Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

저자는 모니크 프룬드, 캐서린 지셀, 케티에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique)에 의해 지원되었으며 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01에서 Henri.de 라에 의해 지원되었습니다. 솔.

동물관련 프로토콜은 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회에 따라 수행되었습니다(코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에르 데티크 앙 마티에르 데프레시먼트 애니멀 스트라스부르. 허가 번호: E67-482-10).
1. 마우스 뼈 컬렉션
<ol><li>제도적 지침에 따라 동물을 희생하십시오. 참고: 이 원고에 제시된 데이터는 8 주에서 12주 전에 C57Bl/6 마우스로부터 ?...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

이 논문에 설명된 방법은 마우스 MEP 및 MKp의 추출 및 정제를 허용합니다. 프로토콜의 최적화에 있는 중요한 매개 변수는 대부분의 분자 및 세포 기지를 둔 분석과 호환될 세포의 충분한 수를 얻는 것이었습니다. 조혈 세포 추출을 위한 마우스 뼈 수집의 일반적인 사례는 일반적으로 각 마우스의 대퇴골과 티바이어스를 모두 수확하는 것으로 구성됩니다. 골반 뼈, 조혈 물질의 또 다른 소스, 따라서...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

혈액 혈소판은 거대 카르요세포에 의해 생성됩니다. 이러한 큰 폴리플로이드 세포는 골수에 위치하며 모든 혈액 세포는 혈액 세포(HSC)1에서유래된다. 골수에 있는 거대 카르요세포의 생산의 고전적인 통로는 HSC에서 유래하고 점진적으로 그들의 분화 잠재력을 제한하는 다른 선조의 생성을 관련시킵니다2. 메가카요시틱 혈통에 대한 헌신에 서명한 첫 번째 선조는 에리스로이드 세포와 메가카요세포3,4,5를모두 생산할 수 있는 양성선조인 메가카르요세포-에리스로세포 전구(MEP)이다. 그런 다음 MEP는 혈소판을 생산할 수 있는 성숙한 메가카요시테로 분화하는 단능한 전구체/전구체(MKp)를 생성합니다. 이 선조의 생성에 관련되었던 기계장치는, megakaryocytes로의 그들의 분화 및 성숙 뿐 아니라 복잡하고 부분적으로만 이해됩니다. 추가적으로, 이러한 세포의 분화 잠재력과 본질적인 약정 수준의 관점에서 MEP 인구의 이질성은 여전히 불분명하다. 이러한 프로세스를 해독하기 위해서는 미세 분자 및 단일 세포 분석을 위해 MEP 및 MKp의 정제 된 인구를 얻거나 (또는 액세스 할 수 있음)하는 것이 필수적입니다.
몇몇 연구는 마우스6,7,8에서거대 핵세포 계보에 전념하는 선조의 식별을 위한 세포 표면 마커의 특정 조합을입증했습니다. 이러한 방법에서 마우스로부터 MEP 및 MKp의 정제를 허용하는 방법이 고안되었다. 이 방법은 많은 수의 분석에 대해 적절한 수와 품질로 세포를 얻기 위해 최적화되었습니다. 윤리적 고려 사항을 염두에 두고 실험에 관련된 동물의 수를 최소화하기 위해 대퇴골과 경골, 그리고 또한 일강 문장에서 골수를 수확하도록 유도했습니다. 이 뼈는 높은 주파수와 조혈 선조의 수를 포함하고 긴 뼈 수확 도중 손상된 시간의 대부분입니다. 여기에 이 뼈의 신뢰할 수 있는 컬렉션에 대 한 자세한 방법은 소개.
최적화의 두 번째 기준은 고도로 정제된 세포 집단을 생산하는 것입니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 관심있는 세포의 정제 된 인구를 얻기 위해 선택의 방법입니다. 그러나, 낮은 수익률은 관심의 세포 인구가 매우 드물 때 도달한다. 따라서 농축 절차가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 마그네틱 구슬을 사용하여 음수 선택 절차를 선택했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

