Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
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लेखक तकनीकी सहायता के लिए मोनिक फ्रायंड, कैथरीन जैसेल और केट्टी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक द्वारा समर्थित किया गया था), और ग्रांट एएनआर-17-सीई14-0001-01 द्वारा Henri.de ला। साले।

जानवरों को शामिल प्रोटोकॉल स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर क्रेमेस समिति के अनुसार किया गया था (कॉमिटे रेजियोनल डी एथिक एन माटिरे डी एक्सपेरिमेंटेशन एनिमल स्ट्रासबर्ग। परम?...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

इस पेपर में वर्णित विधि माउस एमईपी और एमकेपी के निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए अनुमति देती है। प्रोटोकॉल के अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करना था जो अधिका...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

मेगाकारियोसाइट्स द्वारा रक्त प्लेटलेट्स पैदा किए जाते हैं। ये बड़ी पॉलीप्लाइड कोशिकाएं बोन मैरो में स्थित हैं और सभी रक्त कोशिकाओं के लिए वे हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी)1से प्राप्त होती हैं। बोन मैरो में मेगाकार्योसाइट्स के उत्पादन का शास्त्रीय मार्ग एचएससी से उत्पन्न होता है और इसमें विभिन्न जनकों का उत्पादन शामिल है जो उत्तरोत्तर उनकी भेदभाव क्षमता को सीमित करते हैं2. मेगाकैरियोसाइटिक वंश के प्रति प्रतिबद्धता पर हस्ताक्षर करने वाला पहला जनक मेगाकार्योसाइट-एरिथ्रोसाइट जनक (एमईपी) है, जो एरिथ्रोइड कोशिकाओं और मेगाकैरियोसाइट्स3,4,5दोनों का उत्पादन करने में सक्षम एक द्विपेंट जनक है। इसके बाद एमईपी एक एक एकात्मक जनक/अग्रदूत (एमकेपी) का उत्पादन करता है जो प्लेटलेट्स उत्पादन में सक्षम परिपक्व मेगाकार्योसाइट में अंतर करेगा । इन जनकों की पीढ़ी में शामिल तंत्र, साथ ही मेगाकारियोसाइट्स में उनके भेदभाव और परिपक्वता जटिल हैं और केवल आंशिक रूप से समझ में आते हैं। इसके अलावा, भेदभाव क्षमता और इन कोशिकाओं के आंतरिक प्रतिबद्धता स्तर के मामले में एमईपी आबादी की विषमता अभी भी अस्पष्ट है । इन प्रक्रियाओं को समझने के लिए, ठीक आणविक और एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एमईपी और एमकेपी की शुद्ध आबादी (या पहुंच प्राप्त करना) आवश्यक है।
कई अध्ययनों में माउस 6 , 7,8में मेगाकारियोसाइटिक वंश के लिए प्रतिबद्ध जनकों की पहचान के लिए कोशिका सतह मार्कर के विशेषसंयोजनोंका प्रदर्शन किया गया है । इन से चूहों से एमईपी और एमकेपी के शुद्धिकरण की अनुमति देने के लिए एक विधि तैयार की गई थी। इस विधि को बड़ी संख्या में परख के लिए पर्याप्त संख्या और गुणवत्ता में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। मन में नैतिक विचारों के साथ, और प्रयोगों में शामिल जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, हम फीमर और टिबिया से अस्थि मज्जा फसल के लिए, और भी iliac शिखा से प्राप्त । इस हड्डी में उच्च आवृत्ति और हेमेटोपोइटिक जनकों की संख्या होती है और लंबी हड्डी कटाई के दौरान अधिकांश समय क्षतिग्रस्त होता है। यहां प्रस्तुत इस हड्डी के विश्वसनीय संग्रह के लिए एक विस्तृत विधि है।
अनुकूलन का दूसरा मापदंड अत्यधिक शुद्ध कोशिका आबादी का उत्पादन करना है। फ्लोरोसेंट एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएस) ब्याज की कोशिकाओं की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए पसंद की एक विधि है। हालांकि, कम पैदावार तक पहुंच रहे है जब ब्याज की सेल आबादी बहुत दुर्लभ है । इस प्रकार संवर्धन प्रक्रियाएं आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल में, चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एक नकारात्मक चयन प्रक्रिया का विकल्प चुना गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

