Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Моник Фройнд, Катрин Циссель и Кетти за техническую помощь. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в области медицины и санте publique) и грантом ANR-17-CE14-0001-01 для Henri.de la. Саль.

Протоколы с участием животных были выполнены в соответствии с Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Номер разрешения: E67-482-10).
1. Коллекция мышиных костей
<ol><li>Приносить животное в жертву...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

Способ, описанный в данной работе, позволяет экстракцию и очистку мышиных MEP и MKp. Важным параметром в оптимизации протокола было получение достаточного количества клеток, которые были бы совместимы с большинством молекулярных и клеточных анализов. Общая практика сбора костной ткани м?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Тромбоциты крови вырабатываются мегакариоцитами. Эти крупные полиплоидные клетки расположены в костном мозге и, как и все клетки крови, получены из гемопоэтических стволовых клеток (HSC)1. Классический путь производства мегакариоцитов в костном мозге берет свое начало от ГСК и предполагает генерацию различных прародителей, которые постепенно ограничивают их дифференцировальный потенциал2. Первым прародителем, подписавшим обязательство по мегакариоцитарной линии, является мегакариоцит-эритроцитарный прародитель (MEP), бипотентный прародитель, способный продуцировать как эритроидныеклетки,так и мегакариоциты3,4,5. Затем MEP производит унипотентный предшественник / предшественник (MKp), который будет дифференцироваться в зрелый мегакариоцит, способный продуцировать тромбоциты. Механизмы, участвующие в генерации этих прародителей, а также их дифференцировка и созревание в мегакариоциты сложны и понятны лишь частично. Кроме того, гетерогенность популяции MEP с точки зрения потенциала дифференцировки и внутреннего уровня приверженности этих клеток все еще неясна. Чтобы расшифровать эти процессы, важно получить (или иметь доступ) очищенные популяции MEP и MKp для тонкомолекулярного и одноклеточного анализа.
Несколько исследований продемонстрировали особые комбинации маркеров клеточной поверхности для идентификации прародителей, приверженных мегакариоцитарной линии у мышей6,7,8. Из них был разработан метод, позволяющий очищать MEP и MKp от мышей. Этот метод был оптимизирован для получения клеток в достаточном количестве и качестве для большого количества анализов. С учетом этических соображений и для того, чтобы свести к минимуму количество животных, участвующих в экспериментах, мы собрали костный мозг из бедренной и большеберцовой костей, а также из подвздошного гребня. Эта кость содержит высокую частоту и количество кроветворных прародителей и большую часть времени повреждается во время длительного сбора костной ткани. Здесь представлен подробный метод надежного сбора этой кости.
Вторым критерием оптимизации является создание высокоочищеных клеточных популяций. Флуоресцентная активированная сортировка клеток (FACS) является методом выбора для получения очищенных популяций интересующих клеток. Тем не менее, низкие урожаи достигаются, когда интересуемая популяция клеток очень редка. Таким образом, необходимы процедуры обогащения. В этом протоколе была выбрана процедура отрицательного отбора с использованием магнитных шариков.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

Мегакариоциты костного мозга представляют собой крупные полиплоидные клетки, обеспечивающие выработку тромбоцитов крови. Они возникают из гемопоэтических стволовых клеток через мегакариопоэз. Заключительные этапы этого процесса сложны и классически включают бипотентные мегакариоцитарно-эритроцитарные прародители (MEP) и унипотентные мегакариоцитарные прародители (MKp). Эти популяции предшествуют образованию настоящих мегакариоцитов, и, как таковые, их выделение и характеристика могут позволить провести надежный и непредвзятый анализ образования мегакариоцитов. В этом протоколе подробно представлена процедура сбора кроветворных клеток из костного мозга мыши, обогащение гемопоэтических прародителей путем магнитного истощения и, наконец, стратегия сортировки клеток, которая дает высокоочищенные популяции MEP и MKp. Во-первых, клетки костного мозга собираются из бедренной кости, большеберцовой кости, а также подвздошного гребня, кости, которая содержит большое количество кроветворных прародителей. Использование костей подвздошного гребня резко увеличивает общее количество клеток, получаемых на мышь, и, таким образом, способствует более этичному использованию животных. Истощение магнитной линии было оптимизировано с использованием магнитных шариков 450 нм, что позволило очень эффективно сортировать ячейки с помощью проточной цитометрии. Наконец, в протоколе представлена стратегия маркировки и сортировки двух высокоочищеных популяций-прародителя мегакариоцитов: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim)и MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Этот метод прост в реализации и обеспечивает достаточно клеточного материала для выполнения i) молекулярной характеристики для более глубокого знания их идентичности и биологии, ii) анализов дифференцировки in vitro, которые обеспечат лучшее понимание механизмов созревания мегакариоцитов, или iii) in vitro моделей взаимодействия с их микросредой.

