Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Monique Freund, Catherine Ziessel y Ketty por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), y por Grant ANR-17-CE14-0001-01 a Henri.de la. Salle.

Los protocolos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Número de permiso: E67-482-10).
1. Colección de hueso de ratón
<ol><li>Sacrificar al animal de acuerdo con los lineamientos institucionales. NOTA: Los datos presentados en este manuscrito se obtuvieron de ratones C57Bl/6 de 8 a 12 semanas de edad. El n...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

El método descrito en este documento permite la extracción y purificación de MEP y MKp de ratón. Un parámetro importante en la optimización del protocolo fue obtener un número suficiente de células que fueran compatibles con la mayoría de los ensayos moleculares y celulares. La práctica general de la recolección de hueso de ratón para la extracción de células hematopoyéticas generalmente consiste en cosechar tanto los fémures como las tibias de cada ratón. Por lo tanto, el hueso pélvico, otra fuente de ...

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Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Las plaquetas sanguíneas son producidas por los megacariocitos. Estas grandes células poliploides se localizan en la médula ósea y como para todas las células sanguíneas se derivan de las Células Madre Hematopoyéticas (HSC)1. La vía clásica de producción de megacariocitos en la médula ósea se origina a partir de HSC e implica la generación de diferentes progenitores que restringen progresivamente su potencial de diferenciación2. El primer progenitor que firma el compromiso con el linaje megacariocítico es el Progenitor Megacariocito-Eritrocito (MEP), un progenitor bipotente capaz de producir tanto células eritroides como megacariocitos3,4,5. El MEP produce entonces un progenitor/precursor unipotente (MKp) que se diferenciará en un megacariocito maduro capaz de producir plaquetas. Los mecanismos implicados en la generación de estos progenitores, así como su diferenciación y maduración en megacariocitos son complejos y sólo parcialmente comprendidos. Además, la heterogeneidad de la población DE MEP en términos de potencial de diferenciación y el nivel de compromiso intrínseco de estas células aún no están claros. Para descifrar estos procesos, es esencial obtener (o tener acceso a) poblaciones purificadas de MEP y MKp para análisis moleculares finos y unicelulares.
Varios estudios han demostrado combinaciones particulares de marcadores de superficie celular para la identificación de progenitores comprometidos con el linaje megacariocítico en elratón 6,7,8. A partir de estos se ideó un método que permite la purificación de MEP y MKp de ratones. Este método fue optimizado para obtener células en número y calidad adecuados para un gran número de ensayos. Con consideraciones éticas en mente, y con el fin de minimizar el número de animales involucrados en los experimentos, obtuvimos la recolección de la médula ósea del fémur y la tibia, y también de la cresta ilíaca. Este hueso contiene una alta frecuencia y número de progenitores hematopoyéticos y la mayoría de las veces se daña durante la recolección ósea larga. Aquí se presenta un método detallado para la recolección confiable de este hueso.
El segundo criterio de optimización es producir poblaciones celulares altamente purificadas. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) es un método de elección para obtener poblaciones purificadas de células de interés. Sin embargo, los bajos rendimientos se alcanzan cuando la población celular de interés es muy rara. Por lo tanto, son necesarios procedimientos de enriquecimiento. En este protocolo, se optó por un procedimiento de selección negativa utilizando perlas magnéticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

Los megacariocitos de la médula ósea son células poliploides grandes que aseguran la producción de plaquetas sanguíneas. Surgen de las células madre hematopoyéticas a través de la megacariopoyesis. Las etapas finales de este proceso son complejas y clásicamente involucran a los progenitores bipotentes de megacariocitos-eritrocitos (MEP) y los progenitores de megacariocitos unipotentes (MKp). Estas poblaciones preceden a la formación de megacariocitos de buena fe y, como tales, su aislamiento y caracterización podrían permitir el análisis robusto e imparcial de la formación de megacariocitos. Este protocolo presenta en detalle el procedimiento para recolectar células hematopoyéticas de la médula ósea de ratón, el enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos a través del agotamiento magnético y, finalmente, una estrategia de clasificación celular que produce poblaciones MEP y MKp altamente purificadas. Primero, las células de la médula ósea se recolectan del fémur, la tibia y también la cresta ilíaca, un hueso que contiene un alto número de progenitores hematopoyéticos. El uso de huesos de la cresta ilíaca aumenta drásticamente el número total de células obtenidas por ratón y, por lo tanto, contribuye a un uso más ético de los animales. Se optimizó un agotamiento del linaje magnético utilizando perlas magnéticas de 450 nm que permiten una clasificación celular muy eficiente por citometría de flujo. Finalmente, el protocolo presenta la estrategia de etiquetado y gating para la clasificación de las dos poblaciones progenitoras de megacariocitos altamente purificadas: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim)y MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9brillante) ). Esta técnica es fácil de implementar y proporciona suficiente material celular para realizar i) caracterización molecular para un conocimiento más profundo de su identidad y biología, ii) ensayos de diferenciación in vitro, que proporcionarán una mejor comprensión de los mecanismos de maduración de los megacariocitos, o iii) modelos in vitro de interacción con su microambiente.