बोन मैरो मेगाकारियोसाइट्स बड़ी पॉलीप्लाइड कोशिकाएं हैं जो रक्त प्लेटलेट्स के उत्पादन को सुनिश्चित करती हैं। वे मेगाकारियोपोइसिस के माध्यम से हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं। इस प्रक्रिया के अंतिम चरण जटिल हैं और शास्त्रीय रूप से द्विपसंती मेगाकारियोसाइट-एरिथ्रोसाइट जनक (एमईपी) और एकीपोटेंट मेगाकार्योसाइट जनक (एमकेपी) शामिल हैं। ये आबादी सदाशयी मेगाकारियोसाइट्स के गठन से पहले है और, इस प्रकार, उनके अलगाव और लक्षण वर्णन मेगाकारियोसाइट गठन के मजबूत और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है। यह प्रोटोकॉल माउस बोन मैरो से हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को इकट्ठा करने की प्रक्रिया को विस्तार से प्रस्तुत करता है, चुंबकीय कमी के माध्यम से हेमेटोपोइटिक जनकों का संवर्धन और अंत में एक सेल छंटाई रणनीति जो अत्यधिक शुद्ध एमईपी और एमकेपी आबादी उत्पीड़ित करती है। सबसे पहले, बोन मैरो कोशिकाओं को फीमर, टिबिया, और इलियाक क्रेस्ट से भी एकत्र किया जाता है, एक हड्डी जिसमें हेमेटोपोइटिक जनकों की उच्च संख्या होती है। इलियाक क्रेस्ट हड्डियों का उपयोग प्रति माउस प्राप्त कुल सेल संख्या को काफी बढ़ाता है और इस प्रकार जानवरों के अधिक नैतिक उपयोग में योगदान देता है। एक चुंबकीय वंश की कमी को 450 एनएम चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था जिससे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एक बहुत ही कुशल कोशिका छंटाई की अनुमति मिली। अंत में, प्रोटोकॉल दो अत्यधिक शुद्ध मेगाकैरियोसाइट जनक आबादी की छंटाई के लिए लेबलिंग और गेटिंग रणनीति प्रस्तुत करता है: एमईपी(लिन-एससीए-1-सी-किट+सीडी 16/32-सीडी 150+सीडी9मंद)और एमकेपी (लिन- एससीए-1-सी-किट+सीडी 16/32-सीडी 150+सीडी 9उज्ज्वल ). इस तकनीक को लागू करने के लिए आसान है और मैं प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त सेलुलर सामग्री प्रदान करता है) उनकी पहचान और जीव विज्ञान के गहरे ज्ञान के लिए आणविक लक्षण वर्णन, ii) इन विट्रो विभेदन परख, जो मेगाकारियोसाइट्स, या iii) के परिपक्वता के तंत्र की बेहतर समझ प्रदान करेगा, जो उनके माइक्रोएनवायरमेंट के साथ बातचीत के विट्रो मॉडल में होगा।

एमईपी और एमकेपी के रूप में पहचानी गई कोशिकाओं का फेनोटाइपिक विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। कोशिकाओं को फ्लोरेसेंस के साथ लेबल किया गया था सीडी 41a और सीडी 42c, मेगाकैरियोसाइटिक और प्लेट?...

