Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות למוניק פרוינד, קתרין זיסל וקאטי על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), ועל ידי גרנט ANR-17-CE14-0001-01 כדי Henri.de לה. סאל.

פרוטוקולים הנוגעים לבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). מספר היתר: E67-482-10).
1. אוסף עצמות עכבר
<ol><li>להקריב את החיה בהתאם להנחיות המוסדיות. הערה: הנתונים המוצגים בכתב יד זה התקבלו מ...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

השיטה המתוארת במאמר זה מאפשרת מיצוי וטיהור של עכבר MEP ו- MKp. פרמטר חשוב באופטימיזציה של הפרוטוקול היה להשיג מספר מספיק של תאים שיהיו תואמים לרוב ההסתה המולקולרית והתאית. הנוהג הכללי של איסוף עצמות עכבר להפקת תאים hematopoietic בדרך כלל מורכב קצירת הן עצם הירך והן השוקה של כל עכבר. עצם האגן, מקור נו?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

טסיות דם מיוצרות על ידי מגה-קריוציטים. תאים פוליפלואידיים גדולים אלה ממוקמים במח העצם ובפי כל תאי הדם הם נגזרים מתאי גזע Hematopoietic (HSC)1. המסלול הקלאסי של ייצור של megakaryocytes במח העצם מקורו HSC ומערב את הדור של אבות שונים המגבילים בהדרגה את פוטנציאל הבידול שלהם2. האב הקדמון הראשון החתום על המחויבות לשושלת המקרוציטית הוא האבות Megakaryocyte-אריתרוציט (MEP), צאצא דו-פונטי המסוגל לייצר הן תאי אריתרויד והן מגהקריוציטים3,4,5. לאחר מכן מייצר ה- MEP צאצא /מבשר חד-קומתי (MKP) שיבדל למגקריוציט בוגר המסוגל לייצר טסיות דם. המנגנונים המעורבים בדור אבות אלה, כמו גם הבידול וההתבגרות שלהם למגקריוציטים הם מורכבים ומובנים חלקית בלבד. בנוסף, ההטרוגניות של אוכלוסיית MEP במונחים של פוטנציאל בידול ורמת המחויבות המהותית של תאים אלה עדיין לא ברורה. כדי לפענח תהליכים אלה, חיוני להשיג (או לקבל גישה) אוכלוסיות מטוהרות של MEP ו- MKp עבור ניתוחים מולקולריים ותאיים בודדים עדינים.
מספר מחקרים הדגימו שילובים מסוימים של סמני פני השטח של התא לזיהוי אבות המחויבים לשושלת המגקריוציטית בעכבר6,7,8. מתוך אלה הומצאה שיטה המאפשרת טיהור של MEP ו- MKP מעכברים. שיטה זו הייתה ממוטבת כדי להשיג תאים במספר ובאיכות נאותים עבור מספר רב של בדיקות. מתוך שיקולים אתיים, וכדי לצמצם את מספר בעלי החיים המעורבים בניסויים, עוררנו לקצור את מח העצם מעצם הירך ומהשוקה, וגם מפסגת הכסל. עצם זו מכילה תדירות גבוהה ומספר אבות hematopoietic והוא רוב הזמן פגום במהלך קצירת עצם ארוכה. מוצג כאן היא שיטה מפורטת עבור אוסף אמין של עצם זו.
הקריטריונים השניים של אופטימיזציה הוא לייצר אוכלוסיות תאים מטוהרות מאוד. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) היא שיטה של בחירה על מנת להשיג אוכלוסיות מטוהרות של תאים מעניינים. עם זאת, תשואות נמוכות מגיעות כאשר אוכלוסיית התאים של עניין היא נדירה מאוד. לכן יש צורך בהליכי העשרה. בפרוטוקול זה, הליך בחירה שלילי נבחר באמצעות חרוזים מגנטיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