El análisis fenotípico de las células identificadas como MEP y MKp se realizó mediante citometría de flujo. Las células fueron etiquetadas con anticuerpos conjugados de fluorescencia a CD41a y CD42c, marcadores clásicos de los linajes megacariocítico y plaquetario. Ambos marcadores fueron expresados por las células de la población MKp mientras que estos marcadores aún no se detectan en la superficie de las células de la población MEP (Figura 4Ai,4Aii). La polipl...

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Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

El aislamiento de poblaciones clave de progenitores de megacariocitos permite el análisis fino de la jerarquía de linaje en cultivo celular en ensayos moleculares, hasta el nivel de una sola célula. Este protocolo combina una práctica más ética al minimizar el número de animales requeridos, en un proceso eficiente para la clasificación celular de las poblaciones MEP y MKP. Para el hueso, rocíe el cuerpo de un ratón negro C57 de seis de ocho a 12 semanas de edad, con 70% de etanol.Use tijeras para hacer una incisión de cinco a un centímetro de la piel, perpendicular a la columna vertebral. Y rasgar la piel alrededor de todo el cuerpo, tirando de ella hacia abajo. Coloque el ratón boca abajo en la almohadilla de disección, luego ubique los huesos pélvicos deslizando los dedos o tijeras, a lo largo de la columna vertebral expuesta, de arriba a abajo.Para localizar la cresta ilíaca, identifique la pequeña protuberancia en la región lumbar cerca de las extremidades posteriores. Después de colocar las tijeras paralelas a la columna vertebral, contra las vértebras, y cerca de la protuberancia de la cresta ilíaca, proceda a cortar los músculos a lo largo del lado de la columna vertebral por encima del hueso pélvico, deslizando las tijeras a lo largo de las vértebras, hasta la cola. Luego corte entre las vértebras y la cresta ilíaca, permaneciendo lo más cerca posible de las vértebras.Y corte los músculos restantes para separar la extremidad del cuerpo. Transfiera las extremidades desprendidas a una superficie limpia. Después de desechar el resto del cuerpo de acuerdo con las pautas institucionales, use pórceps y bisturíes para exponer los huesos pélvicos, femorales y tibiales, mediante la eliminación del tejido circundante.Use forrceps para sostener el extremo distal del fémur y disloque cuidadosamente la cabeza femoral del hueso pélvico, cortando suavemente los músculos alrededor de la articulación con un bisturí. Raspe el músculo restante del hueso pélvico y corte en el medio de la cavidad que sostenía la cabeza femoral. Mantenga el ilion y deseche el lado delgado triangular del hueso.Usando un bisturí, retire los tejidos residuales alrededor del ilion y coloque el hueso limpio en PBS estéril suplementado con 2% Newborn Calf Serum. Luego use tijeras para cortar el pie de la pierna en el tobillo. Sosteniendo la parte inferior de la tibia con las pórceps, raspe el músculo hacia la rodilla.Deseche el peroné. Luego haga un corte a través de la meseta tibial con el bisturí y coloque la tibia en PBS estéril 2% NBCS. Después de extraer los tejidos residuales alrededor del fémur, sostenga la parte superior del fémur con bórceps y coloque la hoja del bisturí en la base de la rótula.Aplique una fuerza hacia la rótula, paralela al fémur para separar la rótula. Luego coloque el fémur, en PBS estéril 2% NBCS. En un gabinete de flujo laminar, transfiera los huesos a una placa de Petri estéril llena de PBS estéril 2% NBCS.Use un bisturí para cortar la cabeza de los fémures. Llene una jeringa de un mililitro con PBS estéril 2% NBCS y conecte una aguja de calibre 21 a la salida. Luego llene un tubo de polipropileno de cinco mililitros con dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS.Sosteniendo el fémur con fórceps, inserte la aguja en el surco izquierdo, después de la extracción de la rótula aplicando rotación, asegurándose de que la aguja se inserte completamente en el hueso, hasta el bisel. Después de la inserción de la aguja, transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene dos mililitros de PBS 2%NBCS. Luego dispense y aspire el PBS 2% NBCS, desde la jeringa hasta que el hueso esté claro.Retire la aguja del fémur e insértela en el orificio del lado opuesto, donde estaba la cabeza del fémur. Después de dispensar y aspirar el tampón, deseche el hueso. Para la cresta ilíaca y la tibia, use forrceps para sostener el hueso e inserte suavemente la aguja en el lado abierto, aplicando rotación.Asegurarse de que la aguja esté completamente insertada en el hueso, hasta el bisel. Luego transfiera el hueso con la aguja al tubo que contiene dos mililitros de PBS 2% NBCS. Dispense y aspire