Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Die Autoren danken Monique Freund, Catherine Ziessel und Ketty für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) und von Grant ANR-17-CE14-0001-01 an Henri.de la unterstützt. Salle.

Die Protokolle mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Genehmigungsnummer: E67-482-10).
1. Sammlung von Mausknochen
<ol><li>Opfern Sie das Tier in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien. HINWEIS: Die in diesem Manuskript präsentierten Daten stammen von C57Bl/6-Mäusen im Alter von 8 bis 12 Wochen...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

Die in diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht die Extraktion und Reinigung von Maus-MEP und MKp. Ein wichtiger Parameter bei der Optimierung des Protokolls war es, eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, die mit den meisten molekularen und zellulären Assays kompatibel sind. Die allgemeine Praxis der Mausknochenentnahme für die hämatopoetische Zellextraktion besteht normalerweise darin, sowohl die Femuren als auch die Tibien jeder Maus zu ernten. Der Beckenknochen, eine weitere Quelle für hämatopoet...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert. Diese großen polyploiden Zellen befinden sich im Knochenmark und stammen wie alle Blutzellen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSC)1. Der klassische Weg der Produktion von Megakaryozyten im Knochenmark stammt von HSC und beinhaltet die Erzeugung verschiedener Vorläufer, die ihr Differenzierungspotenzial progressiv einschränken2. Der erste Vorläufer, der das Engagement für die megakaryozytäre Linie unterzeichnet, ist der Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), ein bipotenter Vorläufer, der sowohl erythroide Zellen als auch Megakaryozyten produzieren kann3,4,5. Der MEP produziert dann einen unipotenten Vorläufer / Vorläufer (MKp), der sich zu einem reifen Megakaryozyten differenziert, der in der Lage ist, Blutplättchen zu produzieren. Die Mechanismen, die an der Erzeugung dieser Vorläufer beteiligt sind, sowie ihre Differenzierung und Reifung zu Megakaryozyten sind komplex und nur teilweise verstanden. Darüber hinaus sind die Heterogenität der MEP-Population in Bezug auf das Differenzierungspotenzial und das intrinsische Engagement dieser Zellen noch unklar. Um diese Prozesse zu entschlüsseln, ist es wichtig, gereinigte Populationen von MEP und MKp für feine molekulare und Einzelzellanalysen zu erhalten (oder Zugang zu ihnen zu haben).
Mehrere Studien haben bestimmte Kombinationen von Zelloberflächenmarkern für die Identifizierung von Vorläufern gezeigt, die der megakaryozytären Linie in der Maus zugesetzt sind6,7,8. Aus diesen wurde eine Methode entwickelt, die die Reinigung von MEP und MKp von Mäusen ermöglicht. Diese Methode wurde optimiert, um Zellen in ausreichender Anzahl und Qualität für eine große Anzahl von Assays zu erhalten. Aus ethischen Gründen und um die Anzahl der an den Experimenten beteiligten Tiere zu minimieren, haben wir die Entnahme des Knochenmarks aus dem Femur und der Tibia sowie aus dem Beckenkamm veranlasst. Dieser Knochen enthält eine hohe Häufigkeit und Anzahl von hämatopoetischen Vorläufern und wird die meiste Zeit während der langen Knochenentnahme beschädigt. Hier wird eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Sammlung dieses Knochens vorgestellt.