מגהקריוציטים של מח עצם הם תאים פוליפלואידיים גדולים המבטיחים ייצור של טסיות דם. הם נובעים מתאי גזע hematopoietic דרך megakaryopoiesis. השלבים הסופיים של תהליך זה הם מורכבים וקלאסיים מעורבים אבות Megakaryocyte-אריתרוציטים דו-פוטנטיים (MEP) ואת אבות המגקריוציטים (MKp) החד-פעמיים. אוכלוסיות אלה מקדימות את היווצרותם של מגה-קריוציטים בתום לב, וככאלה, בידודם ואפיונם עלולים לאפשר ניתוח חזק ובלתי משוחד של היווצרות מגה-קריוציטים. פרוטוקול זה מציג בפירוט את ההליך לאיסוף תאים hematopoietic ממח עצם העכבר, העשרה של אבות hematopoietic באמצעות דלדול מגנטי ולבסוף אסטרטגיית מיון תאים המניבים אוכלוסיות MEP ו- MKP מטוהרות מאוד. ראשית, תאי מח עצם נאספים מעצם הירך, השוקה, וגם סמל הכסל, עצם המכילה מספר גבוה של אבות hematopoietic. השימוש בעצמות פסגת הכסל מגדיל באופן דרסטי את מספר התא הכולל המתקבל לעכבר ובכך תורם לשימוש אתי יותר בבעלי חיים. דלדול שושלת מגנטית היה אופטימיזציה באמצעות חרוזים מגנטיים 450 ננומטר המאפשר מיון תאים יעיל מאוד על ידי ציטומטריית זרימה. לבסוף, הפרוטוקול מציג את אסטרטגיית התיוג וההתארגנות למיון שתי אוכלוסיות אבות מגהקריוציט מטוהרות מאוד: MEP (לין-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9עמום) ו- MKP (לין- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9בהיר ). טכניקה זו קלה ליישום ומספקת מספיק חומר תאי לביצוע i) אפיון מולקולרי לידע מעמיק יותר של זהותם וביולוגיה שלהם, ii) במבחנה הבחנה assays, שיספק הבנה טובה יותר של מנגנוני ההתבגרות של megakaryocytes, או iii) במודלים במבחנה של אינטראקציה עם microenvironment שלהם.

ניתוח פנוטיפי של התאים שזוהו כ- MEP ו- MKp בוצעו על ידי ציטומטריית זרימה. תאים סומנו בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים ל- CD41a ו- CD42c, סמנים קלאסיים של שושלות המגקריוציטיות והטסיות. שני הסמנים התבטאו בתאי אוכלוסיית הח"כים בעוד סמנים אלה עדיין לא זוהו על פני השטח של תאי אוכלוסיית MEP (איור 4A...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