Фенотипический анализ клеток, идентифицированных как MEP и MKp, проводили методом проточной цитометрии. Клетки были помечены флуоресцентными конъюгированными антителами к CD41a и CD42c, классическим маркерам мегакариоцитарных и тромбоцитарных линий. Оба маркера были экспрессированы клетка?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Этот метод описывает очистку с помощью проточной цитометрии MEP и MKp от бедренных костей, большеберцовой кости и костей таза мышей.

Выделение прародителей мегакариоцитов мыши

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Выделение ключевых популяций-прародителя мегакариоцитов позволяет провести тонкий анализ иерархии линий в клеточной культуре на молекулярных анализах, вплоть до уровня одной клетки. Этот протокол сочетает в себе более этичную практику, сводя к минимуму количество необходимых животных в эффективном процессе сортировки клеток популяций MEP и MKP. Для кости спрей для сбора распылит тело восьми-12-недельной черной шестимышечного C57 с 70% этанолом.Используйте ножницы, чтобы сделать точечный пяти-сантиметровый разрез кожи, перпендикулярный позвоночнику. И разорвать кожу по всему телу, потянув ее вниз. Поместите мышь лицевой стороной вниз на подушечку для рассечения, затем найдите тазовые кости, скользя пальцами или ножницами, вдоль открытого позвоночника, сверху вниз.Чтобы найти подвздошный гребень, определите небольшую шишку в поясничной области возле задних конечностей. Положив ножницы параллельно позвоночнику, против позвонков и вплотную к бугоре подвздошного гребня, приступайте к разрезанию мышц вдоль стороны позвоночника над тазовой костью, скользя ножницами вдоль позвонков, вниз к хвосту. Затем разрезают между позвонками и подвздошной гребнем, оставаясь как можно ближе к позвонку.И отрежьте оставшиеся мышцы, чтобы отсоедать конечность от тела. Перенесите отслоившенные конечности на чистую поверхность. После отбрасывания остальной части тела в соответствии с институциональными рекомендациями используйте щипцы и скальпели, чтобы обнажить тазовые, бедренные и большеберцовые кости, удалив окружающие ткани.Используйте щипцы, чтобы удерживать дистальный конец бедренной кости, и осторожно вывихнуть головку бедренной кости от тазовой кости, осторожно нарезая мышцы вокруг сочленения скальпелем. Соскоблите оставшуюся мышцу с тазовой кости и вырежьте в середине полости, которая удерживала головку бедренной кости. Сохраните подвздошную кость и отбросьте треугольную тонкую сторону кости.Используя скальпель, удалите остаточные ткани вокруг подвздошной кости и поместите очищенную кость в стерильный PBS, дополненный сывороткой 2% newborn Calf Serum. Затем с помощью ножниц отрежьте ногу от ноги на лодыжке. Удерживая нижнюю часть большеберцовой кости щипцами, соскоблите мышцу вверх к колену.Отбросьте малоберцовую киболу. Затем сделайте разрез по большеберцовой кости плато скальпелем и поместите большеберцовую кость в стерильный PBS 2%NBCS. После удаления остаточных тканей вокруг бедренной кости удерживайте верхнюю сторону бедренной кости щипцами, а лезвие скальпеля поместите у основания коленной чашечки.Приложи усилие к коленной чашечке, параллельно бедренной кости, чтобы отсоедить коленную чашечку. Затем поместите бедренную комочку, в стерильный PBS 2%NBCS. В ламинарной проточной шкафу переложите кости в стерильную чашку Петри, наполненную стерильным PBS 2%NBCS.Используйте скальпель, чтобы отрезать головку бедренной кости. Наполните шприц на один миллилитр стерильным PBS 2% NBCS и прикрепите к розетке иглу 21 калибра. Затем заполните пятимиллилитровую полипропиленовую трубку двумя миллилитрами стерильного PBS 2%NBCS.Удерживая бедренную кость щипцами, вставьте иглу в канавку слева, после снятия коленной чашечки, применив вращение, убедившись, что игла полностью вставлена в кость, вплоть до скоса. После введения иглы переведите кость с иглой в трубку, содержащую два миллилитра PBS 2%NBCS. Затем дозируют и аспирируют PBS 2% NBCS, из шприца до тех пор, пока кость не очистится.Извлеките иглу из бедренной кости, и вставьте ее в отверстие на противоположной стороне, где находилась головка бедренной кости. После дозирования и аспирации буфера отбросьте кость. Для подвздошного гребня и большеберцовой кости используйте щипцы, чтобы удерживать кость и осторожно вставить иглу в открытую сторону, применяя вращение.Обеспечение того, чтобы игла была полностью вставлена в кость, вплоть до скоса. Затем переведите кость с иглой в трубку, содержащую два миллилитра PBS 2%NBCS. Дозировать и аспирировать PBS 2% NBCS из шприца до тех пор, пока кость не очистится.Пропустите всю клеточную суспензию через 40-микроновый колпачок клеточного сетчатого фильтра, помещенный на стерильную пятимиллилитровую полистирольную трубку, и добавьте 500 микролитров PBS 2% NBCS. Отложите в сторону 100 микролитров клеточной суспензии в качестве общего костного мозга. Затем храните его на льду для процедуры окрашивания.