Das zweite Optimierungskriterium ist die Herstellung hochreiner Zellpopulationen. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) ist eine Methode der Wahl, um gereinigte Populationen von Zellen von Interesse zu erhalten. Niedrige Erträge werden jedoch erreicht, wenn die Zellpopulation von Interesse sehr selten ist. Anreicherungsverfahren sind daher notwendig. In diesem Protokoll wurde ein negatives Selektionsverfahren unter Verwendung von Magnetperlen gewählt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

Knochenmark-Megakaryozyten sind große polyploide Zellen, die die Produktion von Blutplättchen sicherstellen. Sie entstehen aus hämatopoetischen Stammzellen durch Megakaryopoese. Die Endstadien dieses Prozesses sind komplex und umfassen klassischerweise die bipotenten Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer (MEP) und die unipotenten Megakaryozyten-Vorläufer (MKp). Diese Populationen gehen der Bildung von echten Megakaryozyten voraus, und als solche könnte ihre Isolierung und Charakterisierung eine robuste und unvoreingenommene Analyse der Megakaryozytenbildung ermöglichen. Dieses Protokoll stellt detailliert das Verfahren zur Sammlung hämatopoetischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus, die Anreicherung hämatopoetischer Vorläufer durch magnetische Depletion und schließlich eine Zellsortierungsstrategie vor, die hochreine MEP- und MKp-Populationen ergibt. Zuerst werden Knochenmarkzellen aus dem Femur, der Tibia und auch dem Beckenkamm, einem Knochen, der eine hohe Anzahl hämatopoetischer Vorläufer enthält, gesammelt. Die Verwendung von Beckenkammknochen erhöht drastisch die Gesamtzellzahl pro Maus und trägt somit zu einer ethischeren Verwendung von Tieren bei. Eine magnetische Linienverarmung wurde unter Verwendung von 450 nm magnetischen Kügelchen optimiert, was eine sehr effiziente Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie ermöglicht. Schließlich präsentiert das Protokoll die Markierungs- und Gating-Strategie für die Sortierung der beiden hochreinen Megakaryozyten-Vorläuferpopulationen: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) und MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9hell ). Diese Technik ist einfach zu implementieren und liefert genügend zelluläres Material, um i) molekulare Charakterisierung für ein tieferes Wissen über ihre Identität und Biologie, ii) In-vitro-Differenzierungsassays, die ein besseres Verständnis der Mechanismen der Reifung von Megakaryozyten liefern, oder iii) In-vitro-Modelle der Interaktion mit ihrer Mikroumgebung durchzuführen.

Die phänotypische Analyse der als MEP und MKp identifizierten Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Die Zellen wurden mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen CD41a und CD42c, klassische Marker der megakaryozytären und Thrombozytenlinien, markiert. Beide Marker wurden von den Zellen der MKp-Population exprimiert, während diese Marker an der Oberfläche der Zellen der MEP-Population noch nicht nachgewiesen sind (Abbildung 4Ai,4Aii). Polyploidie ist...

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Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Die Isolierung wichtiger Megakaryozyten-Vorläuferpopulationen ermöglicht die feinen Analyse der Abstammungshierarchie in der Zellkultur auf molekularen Assays bis hin zur Einzelzellebene. Dieses Protokoll kombiniert eine ethischere Praxis, indem es die Anzahl der benötigten Tiere minimiert, in einem effizienten Prozess für die Zellsortierung von MEP- und MKP-Populationen. Für Knochen sprühen Sie den Körper einer acht bis 12 Wochen alten C57 Black Six Mouse mit 70% Ethanol auf.Verwenden Sie eine Schere, um einen Punkt fünf bis einen Zentimeter Schnitt der Haut, senkrecht zur Wirbelsäule zu machen. Und reißen Sie die Haut um den ganzen Körper, indem Sie sie nach unten ziehen. Legen Sie die Maus mit dem Gesicht nach unten auf das Sezierpad und lokalisieren Sie dann die Beckenknochen, indem Sie mit den Fingern oder einer Schere entlang der freiliegenden Wirbelsäule von oben nach unten gleiten.Um den Beckenkamm zu lokalisieren, identifizieren Sie die kleine Beule in der Lendengegend in