골수 메가카요세포는 혈액 혈소판의 생산을 보장하는 큰 폴리플로이드 세포입니다. 그(것)들은 거대 karyopoiesis를 통해 조혈 줄기 세포에서 생겨나. 이 과정의 최종 단계는 복잡하고 고전적으로 이중성 메가카요세포-에리스로세포 전구체(MEP)와 단능한 메가카요시테 전조자(MKp)를 포함한다. 이 인구는 선의의 거대 카르요세포의 형성을 선행하고, 그 격리와 특성화는 거대 카르요세포 형성의 강력하고 편견없는 분석을 허용할 수 있었다. 이 프로토콜은 마우스 골수에서 조혈 세포를 수집하는 절차를 자세히 제시, 자기 고갈을 통해 조혈 선조의 농축과 마지막으로 매우 정제 MEP와 MKp 인구를 산출 세포 선별 전략. 첫째, 골수 세포는 대퇴골, 경골 및 또한 일강 문장, 조혈 선조의 높은 수를 포함하는 뼈에서 집합된다. iliac 문장 뼈의 사용은 마우스 당 얻은 총 세포 수를 크게 증가시키고 따라서 동물의 더 윤리적 사용에 기여한다. 450nm 자성 구슬을 사용하여 자기 계보 고갈을 최적화하여 유동 세포측정에 의한 매우 효율적인 세포 선별을 가능하게 했습니다. 마지막으로, 프로토콜은 두 개의 고도로 정제 된 메가 카요 세포 선조 모집단의 정렬을위한 라벨링 및 게이팅 전략을 제시합니다 : MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16 / CD9 dim ) 및 MKp (Lin- Sca-1-c 키트+CD16 + CD16 +CD16 + CD16 - CD16 - CD16 - CD16 - CD16 - CD16 + CD16 + CD16 + CD10 + CD10 + CD9dim)및 CD16 + CD16 + CD16 + CD16+CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD16 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10+ ). 이 기술은 구현하기 쉽고 i) 그들의 정체성과 생물학의 깊은 지식에 대한 분자 특성화를 수행하기에 충분한 세포 물질을 제공합니다, ii) 체외 분화 소사, 그 메가 카르요세포의 성숙의 메커니즘의 더 나은 이해를 제공 할 것입니다, 또는 iii) 자신의 마이크로 환경과의 상호 작용의 체외 모델.

MEP 및 MKp로 확인된 세포의 Phenotypic 분석은 유동 세포측정에 의해 수행되었다. 세포는 형광 컨쥬게이징 항체로 CD41a 및 CD42c, 메가카요시틱 및 혈소판 계보의 고전적인 마커로 표지되었다. 두 마커모두 MKp 집단의 세포에 의해 발현되었으며, 이들 마커는 아직 MEP 집단의 세포의 표면에서 검출되지않았다(도 4Ai,4Aii). 폴리플로이디는 메가카요사이클의 특징입니다. 선...

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Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