Гранулировать фильтрованную суспензию центрифугированием. После выброса супернатанта повторно суспендировать гранулу в свежеприготовленном коктейле первичных антител с инкубацией на льду в течение 30-45 минут. Отложите 10 микролитров клеточной суспензии в стерильную пятимиллилитровую полистирольную трубку с маркировкой Lin Pores Fraction и добавьте 90 микролитров PBS 2% NBCS.Тем временем подготовьте бусины для магнитного истощения, повторно развернув их во флаконе, с тщательным вихрем в течение 30 секунд. Переложите объем бусин, соответствующий двум шарикам на целевую ячейку, в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку и дважды промыть бусины с PBS 2% NBCS, поместив трубку на магнит. После снятия промывного буфера стерильной стеклянной пастерной пипеткой повторно суспендировали бусины в 500 микролитрах стерильного PBS 2%NBCS.Для первого этапа магнитного истощения добавьте 250 микролитров бусин на гранулу промытых клеток и высиживайте с мягким перемешиванием в течение пяти минут на льду. Затем добавьте два миллилитра стерильного PBS 2%NBCS, с мягким перемешиванием, и поместите трубку в магнит на две минуты. Приступайте к сбору ноголентической фракции стерильной стеклянной пастерной пипеткой.А для второго шага магнитного истощения добавьте его к оставшимся 250 микролитрам магнитных шариков. Поместите тюбик, запечатанный парафином, на трубчатый валик, на 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем добавьте два миллилитра стерильного PBS 2%NBCS с мягким перемешиванием.И поместите трубку с магнитом на две минуты. Соберите немагнитную фракцию в стерильную пятимиллилитровую полипропиленовую трубку, меченую, немагнитную фракцию Лин Нег, со стерильной стеклянной пипеткой пастрера и приступайте к сортировке клеток-прародителей мегакариоцитов, как описано в текстовой рукописи. Для стратегии сортировки клеток в популяции Лин Нег выбираются клетки, экспрессирующие С-кит, и низкая или нулевая экспрессия антигена Sca-1 или CD16/32.В этой популяции MEP идентифицируются как CD150 положительные и CD9 тусклые клетки. MKP как CD150 положительные, так и CD9 яркие клетки. В репрезентативном анализе проточной цитометрии клетки, идентифицированные как MEP и Mkp, были помечены флуоресцентными конъюгированными антителами к CD41a и классическим маркерам CD42c мегакариоцитарных и тромбоцитарных линий.Оба маркера были экспрессированы клетками популяции MKp и не были обнаружены на поверхности клеток популяции MEP. Содержание ДНК отсортированных мегакариоцитов продемонстрировало, что клетки в основном 2n для популяции MEP. И небольшая часть клеток MKp является чужеродной.Клетки с более высокой плоидией не были значительно обнаружены в этих популяциях. В полутвердых клоногенных анализах КОЕ-МК был обнаружен как в популяциях MEP, так и mKp. BFU-E не был обнаружен в популяции MKp, но обнаружен в MEP и CD150 отрицательной CD9 популяции клеток-прародителя.Микроскопические наблюдения на третий день дифференцировки показывают, что MEP и MKp продуцируют в основном мегакариоциты, идентифицированные как крупные клетки. Мегакариоциты, полученные после трех дней культивированности, были идентифицированы с использованием экспрессии CD41 и CD42c и представляют собой 54 и 82% клеток, продуцированных из клеточных популяций MEP и MKp соответственно. Плоидия вырабатываемых мегакариоцитов была больше из мегакариоцитов, полученных из популяции MKp, по сравнению с популяцией MEP.Только клетки, полученные из популяции MKp, были способны к проплатлетной эмиссии, что предполагает более продвинутую стадию созревания для популяции MKp. Использование тазовой кости резко увеличивает количество клеток, в то время как двухступенчатое магнитное истощение повышает эффективность истощения линии. Этот протокол позволяет проводить последующую культивирование ПОПУЛЯЦИИ MEP и MKp одиночных клеток, которые вместе с транскриптомическим и протеомным анализом непременно должны будут расшифровать задействованные механизмы, реализованные биогенезом.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Мышь надпочечников сотовый хромаффинных Изоляция

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Mouse Dorsal Forebrain Explant Isolation

Мышь Спинной изоляции эксплантов переднего мозга

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Очистка прародителей из скелетных мышц

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Выделение и Культура неонатологическую мыши кардиомиоцитов

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Выделение и физиологический анализ мыши кардиомиоцитов

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...