der Nähe der Hintergliedmaßen. Nachdem Sie die Schere parallel zur Wirbelsäule, gegen die Wirbel und in der Nähe der Beckenkammbeule platziert haben, schneiden Sie die Muskeln entlang der Seite der Wirbelsäule über dem Beckenknochen ab, indem Sie die Schere entlang der Wirbel bis zum Schwanz gleiten lassen. Schneiden Sie dann zwischen den Wirbeln und dem Beckenkamm und bleiben Sie so nah wie möglich an den Wirbeln.Und schneiden Sie die verbleibenden Muskeln ab, um die Extremität vom Körper zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Gliedmaßen auf eine saubere Oberfläche. Nachdem Sie den Rest des Körpers in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien verworfen haben, verwenden Sie Pinzette und Skalpelle, um die Becken-, Oberschenkel- und Tibiaknochen freizulegen, indem Sie das umgebende Gewebe entfernen.Verwenden Sie eine Pinzette, um das distale Ende des Femurs zu halten, und dislozieren Sie vorsichtig den Hüftkopf vom Beckenknochen, indem Sie die Muskeln um die Artikulation mit einem Skalpell sanft schneiden. Kratzen Sie den verbleibenden Muskel vom Beckenknochen ab und schneiden Sie in die Mitte der Höhle, die den Hüftkopf hielt. Bewahren Sie das Darmbein auf und verwerfen Sie die dreieckige dünne Seite des Knochens.Entfernen Sie mit einem Skalpell die Restgewebe um das Darmbein und legen Sie den gereinigten Knochen in steriles PBS, ergänzt mit 2% Newborn Calf Serum. Dann verwenden Sie eine Schere, um den Fuß vom Bein am Knöchel abzuschneiden. Halten Sie den unteren Teil der Tibia mit der Pinzette und kratzen Sie den Muskel in Richtung Knie.Entsorgen Sie das Wadenbein. Machen Sie dann mit dem Skalpell einen Schnitt über das Tibiaplateau und legen Sie die Tibia in steriles PBS 2% NBCS. Nachdem Sie die Restgewebe um den Femur entfernt haben, halten Sie die Oberseite des Femurs mit einer Pinzette fest und legen Sie die Skalpellklinge an die Basis der Kniescheibe.Wenden Sie eine Kraft in Richtung der Kniescheibe an, parallel zum Femur, um die Kniescheibe zu lösen. Dann legen Sie den Femur in steriles PBS 2% NBCS. In einem Laminar-Flow-Schrank die Knochen in eine sterile Petrischale geben, die mit sterilem PBS 2% NBCS gefüllt ist.Verwenden Sie ein Skalpell, um den Kopf der Femuren abzuschneiden. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit sterilem PBS 2% NBCS und befestigen Sie eine 21-Gauge-Nadel am Auslass. Füllen Sie dann ein Fünf-Milliliter-Polypropylenröhrchen mit zwei Millilitern sterilem PBS 2% NBCS.Halten Sie den Femur mit einer Pinzette, führen Sie die Nadel nach der Kniescheibenentfernung durch Rotation in die Rille links ein, um sicherzustellen, dass die Nadel vollständig in den Knochen eingeführt wird, bis zur Fase. Nach dem Einführen der Nadel wird der Knochen mit der Nadel in das Röhrchen mit zwei Millilitern PBS 2% NBCS übertragen. Geben Sie dann das PBS 2% NBCS aus der Spritze ab und aspirieren Sie es, bis der Knochen klar ist.Entfernen Sie die Nadel vom Femur und führen Sie sie in das Loch auf der gegenüberliegenden Seite ein, wo sich der Femurkopf befand. Nach dem Dosieren und Absaugen des Puffers entsorgen Sie den Knochen. Verwenden Sie für den Beckenkamm und die Tibia eine Pinzette, um den Knochen zu halten, und führen Sie die Nadel vorsichtig in die offene Seite ein, indem Sie eine Rotation anwenden.Sicherstellen, dass die Nadel vollständig in den Knochen eingeführt wird, bis zur Fase. Dann übertragen Sie den Knochen mit der Nadel in das Röhrchen, das zwei Milliliter PBS 2% NBCS enthält. Verteilen und aspirieren Sie das PBS 2% NBCS aus der Spritze, bis der Knochen klar ist.Führen Sie die gesamte Zellsuspension durch eine 40-Mikron-Zellsiebkappe, legen Sie sie auf ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter PBS 2% NBCS hinzu. 100 Mikroliter der Zellsuspension als Gesamtknochenmark beiseite legen. Dann lagern Sie es auf Eis für den Färbevorgang.Pellet die gefilterte Suspension durch Zentrifugation. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspen sie das Pellet in einem frisch zubereiteten primären Antikörpercocktail mit der Inkubation auf Eis für 30 bis 45 Minuten. 