el PBS 2%NBCS de la jeringa hasta que el hueso esté claro.Pase toda la suspensión celular a través de una tapa de colador de células de 40 micras, colocada en un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros, y agregue 500 microlitros de PBS 2% NBCS. Reservar 100 microlitros de la suspensión celular como médula ósea total. Luego guárdelo en hielo para el procedimiento de tinción.Pellet la suspensión filtrada por centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a colocar el pellet en un cóctel de anticuerpos primarios recién preparado, con la incubación en hielo, durante 30 a 45 minutos. Apartar 10 microlitros de la suspensión celular en un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros, etiquetado como Lin Pores Fraction, y añadir 90 microlitros de PBS 2%NBCS.Mientras tanto, prepare una cuenta para el agotamiento magnético, resuspendiéndolas en el vial, con un vórtice completo durante 30 segundos. Transfiera un volumen de perlas correspondiente a dos perlas por celda objetivo, en un tubo de polipropileno de cinco mililitros, y lave las perlas dos veces, con PBS 2% NBCS, colocando el tubo en el imán. Después de retirar el tampón de lavado con una pipeta pasteur de vidrio estéril, vuelva a colocar las perlas en 500 microlitros de PBS estéril 2% NBCS.Para el primer paso del agotamiento magnético, agregue 250 microlitros de perlas sobre el pellet de células lavadas e incube con una mezcla suave durante cinco minutos en hielo. Luego agregue dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS, con una mezcla suave, y coloque el tubo en el imán durante dos minutos. Proceda a recoger la fracción no magnética con una pipeta pasteur de vidrio estéril.Y para el segundo paso del agotamiento magnético, agréguelo a los 250 microlitros restantes de cuentas magnéticas. Coloque el tubo sellado con parafina en un rodillo de tubo, durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Luego agregue dos mililitros de PBS estéril 2% NBCS con una mezcla suave.Y coloque el tubo con el imán durante dos minutos. Recoja la fracción no magnética en un tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros, etiquetado, fracción Lin Neg no magnética, con una pipeta pastreur de vidrio estéril, y proceda con la clasificación celular de los progenitores de megacariocitos, como se describe en el manuscrito de texto. Para la estrategia de gating para la clasificación celular, en la población de Lin Neg, se seleccionan las células que expresan C-kit y una expresión baja o nula del antígeno Sca-1 o CD16/32.En esta población, los MEP se identifican como células CD150 positivas y CD9 dim. El MKP como CD150 positivo, y las células brillantes CD9. En el Análisis de Citometría de Flujo representativo, las células identificadas como MEP y Mkp, fueron etiquetadas con anticuerpos conjugados de fluorescencia para cd41a, y marcadores clásicos CD42c, de los linajes megacariocítico y plaquetario.Ambos marcadores fueron expresados por las células de la población MKp, y no fueron detectados en la superficie de las células de la población MEP. El contenido de ADN de los megacariocitos clasificados, demostró que las células son en su mayoría 2n para la población MEP. Y una pequeña porción de las células MKp son extrañas.Las células de ploidy más altas no se detectaron significativamente en estas poblaciones. En ensayos clonogénicos semisólidos, se detectó UFC-MK en poblaciones de MEP y MKp. BFU-E no se detectó en la población MKp, pero se detectó en MEP y, la población de células progenitoras CD9 negativas CD150.La observación microscópica en el tercer día de diferenciación, muestra que MEP y MKp produjeron principalmente megacariocitos, identificados como células grandes. Los megacariocitos obtenidos después de tres días de cultivo, se identificaron utilizando la expresión de CD41 y CD42c, y representan el 54, y el 82% de las células producidas a partir de poblaciones de células MEP y MKp, respectivamente. La ploidía de los megacariocitos producidos, fue mayor a partir del megacariocito derivado de la población MKp, en comparación con la población MEP.Solo las células derivadas de la población MKp, fueron capaces de emisión de proplatelet, lo que sugiere una etapa de maduración más avanzada para la población MKp. El uso del hueso pélvico, aumenta drásticamente al número de células, mientras que el agotamiento magnético de dos pasos mejora la eficacia del agotamiento del linaje. Este protocolo permite el posterior cultivo de la población MEP y MKp de células individuales, que, junto con el análisis transcriptómico y proteómico, sin duda tendrá que descifrar los mecanismos implicados, implementados en la biogénesis.

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