Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Monique Freund, Catherine Ziessel e Ketty per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), e da Grant ANR-17-CE14-0001-01 a Henri.de la. Salle.

I protocolli che coinvolgono animali sono stati eseguiti in conformità con il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Numero di permesso: E67-482-10).
1. Raccolta delle ossa del mouse
<ol><li>Sacrificare l'animale nel rispetto delle linee guida istituzionali. NOTA: I dati presentati in questo manoscritto sono stati ottenuti da topi C57Bl/6 di età da 8 a 12...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

Il metodo descritto in questo articolo consente l'estrazione e la purificazione di MEP e MKp di topo. Un parametro importante nell'ottimizzazione del protocollo è stato quello di ottenere un numero sufficiente di cellule che sarebbe stato compatibile con la maggior parte dei saggi molecolari e cellulari. La pratica generale della raccolta delle ossa di topo per l'estrazione delle cellule ematopoietiche di solito consiste nella raccolta sia dei femori che delle tibie di ciascun topo. L'osso pelvico, un'altra fonte di mat...

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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Le piastrine del sangue sono prodotte dai megacariociti. Queste grandi cellule poliploidi si trovano nel midollo osseo e come per tutte le cellule del sangue sono derivate da cellule staminali ematopoietiche (HSC)1. La via classica di produzione dei megacariociti nel midollo osseo ha origine da HSC e prevede la generazione di diversi progenitori che limitano progressivamente il loro potenziale di differenziazione2. Il primo progenitore che firma l'impegno per la linea megacariocitica è il Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), un progenitore bipotente in grado di produrre sia cellule eritroidi che megacariociti3,4,5. Il MEP produce quindi un progenitore/precursore unipotente (MKp) che si differenzierà in un megacariocita maturo in grado di produrre piastrine. I meccanismi coinvolti nella generazione di questi progenitori, così come la loro differenziazione e maturazione in megacariociti sono complessi e solo parzialmente compresi. Inoltre, l'eterogeneità della popolazione MEP in termini di potenziale di differenziazione e il livello di impegno intrinseco di queste cellule non sono ancora chiari. Per decifrare questi processi, è essenziale ottenere (o avere accesso a) popolazioni purificate di MEP e MKp per analisi molecolari fini e monocellulari.
Diversi studi hanno dimostrato particolari combinazioni di marcatori di superficie cellulare per l'identificazione di progenitori impegnati nel lignaggio megacariocitico nel topo6,7,8. Da questi è stato ideato un metodo che consente la purificazione di MEP e MKp dai topi. Questo metodo è stato ottimizzato per ottenere cellule in numero e qualità adeguati per un gran numero di saggi. Con considerazioni etiche in mente, e al fine di ridurre al minimo il numero di animali coinvolti negli esperimenti, abbiamo indotto a raccogliere il midollo osseo dal femore e dalla tibia, e anche dalla cresta iliaca. Questo osso contiene un'alta frequenza e numero di progenitori ematopoietici ed è il più delle volte danneggiato durante la raccolta delle ossa lunghe. Presentato qui è un metodo dettagliato per la raccolta affidabile di questo osso.
Il secondo criterio di ottimizzazione è quello di produrre popolazioni cellulari altamente purificate. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) è un metodo di scelta al fine di ottenere popolazioni purificate di cellule di interesse. Tuttavia, i bassi rendimenti vengono raggiunti quando la popolazione cellulare di interesse è molto rara. Sono quindi necessarie procedure di arricchimento. In questo protocollo, è stata optata per una procedura di selezione negativa utilizzando perle magnetiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

I megacariociti del midollo osseo sono grandi cellule poliploidi che assicurano la produzione di piastrine nel sangue. Derivano da cellule staminali ematopoietiche attraverso la megacariopoiesi. Le fasi finali di questo processo sono complesse e coinvolgono classicamente i progenitori bipotenti megacariociti-eritrociti (MEP) e i progenitori unipotenti dei megacariociti (MKp). Queste popolazioni precedono la formazione di megacariociti in buona fede e, come tali, il loro isolamento e caratterizzazione potrebbero consentire l'analisi robusta e imparziale della formazione di megacariociti. Questo protocollo presenta in dettaglio la procedura per raccogliere cellule ematopoietiche dal midollo osseo di topo, l'arricchimento dei progenitori ematopoietici attraverso l'esaurimento magnetico e infine una strategia di selezione cellulare che produce popolazioni MEP e MKp altamente purificate. In primo luogo, le cellule del midollo osseo vengono raccolte dal femore, dalla tibia e anche dalla cresta iliaca, un osso che contiene un numero elevato di progenitori ematopoietici. L'uso di ossa della cresta iliaca aumenta drasticamente il numero totale di cellule ottenute per topo e contribuisce quindi a un uso più etico degli animali. Un esaurimento del lignaggio magnetico è stato ottimizzato utilizzando perle magnetiche a 450 nm che consentono una selezione cellulare molto efficiente mediante citometria a flusso. Infine, il protocollo presenta la strategia di etichettatura e gating per la cernita delle due popolazioni progenitrici di megacariociti altamente purificate: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) e MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Questa tecnica è facile da implementare e fornisce materiale cellulare sufficiente per eseguire i) caratterizzazione molecolare per una conoscenza più approfondita della loro identità e biologia, ii) saggi di differenziazione in vitro, che forniranno una migliore comprensione dei meccanismi di maturazione dei megacariociti, o iii) modelli in vitro di interazione con il loro microambiente.