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Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

यह विधि चूहों फीमर, टिबियास और पेल्विक हड्डियों से एमईपी और एमकेपी के प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धि का वर्णन करती है।

माउस मेगाकार्योसाइट प्रोजेनिटर्स का अलगाव

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

प्रमुख मेगाकैरियोसाइट प्रोजेनिटर आबादी का अलगाव, आणविक परख पर सेल संस्कृति में वंश पदानुक्रम के ठीक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, एकल कोशिका स्तर तक। यह प्रोटोकॉल एमईपी और एमकेपी आबादी के सेल छंटाई के लिए एक कुशल प्रक्रिया में आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करके अधिक नैतिक अभ्यास को जोड़ती है। हड्डी के लिए, संग्रह 70% इथेनॉल के साथ आठ से 12 सप्ताह पुराने C57 काले छह माउस के शरीर को स्प्रे करें।त्वचा का पांच से एक सेंटीमीटर चीरा लगाने के लिए कैंची का प्रयोग करें, रीढ़ की हड्डी के लंबवत। और इसे नीचे खींचकर, पूरे शरीर के चारों ओर त्वचा को फाड़ दें। माउस को विच्छेदन पैड पर नीचे रखें, फिर ऊपर से नीचे तक, उजागर रीढ़ के साथ उंगलियों या कैंची फिसलने से श्रोणि हड्डियों का पता लगाएं।इलियाक क्रेस्ट का पता लगाने के लिए, हिंद अंगों के पास काठ क्षेत्र में छोटी टक्कर की पहचान करें। रीढ़ के समानांतर कैंची रखने के बाद, कशेरुकी के खिलाफ, और इलियाक क्रेस्ट टक्कर के करीब, श्रोणि हड्डी के ऊपर रीढ़ की हड्डी के किनारे के साथ मांसपेशियों को काटने के लिए आगे बढ़ें, कशेरुकी के साथ कैंची फिसलने से, पूंछ के नीचे। फिर कशेरुकी और इलियाक क्रेस्ट के बीच काट लें, जितना संभव हो कशेरुकी के करीब रहें।और शरीर से अंग को अलग करने के लिए शेष मांसपेशियों को काट लें। अलग अंगों को एक साफ सतह पर स्थानांतरित करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में शरीर के बाकी हिस्सों को त्यागने के बाद, आसपास के ऊतकों को हटाकर, श्रोणि, फीमोरल और टिबियल हड्डियों को बेनकाब करने के लिए संदंश और स्केलपेल का उपयोग करें।फीमर के डिस्टल एंड को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें, और एक स्केलपेल के साथ अभिव्यक्ति के चारों ओर की मांसपेशियों को धीरे-धीरे टुकड़ा करने के द्वारा, श्रोणि हड्डी से फीमोरल सिर को सावधानीपूर्वक विस्थापित करें। श्रोणि की हड्डी से शेष मांसपेशी को कुरेदना, और गुहा के बीच में काटा जाता है जो फीमोरल सिर रखता था। इलियम रखें और हड्डी के त्रिकोणीय पतले पक्ष को त्याग दें।एक स्केलपेल का उपयोग करके, इलियम के चारों ओर अवशिष्ट ऊतकों को हटा दें, और 2% नवजात बछड़े सीरम के साथ पूरक बाँझ पीबीएस में साफ हड्डी रखें। इसके बाद टखने पर पैर पैर से पैर काटने के लिए कैंची का इस्तेमाल करें। बलदंश के साथ टिबिया के निचले हिस्से को पकड़ते हुए, मांसपेशियों को घुटने की ओर कुरेदें।फिबुला को छोड़ दें। फिर स्केलपेल के साथ टिबियल पठार में कटौती करें, और बाँझ पीबीएस 2% एनबीसीएस में टिबिया रखें। फीमर के चारों ओर अवशिष्ट ऊतकों को हटाने के बाद, फीमर के ऊपरी हिस्से को संदंश के साथ पकड़ें, और स्केलपेल ब्लेड को घुटने के आधार पर रखें।घुटने की ओर एक बल लागू करें, घुटने के समानांतर, घुटने को अलग करने के लिए फीमर के समानांतर। फिर फीमर रखें, बाँझ पीबीएस 2% एनबीसी में। एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में, हड्डियों को बाँझ पीबीएस 2% एनबीसी से भरे बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।