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit der Bezeichnung Lin Pores Fraction geben und 90 Mikroliter PBS 2% NBCS hinzufügen.Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Perle für die magnetische Erschöpfung vor, indem Sie sie in der Durchstechflasche mit gründlichem Wirbeln für 30 Sekunden wiederverwenden. Übertragen Sie ein Volumen von Perlen, das zwei Perlen pro Zielzelle entspricht, in ein Fünf-Milliliter-Polypropylenrohr und waschen Sie die Perlen zweimal mit PBS 2% NBCS, indem Sie das Rohr auf den Magneten legen. Nach dem Entfernen des Waschpuffers mit einer sterilen Glaspasteurpipette werden die Perlen in 500 Mikroliter sterilem PBS 2%NBCS resuspendiert.Für den ersten Schritt der magnetischen Erschöpfung fügen Sie 250 Mikroliter Perlen auf das Pellet der gewaschenen Zellen auf und inkubieren Sie mit sanftem Mischen für fünf Minuten auf Eis. Dann fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS 2% NBCS mit schonendem Mischen hinzu und legen Sie das Röhrchen für zwei Minuten in den Magneten. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion mit einer sterilen Glaspasteurpipette.Und für den zweiten Schritt der magnetischen Erschöpfung fügen Sie es zu den verbleibenden 250 Mikrolitern magnetischer Perlen hinzu. Legen Sie das mit Paraffin versiegelte Rohr für 20 Minuten bei vier Grad Celsius auf eine Rohrwalze. Dann fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS 2% NBCS mit sanfter Mischung hinzu.Und legen Sie die Röhre mit dem Magneten für zwei Minuten. Sammeln Sie die nichtmagnetische Fraktion in einem sterilen Fünf-Milliliter-Polypropylenröhrchen, beschriftet, nichtmagnetische Lin Neg Fraction, mit einer sterilen Glaspasterpipette, und fahren Sie mit der Zellsortierung von Megakaryozyten-Vorläufern fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Für die Gating-Strategie zur Zellsortierung werden in der Lin Neg-Population die Zellen ausgewählt, die C-Kit exprimieren, und ein niedriges bis gar kein Expression von Sca-1- oder CD16/32-Antigen.In dieser Population werden MEP als CD150-positive und CD9-dime Zellen identifiziert. Das MKP als CD150 positive und CD9 helle Zellen. In der repräsentativen Durchflusszytometrie-Analyse wurden Zellen, die als MEP und Mkp identifiziert wurden, mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern für CD41a und CD42c klassische Marker der megakaryozytären und Thrombozytenlinien markiert.Beide Marker wurden von den Zellen der MKp-Population exprimiert und nicht an der Oberfläche der Zellen der MEP-Population nachgewiesen. Der DNA-Gehalt der sortierten Megakaryozyten zeigte, dass die Zellen für die MEP-Population meist 2n sind. Und ein kleiner Teil der MKp-Zellen ist fremd.Höhere Ploidiezellen wurden in diesen Populationen nicht signifikant nachgewiesen. In halbfesten klonogenen Assays wurde CFU-MK sowohl in MEP- als auch in MKp-Populationen nachgewiesen. BFU-E wurde nicht in der MKp-Population nachgewiesen, sondern in MEP und der CD150-negativen CD9 dim Progenitor-Zellpopulation.Mikroskopische Beobachtungen am dritten Tag der Differenzierung zeigen, dass MEP und MKp hauptsächlich Megakaryozyten produzierten, die als große Zellen identifiziert wurden. Megakaryozyten, die nach drei Tagen Kultur gewonnen wurden, wurden mittels CD41- und CD42c-Expression identifiziert und repräsentieren 54 bzw. 82% der Zellen, die aus MEP- bzw. MKp-Zellpopulationen hergestellt wurden. Die Ploidie der produzierten Megakaryozyten war aus den Megakaryozyten, die aus der MKp-Population stammen, im Vergleich zur MEP-Population größer.Nur die Zellen, die aus der MKp-Population stammten, waren in der Lage, Proplatelet-Emissionen durchzuführen, was auf ein fortgeschritteneres Reifestadium für die MKp-Population hindeutet. Die Verwendung des Beckenknochens erhöht sich drastisch auf die Zellzahl, während die zweistufige magnetische Depletion die Wirksamkeit der Lineage-Depletion verbessert. Dieses Protokoll ermöglicht die anschließende Kultur von MEP- und MKP-Populationen einzelner Zellen, die zusammen mit der transkriptomischen und proteomischen Analyse sicherlich die beteiligten Mechanismen entschlüsseln und die Biogenese implementiert haben.

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