הבידוד של אוכלוסיות מפתח Megakaryocyte פרוגניטור, מאפשר ניתוח עדין של היררכיית השושלת בתרבית התאים על התקפות מולקולריות, עד לרמת התא הבודד. פרוטוקול זה משלב פרקטיקה אתית יותר על ידי מזעור מספר בעלי החיים הנדרשים, בתהליך יעיל למיון תאים של אוכלוסיות MEP ו- MKP. עבור עצם, הגבייה לרסס את הגוף של שמונה עד 12 שבועות C57 שחור שישה עכבר, עם 70% אתנול.השתמש במספריים כדי להפוך נקודה חמישה עד סנטימטר אחד חתירה של העור, בניצב לעמוד השדרה. ולקרוע את העור סביב כל הגוף, על ידי משיכת אותו למטה. הנח את פני העכבר כלפי מטה על משטח הניתוח, ולאחר מכן אתר את עצמות האגן על ידי הזזת אצבעות או מספריים, לאורך עמוד השדרה החשוף, מלמעלה למטה.כדי לאתר את סמל הכסל, זהה את הבליטה הקטנה באזור המותני ליד הגפיים האחוריות. לאחר הנחת המספריים במקביל לעמוד השדרה, כנגד החוליות, וקרוב לבליטת פסגת הכסל, המשיכו לחתוך את השרירים לאורך צד עמוד השדרה מעל עצם האגן, על ידי הזזת המספריים לאורך החוליות, עד לזנב. ואז לחתוך בין החוליות ואת פסגת הכסל, להישאר קרוב ככל האפשר לחוליות.ולחתוך את השרירים הנותרים כדי לנתק את האיבר מהגוף. מעבירים את הגפיים המנותקות למשטח נקי. לאחר השלכת שאר הגוף בהתאם להנחיות המוסדיות, יש להשתמש במלקחיים ואזמלים כדי לחשוף את עצמות האגן, הירך והטיבי, על ידי הסרת הרקמה שמסביב.השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הקצה הדיסטלי של עצם הירך, ולפרק בזהירות את ראש הירך מעצם האגן, על ידי חיתוך עדין של השרירים סביב הניסוח עם אזמל. לגרד את השריר הנותר מעצם האגן, לחתוך באמצע החלל שהחזיק את ראש הירך. שמור את האיליום והשלך את הצד הדק המשולש של העצם.באמצעות אזמל, להסיר את שאריות הרקמות סביב ilium, ומניחים את העצם ניקה PBS סטרילי בתוספת 2%סרום עגל שזה עתה נולד. ואז להשתמש במספריים כדי לחתוך את הרגל מהרגל בקרסול. מחזיק את החלק התחתון של השוקה עם המלקחיים, לגרד את השריר כלפי מעלה לכיוון הברך.זרוק את הבורסה. לאחר מכן לעשות לחתוך על פני הרמה tibial עם האזמל, ומניחים את השוקה PBS סטרילי 2%NBCS. לאחר הסרת שאריות הרקמות סביב עצם הירך, להחזיק את הצד העליון של עצם הירך עם מלקחיים, ומניחים את להב האזמל בבסיס פיקת הברך.החל כוח לכיוון פיקת הברך, במקביל עצם הירך לנתק את פיקת הברך. ואז למקם את עצם הירך, PBS סטרילי 2% NBCS. בארון זרימה למינאר, להעביר את העצמות לצלחת פטרי סטרילית מלא PBS סטרילי 2% NBCS.השתמש באזמל כדי לחתוך את הראש של עצם הירך. מלא מזרק מיליליטר אחד עם PBS סטרילי 2%NBCS, ולחבר מחט 21 מד, לשקע. ואז למלא צינור פוליפרופילן חמישה מיליליטר עם שני מיליליטר של PBS סטרילי 2% NBCS.מחזיק את עצם הירך עם מלקחיים, להכניס את המחט בחריץ שמאלה, לאחר הסרת פיקת הברך על ידי החלת סיבוב, להבטיח כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם, עד שיפוע. לאחר החדרת המחט, להעביר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל שני מיליליטר של PBS 2%NBCS. לאחר מכן לוותר ולשאוף PBS 2% NBCS, מהמזרק עד העצם ברורה.הסר את המחט מ עצם הירך, ולהכניס אותו לתוך החור בצד הנגדי, שבו ראש עצם הירך היה. לאחר חלוקה ושאיפה של המאגר, להשליך את העצם. עבור סמל הכסל והשוקה, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את העצם ולהכניס בעדינות את המחט בצד הפתוח, על ידי החלת סיבוב.מוודא כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם, עד שיפוע. ואז להעביר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל שני מיליליטר של PBS 2%NBCS. לוותר ולשאוף PBS 2%NBCS מהמזרק עד העצם ברורה.להעביר את כל ההשעיה התא דרך מכסה מסננת תאים 40 מיקרון, להציב על צינור פוליסטירן 5 מיליליטר סטריליטר סטריליטר, ולהוסיף 500 microliters של PBS 2%NBCS. מניחים בצד 100 מיקרוליטרים של השעיית התא כמח עצם כולל. ואז לאחסן אותו על קרח להליך הכתמים.