L'analisi fenotipica delle cellule identificate come MEP e MKp è stata eseguita mediante citometria a flusso. Le cellule sono state etichettate con anticorpi coniugati a fluorescenza contro CD41a e CD42c, marcatori classici delle linee megacariocitiche e piastriniche. Entrambi i marcatori sono stati espressi dalle cellule della popolazione MKp mentre questi marcatori non sono ancora stati rilevati sulla superficie delle cellule della popolazione MEP (Figura 4Ai,4Aii). La po...

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Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

L'isolamento delle principali popolazioni di Megakaryocyte Progenitor, consente l'analisi fine della gerarchia del lignaggio in coltura cellulare su saggi molecolari, fino al livello della singola cellula. Questo protocollo combina una pratica più etica riducendo al minimo il numero di animali richiesti, in un processo efficiente per lo smistamento cellulare delle popolazioni MEP e MKP. Per l'osso, la raccolta spruzza il corpo di un topo C57 black six di otto-12 settimane, con il 70% di etanolo.Usa le forbici per fare un punto da cinque a un centimetro di incisione della pelle, perpendicolare alla colonna vertebrale. E strappare la pelle intorno a tutto il corpo, tirandola giù. Posizionare il mouse a faccia in giù sul pad di dissezione, quindi individuare le ossa pelviche facendo scorrere le dita o le forbici, lungo la colonna vertebrale esposta, dall'alto verso il basso.Per localizzare la cresta iliaca, identificare la piccola protuberanza nella regione lombare vicino agli arti posteriori. Dopo aver posizionato le forbici parallele alla colonna vertebrale, contro le vertebre e vicino alla protuberanza della cresta iliaca, procedere a tagliare i muscoli lungo il lato della colonna vertebrale sopra l'osso pelvico, facendo scorrere le forbici lungo le vertebre, fino alla coda. Quindi tagliare tra le vertebre e la cresta iliaca, rimanendo il più vicino possibile alle vertebre.E taglia i muscoli rimanenti per staccare l'arto dal corpo. Trasferire gli arti staccati su una superficie pulita. Dopo aver scartato il resto del corpo in conformità con le linee guida istituzionali, utilizzare pinci e bisturi per esporre le ossa pelviche, femorali e tibiali, rimuovendo il tessuto circostante.Utilizzare una pinze per tenere l'estremità distale del femore e dislocare con cura la testa del femore dall'osso pelvico, affettando delicatamente i muscoli attorno all'articolazione con un bisturi. Raschiare via il muscolo rimanente dall'osso pelvico e tagliare nel mezzo della cavità che conteneva la testa del femore. Mantenere l'ileo e scartare il lato sottile triangolare dell'osso.Utilizzando un bisturi, rimuovere i tessuti residui intorno all'ileo e posizionare l'osso pulito in PBS sterile integrato con siero di vitello appena nato al 2%. Quindi utilizzare le forbici per tagliare il piede dalla gamba alla caviglia. Tenendo la parte inferiore della tibia con la pinca, raschiare il muscolo verso il ginocchio.Scartare il perone. Quindi fai un taglio attraverso il plateau tibiale con il bisturi e posiziona la tibia in PBS sterile 2% NBCS. Dopo aver rimosso i tessuti residui intorno al femore, tenere il lato superiore del femore con una pinze e posizionare la lama del bisturi alla base della rotula.Applicare una forza verso la rotula, parallela al femore per staccare la rotula. Quindi posizionare il femore, in PBS sterile 2% NBCS. In un armadio a flusso laminare, trasferire le ossa in una capsula di Petri sterile riempita con PBS sterile 2% NBCS.Usa un bisturi per tagliare la testa dei femori. Riempire una siringa da un millilitro con PBS sterile 2%NBCS e attaccare un ago calibro 21 all'uscita. Quindi riempire un tubo di polipropilene da cinque millilitri con due millilitri di PBS sterile 2% NBCS.Tenendo il femore con una pinica, inserire l'ago nella scanalatura sinistra, dopo la rimozione della rotula applicando la rotazione, assicurandosi che l'ago sia completamente inserito nell'osso, fino alla smussatura. Dopo l'inserimento dell'ago, trasferire l'osso con l'ago nel tubo contenente due millilitri di PBS 2%NBCS. Quindi erogare e aspirare il PBS 2% NBCS, dalla siringa fino a quando l'osso è libero.Rimuovere l'ago dal femore e inserirlo nel foro sul lato opposto, dove si trovava la testa del femore. Dopo aver erogato e aspirato il tampone, scartare l'osso. Per la cresta iliaca e la tibia, utilizzare una pinca per tenere l'osso e inserire delicatamente l'ago nel lato aperto, applicando la rotazione.Assicurarsi che l'ago sia completamente inserito nell'osso, fino alla smussatura. Quindi trasferire l'osso con l'ago nel tubo contenente due millilitri di PBS 2% NBCS. Erogare e aspirare il PBS 2%NBCS dalla