फीमर के सिर को काटने के लिए स्केलपेल का इस्तेमाल करें। बाँझ PBS 2% NBCS के साथ एक मिलीलीटर सिरिंज भरें, और आउटलेट के लिए एक 21 गेज सुई देते हैं । फिर बाँझ PBS 2% NBCS के दो मिलीलीटर के साथ एक पांच मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब भरें।संदंश के साथ फीमर पकड़े हुए, रोटेशन लागू करके घुटने को हटाने के बाद, नाली में सुई डालें, यह सुनिश्चित करना कि सुई पूरी तरह से हड्डी में डाली जाती है, बेवेल तक। सुई प्रविष्टि के बाद, पीबीएस 2% एनबीसी के दो मिलीलीटर युक्त ट्यूब में सुई के साथ हड्डी स्थानांतरित करें। फिर हड्डी स्पष्ट होने तक सिरिंज से पीबीएस 2% एनबीसी को बांटना और एस्पिरेट करें।फीमर से सुई निकालें, और इसे विपरीत दिशा में छेद में डालें, जहां फीमर सिर था। बफर को वितरित करने और एस्पिरेशन करने के बाद, हड्डी को त्याग दें। इलियाक क्रेस्ट और टिबिया के लिए, हड्डी को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें और रोटेशन लागू करके, खुले पक्ष में सुई को धीरे से डालें।यह सुनिश्चित करना कि सुई पूरी तरह से हड्डी में डाला जाता है, बेजल तक। फिर सुई के साथ हड्डी को पीबीएस 2% एनबीसी के दो मिलीलीटर युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें। हड्डी स्पष्ट होने तक सिरिंज से पीबीएस 2% एनबीसी को बांटना और एस्पिरेट करें।एक 40 माइक्रोन सेल छलनी टोपी के माध्यम से सभी सेल निलंबन पास, एक बाँझ पांच मिलीलीटर पॉलीस्टीरिन ट्यूब पर रखा है, और PBS 2% NBCS के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। कुल अस्थि मज्जा के रूप में सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर अलग सेट करें। फिर इसे धुंधला प्रक्रिया के लिए बर्फ पर स्टोर करें।अपकेंद्रित्र द्वारा फ़िल्टर किए गए निलंबन को गोली मारें। सुपरनैंट को त्यागने के बाद, 30 से 45 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेशन के साथ, एक ताजा तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल में गोली को फिर से खर्च करें। सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर को बाँझ पांच मिलीलीटर पॉलीस्टीरिन ट्यूब में अलग करें, लिन पोर्स फ्रैक्शन लेबल, और पीबीएस 2% एनबीसीएस के 90 माइक्रोलीटर जोड़ें।इस बीच, चुंबकीय कमी के लिए एक मोती तैयार करें, उन्हें शीशी में फिर से खर्च करके, 30 सेकंड के लिए पूरी तरह से भंवर के साथ। एक पांच मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में, लक्ष्य सेल प्रति दो मोतियों के अनुरूप मोतियों की मात्रा स्थानांतरित करें, और चुंबक पर ट्यूब रखकर पीबीएस 2% एनबीसी के साथ मोतियों को दो बार धोएं। एक बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ वाशिंग बफर को हटाने के बाद, बाँझ पीबीएस 2% एनबीसी के 500 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें।चुंबकीय कमी के पहले कदम के लिए, धोया कोशिकाओं के गोली पर मोतियों के २५० माइक्रोलीटर जोड़ें, और बर्फ पर पांच मिनट के लिए कोमल मिश्रण के साथ इनक्यूबेट । फिर कोमल मिश्रण के साथ बाँझ PBS 2% NBCS के दो मिलीलीटर जोड़ें, और दो मिनट के लिए चुंबक में ट्यूब जगह है । एक बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ गैर-चुंबकीय अंश एकत्र करने के लिए आगे बढ़ें।और चुंबकीय कमी के दूसरे चरण के लिए, इसे चुंबकीय मोतियों के शेष 250 माइक्रोलीटर में जोड़ें। ट्यूब रोलर पर पैराफिन के साथ सील ट्यूब रखें, चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए। फिर कोमल मिश्रण के साथ बाँझ PBS 2% NBCS के दो मिलीलीटर जोड़ें।