גלולה ההשעיה המסוננת על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatant, resuspend הכדור בקוקטייל נוגדנים ראשוני מוכן טרי, עם הדגירה על קרח, במשך 30 עד 45 דקות. מניחים בצד 10 מיקרוליטרים של השעיית התא לתוך צינור פוליסטירן סטריליטר חמישה מיליליטר, שכותרתו שבר לין נקבוביות, ולהוסיף 90 microliters של PBS 2% NBCS.בינתיים, להכין חרוזים עבור דלדול מגנטי, על ידי שימוש חוזר אותם בחקירה, עם מערבולת יסודית במשך 30 שניות. העבר נפח של חרוזים המתאימים לשני חרוזים לכל תא יעד, לתוך צינור פוליפרופילן חמישה מיליליטר, ולשטוף את החרוזים פעמיים, עם PBS 2%NBCS, על ידי הצבת צינור על המגנט. לאחר הסרת חיץ הכביסה עם פיפטה פסטר זכוכית סטרילית, resuspend החרוזים ב 500 microliters של PBS סטרילי 2%NBCS.בשלב הראשון של דלדול מגנטי, להוסיף 250 microliters של חרוזים על גלולה של תאים שטופים, ודגרה עם ערבוב עדין במשך חמש דקות על קרח. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של PBS סטרילי 2%NBCS, עם ערבוב עדין, ומניחים את הצינור במגנט במשך שתי דקות. ממשיכים לאסוף את השבר הלא מגנטי עם פיפטה פסטר זכוכית סטרילית.ובצעד השני של דלדול מגנטי, הוסיפו אותו ל-250 המיקרו-לייטרים הנותרים של חרוזים מגנטיים. מניחים את הצינור אטום עם פרפין על רולר צינור, במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של PBS סטרילי 2%NBCS עם ערבוב עדין.ומניחים את הצינור עם המגנט לשתי דקות. לאסוף את השבר הלא מגנטי לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי חמישה מיליליטר, שכותרתו, לא מגנטי לין Neg Fraction, עם פיפטה מאפה זכוכית סטרילית, ולהמשיך עם תאים מיון מגהקריוציטים אבות, כמתואר בכתב היד הטקסט. עבור אסטרטגיית הגינג למיון תאים, באוכלוסיית Lin Neg, התאים המבטאים C-kit, וביטוי נמוך עד ללא ביטוי של אנטיגן Sca-1 או CD16/32 נבחרים.באוכלוסייה זו, MEP מזוהים כתאים חיוביים CD150 ו- CD9 עמום. ה- MKP כתקליטור 150 חיובי, ותאי CD9 בהירים. בניתוח הציטומטריה של הזרימה הייצוגית, תאים שזוהו כ- MEP ו- Mkp, תויגו בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים עבור CD41a, וסמנים קלאסיים CD42c, של שושלות המגקריוציטיות והטסיות.שני הסמנים התבטאו בתאי אוכלוסיית הח"כים, ולא זוהו על פני השטח של תאי אוכלוסיית MEP. תוכן הדנ"א של המגקריוציטים ממוינים, הראה כי התאים הם בעיקר 2n עבור אוכלוסיית MEP. וחלק קטן מתאי הח"כים הם זרים.תאים פלוואידיים גבוהים יותר לא זוהו באופן משמעותי באוכלוסיות אלה. בהתקפות קלונוגניות חצי מוצקות, CFU-MK זוהה הן באוכלוסיות MEP והן באוכלוסיות MKP. BFU-E לא זוהה באוכלוסיית MKp, אך זוהה ב- MEP ובאוכלוסיית תאי אב עמום CD150 שלילי CD9.תצפית מיקרוסקופית ביום השלישי של הבידול, מראה כי MEP ו- MKP יצרו בעיקר מגהקריוציטים, שזוהו כתאים גדולים. Megakaryocytes שהושגו לאחר שלושה ימים של תרבות, זוהו באמצעות ביטוי CD41 ו- CD42c, ומייצגים 54, ו -82% מהתאים המיוצרים מאוכלוסיות תאי MEP ו- MKP, בהתאמה. השפע של המגקריוציטים המיוצרים, היה גדול יותר מהמגהקריוציטים הנגזרת מאוכלוסיית הח"כים, בהשוואה לאוכלוסיית MEP.רק התאים הנגזרים מאוכלוסיית הח"כים, היו מסוגלים להניע פליטה, דבר המצביע על שלב התבגרות מתקדם יותר לאוכלוסיית הח"כים. השימוש בעצם האגן, מגדיל באופן דרסטי את מספר התא, בעוד דלדול מגנטי דו-שלבי משפר את היעילות של דלדול השושלת. פרוטוקול זה מאפשר את התרבות הבאה של MEP ואוכלוסיית MKP של תאים בודדים, אשר, יחד עם ניתוח תמלולי ופרוטאומי, בהחלט יצטרך לפענח את המנגנונים המעורבים, מיושם biogenesis.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

עכבר בידוד הכליה Chromaffin Cell

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Mouse Dorsal Forebrain Explant Isolation

Forebrain הגב עכבר Explant בידוד

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...