siringa fino a quando l'osso non è limpido.Passare tutta la sospensione cellulare attraverso un tappo del filtro cellulare da 40 micron, posto su un tubo sterile di polistirene da cinque millilitri, e aggiungere 500 microlitri di PBS 2%NBCS. Mettere da parte 100 microlitri della sospensione cellulare come midollo osseo totale. Quindi conservarlo sul ghiaccio per la procedura di colorazione.Pellet la sospensione filtrata per centrifugazione. Dopo aver scartato il surnatante, risusegitare il pellet in un cocktail di anticorpi primari appena preparato, con l'incubazione su ghiaccio, per 30-45 minuti. Mettere da parte 10 microlitri della sospensione cellulare in un tubo sterile di polistirene da cinque millilitri, etichettato Come frazione dei pori di Lin, e aggiungere 90 microlitri di PBS 2%NBCS.Nel frattempo, preparare una perla per l'esaurimento magnetico, risosepolandole nella fiala, con un vortice completo per 30 secondi. Trasferire un volume di perline corrispondente a due perline per cella bersaglio, in un tubo di polipropilene da cinque millilitro, e lavare le perline due volte, con PBS 2%NBCS, posizionando il tubo sul magnete. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio con una pipetta sterile di pasta di vetro, rifondere le perle in 500 microlitri di PBS sterile 2%NBCS.Per il primo passo dell'esaurimento magnetico, aggiungere 250 microlitri di perle sul pellet di cellule lavate e incubare con una miscelazione delicata per cinque minuti sul ghiaccio. Quindi aggiungere due millilitri di PBS sterile 2% NBCS, con una miscelazione delicata, e posizionare il tubo nel magnete per due minuti. Procedere alla raccolta della frazione non magnetica con una pipetta sterile di pasta di vetro.E per la seconda fase di esaurimento magnetico, aggiungilo ai restanti 250 microlitri di pere magnetiche. Posizionare il tubo sigillato con paraffina su un rullo tubolare, per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere due millilitri di PBS sterile 2% NBCS con una miscelazione delicata.E posizionare il tubo con il magnete per due minuti. Raccogliere la frazione non magnetica in un tubo sterile di polipropilene da cinque millilitri, etichettato, frazione di Lin Neg non magnetica, con una pipetta di vetro sterile e procedere con la selezione cellulare dei megacariociti progenitori, come descritto nel manoscritto di testo. Per la strategia di gating per lo smistamento cellulare, nella popolazione di Lin Neg, vengono selezionate le cellule che esprimono C-kit e un'espressione bassa o nulla dell'antigene Sca-1 o CD16/32.In questa popolazione, i MEP sono identificati come cellule CD150 positive e CD9 dim. L'MKP come CD150 positivo e le cellule luminose CD9. Nell'analisi rappresentativa della citometria a flusso, le cellule identificate come MEP e Mkp, sono state etichettate con anticorpi coniugati a fluorescenza per CD41a e marcatori classici CD42c delle linee megacariocitiche e piastriniche.Entrambi i marcatori sono stati espressi dalle cellule della popolazione MKp e non sono stati rilevati sulla superficie delle cellule della popolazione MEP. Il contenuto di DNA dei megacariociti ordinati, ha dimostrato che le cellule sono per lo più 2n per la popolazione MEP. E una piccola parte delle celle MKp sono estranee.Le cellule ploidiche più elevate non sono state rilevate in modo significativo in queste popolazioni. Nei saggi clonogenici semi-solidi, CFU-MK è stato rilevato sia nelle popolazioni MEP che MKp. BFU-E non è stato rilevato nella popolazione MKp, ma rilevato in MEP e, la popolazione di cellule progenitrici CD9 dim negative CD150.L'osservazione microscopica il terzo giorno di differenziazione, mostra che MEP e MKp hanno prodotto principalmente megacariociti, identificati come cellule di grandi dimensioni. I megacariociti ottenuti dopo tre giorni di coltura, sono stati identificati utilizzando l'espressione CD41 e CD42c e rappresentano rispettivamente il 54% e l'82% delle cellule prodotte da popolazioni cellulari MEP e MKp. La ploidia dei megacariociti prodotti, era maggiore dal megacariocita derivato dalla popolazione MKp, rispetto alla popolazione MEP.Solo le cellule derivate dalla popolazione MKp, erano in grado di emissione di proplatelet, suggerendo uno stadio di maturazione più avanzato per la popolazione MKp. L'uso dell'osso pelvico, aumenta drasticamente al numero di cellule, mentre l'esaurimento magnetico in due fasi migliora l'efficacia dell'esaurimento del lignaggio. Questo protocollo consente la successiva coltura di popolazioni MEP e MKp di singole cellule, che, insieme all'analisi trascrittomica e proteomica, dovranno certamente decifrare i meccanismi coinvolti, implementati biogenesi.

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