주요 메가카요세포 전구 집단의 분리는 단일 세포 수준까지 분자 분석법의 세포 배양에서 계보 계층구조의 미세한 분석을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 MEP 및 MKP 집단의 세포 분류를 위한 효율적인 프로세스에서 필요한 동물의 수를 최소화하여 보다 윤리적인 관행을 결합합니다. 뼈의 경우, 컬렉션은 8-12주 된 C57 블랙 6 마우스의 몸에 70%에탄올을 뿌린다.가위를 사용하여 척추에 수직으로 5~1센티미터의 피부 절개를 합니다. 그리고 몸을 당겨 몸 전체를 찢어. 마우스를 해부 패드에 아래로 놓고 손가락이나 가위를 슬라이딩하여 골반 뼈를 찾습니다.iliac 문장을 찾으려면 뒷다리 근처의 요추 부위의 작은 범프를 식별합니다. 척추에 평행하게 가위를 배치 한 후, 척추에 대해, 그리고 iliac 문장 범프에 가까운, 골반 뼈 위의 척추의 측면을 따라 근육을 잘라 진행, 척추를 따라 가위를 슬라이딩하여, 꼬리아래로. 그런 다음 척추와 장골 문장 사이를 잘라 가능한 한 척추에 가깝게 유지합니다.그리고 몸에서 사지를 분리하기 위해 나머지 근육을 잘라. 분리된 팔다리를 깨끗한 표면으로 옮기습니다. 기관 지침에 따라 신체의 나머지 부분을 폐기 한 후, 주위 조직을 제거하여 골반, 대퇴, 및 정골 뼈를 노출하는 집게와 메스를 사용합니다.집게를 사용하여 대퇴골의 탈경을 잡고, 메스로 관절 주위의 근육을 부드럽게 슬라이스하여 골반 뼈에서 대퇴머리를 조심스럽게 탈구하십시오. 골반 뼈에서 남은 근육을 긁어 내고 대퇴머리를 쥐고 있는 구멍 의 한가운데에서 잘라냅니다. 일륨을 유지하고 뼈의 삼각형 얇은 면을 폐기하십시오.메스를 사용하여, 일륨 주위에 잔류 조직을 제거하고, 2 %의 신생아 송아지 세럼으로 보충 멸균 PBS에 청소 된 뼈를 배치합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 발목의 다리에서 발을 잘라냅니다. 집게로 경골의 하부부분을 잡고, 무릎을 향해 근육을 긁어.비골을 버리십시오. 그런 다음 메스로 양철 고원을 가로 질러 잘라 멸균 PBS 2 %NBCS에 경골을 놓습니다. 대퇴골 주위의 잔류 조직을 제거한 후 대퇴골의 위쪽을 집게로 잡고 메스 블레이드를 슬개골 바닥에 놓습니다.슬개골을 향해 힘을 바르고 대퇴골과 평행하여 슬개골을 분리합니다. 그런 다음 대퇴골을 멸균 PBS 2 %NBCS에 배치하십시오. 라미나르 플로우 캐비닛에서 뼈를 멸균 PBS 2%NBCS로 채워진 멸균 페트리 접시로 옮겨보도록 한다.메스를 사용하여 대퇴골의 머리를 잘라냅니다. 멸균 PBS 2 % NBCS로 1 밀리리터 주사기를 채우고 21 게이지 바늘을 콘센트에 부착하십시오. 그런 다음 멸균 PBS 2 % NBCS의 두 밀리리터와 5 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브를 채웁니다.대퇴골을 집게로 잡고, 왼쪽 홈에 바늘을 삽입, 회전을 적용하여 슬개골 제거 후, 바늘이 완전히 뼈에 삽입되도록, 벨까지. 바늘 삽입 후, PBS 2 %NBCS의 두 밀리리터를 포함하는 튜브에 바늘로 뼈를 전송. 그런 다음 PBS 2%NBCS를 주사기에서 뼈가 맑을 때까지 분배하고 흡인시합니다.대퇴골에서 바늘을 제거하고 대퇴골 머리가 있던 반대쪽구멍에 삽입합니다. 버퍼를 분배하고 흡입한 후 뼈를 버리십시오. 일강 문장과 경골의 경우, 포셉을 사용하여 뼈를 잡고 회전을 적용하여 열린 쪽에 바늘을 부드럽게 삽입하십시오.바늘이 완전히 뼈에 삽입되도록, 베벨까지. 그런 다음 바늘로 뼈를 PBS 2%NBCS의 2밀리리터를 포함하는 튜브로 옮킨다. 뼈가 명확해질 때까지 PBS 2%NBCS를 주사기에서 분배하고 흡인시합니다.40 미크로넨 셀 스트레이너 캡을 통해 모든 세포 서스펜션을 전달하고 멸균 5 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 배치하고 PBS 2 % NBCS의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 총 골수로 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 따로 둡니다. 그런 다음 염색 절차를 위해 얼음에 보관하십시오.원심분리에 의해 여과된 서스펜션을 펠렛. 