou du côté opposé, où se trouvait la tête du fémur. Après avoir distribué et aspiré le tampon, jetez l’os. Pour la crête iliaque et le tibia, utilisez une pince pour maintenir l’os et insérez doucement l’aiguille dans le côté ouvert, en appliquant une rotation.S’assurer que l’aiguille est complètement insérée dans l’os, jusqu’au biseau. Ensuite, transférez l’os avec l’aiguille dans le tube contenant deux millilitres de PBS 2% NBCS. Distribuer et aspirer le PBS 2% NBCS de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair.Passez toute la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine cellulaire de 40 microns, placé sur un tube stérile en polystyrène de cinq millilitres, et ajoutez 500 microlitres de PBS 2% NBCS. Réserver 100 microlitres de la suspension cellulaire sous forme de moelle osseuse totale. Ensuite, stockez-le sur de la glace pour la procédure de coloration.Pelleter la suspension filtrée par centrifugation. Après avoir jeté le surnageant, ressuspendez la pastille dans un cocktail d’anticorps primaires fraîchement préparé, avec l’incubation sur glace, pendant 30 à 45 minutes. Mettez de côté 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube stérile de cinq millilitres en polystyrène, étiqueté Lin Pores Fraction, et ajoutez 90 microlitres de PBS 2% NBCS.Pendant ce temps, préparez les perles à l’épuisement magnétique, en les remettant en désessépère dans le flacon, avec un vortex complet pendant 30 secondes. Transférer un volume de billes correspondant à deux perles par cellule cible, dans un tube en polypropylène de cinq millilitres, et laver les perles deux fois, avec PBS 2%NBCS, en plaçant le tube sur l’aimant. Après avoir retiré le tampon de lavage avec une pipette pasteur en verre stérile, resuspendez les billes dans 500 microlitres de PBS stérile 2% NBCS.Pour la première étape de l’épuisement magnétique, ajoutez 250 microlitres de perles sur la pastille de cellules lavées et incubez en mélangeant doucement pendant cinq minutes sur de la glace. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS, avec un mélange doux, et placez le tube dans l’aimant pendant deux minutes. Procéder à la collecte de la fraction non magnétique avec une pipette pasteur en verre stérile.Et pour la deuxième étape de l’épuisement magnétique, ajoutez-le aux 250 microlitres restants de perles magnétiques. Placez le tube scellé avec de la paraffine sur un rouleau à tube, pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS avec un mélange doux.Et placez le tube avec l’aimant pendant deux minutes. Recueillir la fraction non magnétique dans un tube stérile en polypropylène de cinq millilitres, étiqueté, fraction Lin Neg non magnétique, avec une pipette de pastreur en verre stérile, et procéder au tri cellulaire des progéniteurs de mégacaryocytes, comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour la stratégie de contrôle du tri cellulaire, dans la population de Lin Neg, les cellules exprimant C-kit et une expression faible ou nulle de l’antigène Sca-1 ou CD16/32 sont sélectionnées.Dans cette population, les MEP sont identifiés comme des cellules CD150 positives et CD9 dim. Le MKP comme CD150 positif, et CD9 cellules lumineuses. Dans l’analyse représentative de cytométrie en flux, les cellules identifiées comme MEP et Mkp ont été marquées avec des anticorps conjugués par fluorescence pour CD41a et des marqueurs classiques CD42c des lignées mégacaryocytaires et plaquettaires.Les deux marqueurs ont été exprimés par les cellules de la population MKp et n’ont pas été détectés à la surface des cellules de la population MEP. La teneur en ADN des mégacaryocytes triés a démontré que les cellules sont principalement 2n pour la population MEP. Et une petite partie des cellules MKp sont étrangères.Des cellules de ploïdie plus élevées n’ont pas été détectées de manière significative dans ces populations. Dans les essais clonogènes semi-solides, l’UFC-MK a été détectée dans les populations de MEP et de MKp. Le BFU-E n’a pas été détecté dans la population de MKp, mais détecté dans le MEP et la population de cellules progéniteurs CD9 CD9 négatifs CD150.L’observation microscopique du troisième jour de différenciation, montre que MEP et MKp ont produit principalement des mégacaryocytes, identifiés comme de grandes cellules. Les mégacaryocytes obtenus après trois jours de culture ont été identifiés à l’aide de l’expression de CD41 et CD42c et représentent respectivement 54 et 82 % des cellules produites à partir de populations de cellules MEP et MKp. La ploïdie des mégacaryocytes produits était plus grande à partir du mégacaryocyte dérivé de la population MKp, par rapport à la population MEP.Seules les cellules dérivées de la population MKp étaient capables d’émission de proplaquettaires, suggérant un stade de maturation plus avancé pour la population MKp. L’utilisation de l’os pelvien augmente considérablement le nombre de cellules, tandis que l’épuisement magnétique en deux étapes améliore l’efficacité de l’épuisement de la lignée. Ce protocole permet la culture ultérieure d’une population de cellules uniques MEP et MKp, qui, avec l’analyse transcriptomique et protéomique, devra certainement déchiffrer les mécanismes impliqués, mis en œuvre la biogenèse.

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