और ट्यूब को चुंबक के साथ दो मिनट के लिए रखें। गैर-चुंबकीय अंश को बाँझ पांच मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में एकत्र करें, लेबल, गैर-चुंबकीय लिन नेग फ्रैक्शन, एक बाँझ ग्लास पेस्ट्री पिपेट के साथ, और पाठ पांडुलिपि में वर्णित मेगाकारियोसाइट्स प्रोजेनिटर को छांटने वाले सेल सॉर्टिंग के साथ आगे बढ़ें। सेल छंटाई के लिए गेटिंग रणनीति के लिए, लिन नेग आबादी में, सी-किट व्यक्त करने वाली कोशिकाएं, और एससीए-1 या सीडी 16/32 एंटीजन की कोई अभिव्यक्ति नहीं करने के लिए कम चुना जाता है।इस आबादी में एमईपी की पहचान सीडी150 पॉजिटिव और सीडी9 डिम सेल के रूप में की जाती है। सीडी 150 सकारात्मक, और सीडी 9 उज्ज्वल कोशिकाओं के रूप में एमकेपी। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में, एमईपी और एमकेपी के रूप में पहचानी जाने वाली कोशिकाओं को फ्लोरेसेंस के साथ चिह्नित एंटीबॉडी के लिए CD41a, और सीडी 42c शास्त्रीय मार्कर, मेगाकारेयोसाइटिक और प्लेटलेट वंश के साथ लेबल किया गया था।दोनों मार्कर एमकेपी आबादी की कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए थे, और एमईपी आबादी की कोशिकाओं की सतह पर पता नहीं लगाया गया था। हल किए गए मेगाकारियोसाइट्स की डीएनए सामग्री ने दिखा दिया कि एमईपी आबादी के लिए कोशिकाएं ज्यादातर 2n हैं। और एमकेपी कोशिकाओं का एक छोटा सा हिस्सा विदेशी हैं।इन आबादी में उच्च प्लॉयडी कोशिकाओं का पर्याप्त रूप से पता नहीं लगाया गया था। अर्ध-ठोस क्लोनोजेनिक परख में, एमईपी और एमकेपी दोनों आबादी में सीएलयू-एमके का पता चला। BFU-ई MKp आबादी में पता नहीं था, लेकिन MEP में पता चला और, CD150 नकारात्मक सीडी9 मंद जनक सेल आबादी ।भेदभाव के तीसरे दिन सूक्ष्म अवलोकन से पता चलता है कि एमईपी और एमकेपी ने मुख्य रूप से मेगाकारियोसाइट्स का उत्पादन किया, जिसे बड़ी कोशिकाओं के रूप में पहचाना जाता है। संस्कृति के तीन दिनों के बाद प्राप्त मेगाकारियोसाइट्स की पहचान सीडी 41 और सीडी 42सी अभिव्यक्ति का उपयोग करके की गई थी, और क्रमशः एमईपी और एमकेपी सेल आबादी से उत्पादित 54 और 82% कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है। उत्पादित मेगाकारियोसाइट्स की प्लॉयडी, एमकेपी आबादी से प्राप्त मेगाकार्योसाइट से अधिक थी, इसकी तुलना एमईपी आबादी से की जाती थी।केवल एमकेपी आबादी से प्राप्त कोशिकाएं, प्रोपलेट उत्सर्जन में सक्षम थीं, जो एमकेपी आबादी के लिए अधिक उन्नत परिपक्वता चरण का सुझाव देती थीं। पेल्विक हड्डी का उपयोग, कोशिका संख्या में काफी वृद्धि होती है, जबकि दो-चरण चुंबकीय कमी वंश की कमी की प्रभावकारिता में सुधार करती है। यह प्रोटोकॉल एकल कोशिकाओं की एमईपी और एमकेपी आबादी की बाद की संस्कृति के लिए अनुमति देता है, जो ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के साथ, निश्चित रूप से शामिल तंत्र को समझना होगा, बायोजेनेसिस को लागू किया जाएगा।

Research

JoVE Journal

Biology

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Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

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Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

माउस cardiomyocytes के अलगाव और शारीरिक विश्लेषण

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