상체를 폐기한 후, 갓 준비된 1차 항체 칵테일에 펠릿을 30~45분 간 얼음에 잠식합니다. 세포 현탁액 10마이크로리터를 멸균 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 넣고 린 포레스 분획으로 표시하고 PBS 2%NBCS의 마이크로리터 90개추가 추가합니다.한편, 30초 동안 철저한 소용돌이로 바이알에서 재연하여 자기 고갈을 위한 구슬을 준비한다. 대상 셀 당 두 개의 구슬에 해당하는 구슬의 부피를 5 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 옮기고, PBS 2%NBCS를 사용하여 구슬을 두 번 세척하여 자석에 튜브를 배치합니다. 멸균 유리 파스퇴르 파이펫으로 세척 버퍼를 제거 한 후, 멸균 PBS 2 % NBCS의 500 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다.자기 고갈의 첫 번째 단계의 경우, 세척 된 세포의 펠릿에 250 마이크로 리터의 구슬을 추가하고 얼음에 5 분 동안 부드러운 혼합으로 인큐베이션하십시오. 그런 다음 부드러운 혼합으로 멸균 PBS 2 % NBCS의 2 밀리리터를 추가하고 2 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 멸균 유리 파스퇴기 파이펫으로 비자기 분획을 수집합니다.그리고 자기 고갈의 두 번째 단계에 대해, 자기 구슬의 나머지 250 마이크로 리터에 추가합니다. 튜브 롤러에 파라핀으로 밀봉 된 튜브를 섭씨 4도에서 20 분 동안 놓습니다. 그런 다음 부드러운 믹싱으로 멸균 PBS 2 % NBCS의 2 밀리리터를 추가합니다.그리고 2 분 동안 자석으로 튜브를 배치합니다. 비자기 분획을 멸균 유리 파스트렐러 파이펫으로 라벨이 붙은 비자기 린 네그 분획으로 비자기 분획을 수집하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 메가카요사이클프 선조를 분류하는 셀 을 진행한다. 세포 선별을 위한 게이팅 전략의 경우, 린 네이 포집단에서 C 키트를 발현하는 세포, 및 Sca-1 또는 CD16/32 항원의 발현이 낮거나 전혀 없는 것이 선택된다.이 인구에서 MEP는 CD150 양성 및 CD9 딤 셀로 식별됩니다. MKP는 CD150 양성 및 CD9 밝은 셀로 합니다. 대표적인 유동 세포분석에서 MEP 및 Mkp로 확인된 세포는, CD41a, CD42c 고전적인 마커, 메가카요시틱 및 혈소판 혈통의 형광 컨쥬게이징 항체로 표지되었다.두 마커모두 MKp 집단의 세포에 의해 발현되었고, MEP 집단의 세포의 표면에서 검출되지 않았다. 정렬 된 메가 카요세포의 DNA 함량은 세포가 MEP 집단을 위해 대부분 2n임을 입증했습니다. 그리고 MKp 세포의 작은 부분은 외국이다.더 높은 계피 세포는 이 인구에서 현저하게 검출되지 않았습니다. 반고체 종양 학적 인 암투술에서 CFU-MK는 MEP 및 MKp 인구 모두에서 검출되었습니다. BFU-E는 MKp 인구에서 검출되지 않았지만 MEP및 CD150 음성 CD9 딤선조 세포 집단에서 검출되었다.분화의 셋째 날에 현미경 관찰, MEP와 MKp는 큰 세포로 확인 된 주로 거대 카르요 세포를 생산 것을 보여줍니다. 3일간의 배양 후 얻어진 메가카요세포는 CD41 및 CD42c 발현을 사용하여 확인되었으며, MEP 및 MKp 세포 집단으로부터 생성된 세포의 54%, 및 82%를 각각 나타낸다. 생성된 거대 카르요세포의 계골은 MEP 인구에 비해 MKp 인구에서 파생된 거대 카르요세포로부터 더 컸다.MKp 인구에서 파생된 세포만이 프로플라틀렛 방출이 가능하여 MKp 인구에 대한 보다 진보된 성숙 단계를 시사했습니다. 골반 뼈의 사용은 세포 수로 크게 증가하고 2 단계 자기 고갈은 계보 고갈의 효능을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 단일 세포의 MEP 및 MKp 집단의 후속 배양을 허용하며, 전사 및 프로테오믹 분석과 함께, 확실히 관련된 메커니즘을 해독해야 할 것입니다, 구현 된 생물 발생.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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