Name: isolation of mouse megakaryocyte progenitors
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Yazarlar monique Freund, Catherine Ziessel ve Ketty'ye teknik yardım için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ve Grant ANR-17-CE14-0001-01 tarafından Henri.de la'ya desteklendi. Salle.

Hayvanları içeren protokoller, CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) uyarınca gerçekleştirildi. İzin Numarası: E67-482-10).
1. Fare kemiği koleksiyonu
<ol><li>Hayvanı kurumsal yönergelere uygun olarak kurban edin. NOT: Bu yazıda sunulan veriler 8 ila 12 haftalık C57Bl/6 farelerden elde edilmiştir. Elde edilen hücre sayısı ve atıf yapılan popülasyonların sıklığı ...

<ol>
	<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis.">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow.">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li><li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegu&#233;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2/flt3++multipotent+hematopoietic+progenitors.">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li><li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+bipotent+(erythroid+and+megakaryocytic)+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice.">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li><li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+phenotypic,+functional,+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy.">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li><li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors.">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li><li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+thrombopoietin+(TPO)-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential.">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors.">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li><li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors.">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li><li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement.">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage.">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).</li><li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias.">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li></ol>

Bu makalede açıklanan yöntem, fare MEP ve MKp'nin çıkarılmasına ve saflaştırılmasına izin verir. Protokolün optimizasyonunda önemli bir parametre, çoğu moleküler ve hücresel tabanlı tahlille uyumlu yeterli sayıda hücre elde etmekti. Hematopoetik hücre ekstraksiyonu için fare kemiği toplamanın genel uygulaması genellikle her farenin hem uyluk kemiğinin hem de kaval kemiğinin toplanmasından oluşur. Hematopoetik malzemenin başka bir kaynağı olan pelvik kemik, bu nedenle sıklıkla göz ardı ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" /> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Kan trombositleri megakaryositler tarafından üretilir. Bu büyük poliploid hücreler kemik iliğinde bulunur ve tüm kan hücrelerine gelince Hematopoetik Kök Hücrelerden (HSC) türetilirler1. Kemik iliğindeki megakaryositlerin klasik üretim yolu HSC'den kaynaklanır ve farklılaşma potansiyellerini giderek kısıtlayan farklı ataların neslini içerir2. Megakaryosit soyuna bağlılığı imzalayan ilk ata, hem eritroid hücreleri hem de megakaryositler3,4,5 üretebilen bir bipotent progenitör olan Megakaryosit-Eritrosit Progenitor'dur(MEP). MEP daha sonra trombosit üretebilen olgun bir megakaryosit olarak farklılaşacak tek kişilik bir ata /öncül (MKp) üretir. Bu ataların üretilmesinde yer alan mekanizmaların yanı sıra megakaryositlere farklılaşmaları ve olgunlaşmaları karmaşıktır ve sadece kısmen anlaşılmıştır. Ayrıca MEP popülasyonunun farklılaşma potansiyeli açısından heterojenliği ve bu hücrelerin içsel bağlılık düzeyi hala belirsizdir. Bu süreçleri deşifre etmek için, ince moleküler ve tek hücreli analizler için MEP ve MKp'nin saflaştırılmış popülasyonlarını elde etmek (veya bunlara erişmek) esastır.
Çeşitli çalışmalar, fare 6,7,8'dekimegakaryositik soyuna bağlı atalarıntanımlanması için hücre yüzeyi belirteçlerinin belirli kombinasyonlarını göstermiştir. Bunlardan MEP ve MKp'nin farelerden arındırılmasına izin sağlayan bir yöntem tasarlanmıştır. Bu yöntem, çok sayıda tahlil için yeterli sayıda ve kalitede hücre elde etmek için optimize edilmiştir. Etik hususları göz önünde bulundurarak ve deneylerde yer alan hayvan sayısını en aza indirmek için kemik iliğini femur ve kaval kemiğinden ve ayrıca iliak arktan hasat etmek için ortaya çıkarız. Bu kemik yüksek sıklıkta ve hematopoetik ataların sayısını içerir ve çoğu zaman uzun kemik hasadı sırasında hasar görür. Burada sunulan bu kemiğin güvenilir toplanması için ayrıntılı bir yöntemdir.
Optimizasyonun ikinci kriteri, yüksek oranda saflaştırılmış hücre popülasyonları üretmektir. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS), arıtılmış hücre popülasyonları elde etmek için tercih edilen bir yöntemdir. Bununla birlikte, ilgi hücre popülasyonu çok nadir olduğunda düşük verime ulaşılır. Bu nedenle zenginleştirme prosedürleri gereklidir. Bu protokolde manyetik boncuklar kullanılarak negatif bir seçim prosedürü tercih edildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Gr-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody B220-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mac-1-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD3e-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0031-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD4-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-9766-82</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD5-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD8a-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0081-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD127-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-1271-85</td>
			<td>Magnetic depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody TER119-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5921-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0451-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45-biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD9-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0091-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody&#160; c-kit-APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Sca-1-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD16/32-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0161-83</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD150-PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1502-82</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium StemSpan-SFEM</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10452395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>vWR Chemicals</td>
			<td>83813.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-120-AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>42011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet :&#160; DynaMag-5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megacult</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#04970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult SF M3436</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#03436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50750-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Cell Lysis solution</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12308009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>C-165-ASB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 mL syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 15mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5mL polystyrene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes with 70&#181;m cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554063</td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube roller</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>R3005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse megakaryocyte progenitors

Kemik iliği megakaryositleri kan trombositlerinin üretimini sağlayan büyük poliploid hücrelerdir. Megakaryopoez yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Bu sürecin son aşamaları karmaşıktır ve klasik olarak bipotent Megakaryosit-Eritrosit Progenitors (MEP) ve tek kişilik Megakaryosit Progenitors 'u (MKp) içerir. Bu popülasyonlar iyi niyetli megakaryositlerin oluşumundan önce gelir ve bu nedenle izolasyonları ve nitelemeleri megakaryosit oluşumunun sağlam ve tarafsız analizine izin verebilir. Bu protokol, fare kemik iliğinden hematopoetik hücreleri toplama prosedürünü, hematopoetik progenitörlerin manyetik tükenme yoluyla zenginleştirilmesini ve son olarak yüksek oranda saflaştırılmış MEP ve MKp popülasyonları veren bir hücre sıralama stratejisini ayrıntılı olarak sunar. İlk olarak, kemik iliği hücreleri femurdan, kaval kemiğinden ve ayrıca yüksek sayıda hematopoetik progenitör içeren bir kemik olan iliak arktan toplanır. İlyak tepe kemiklerinin kullanımı, fare başına elde edilen toplam hücre sayısını büyük ölçüde arttırır ve böylece hayvanların daha etik bir şekilde kullanılmasına katkıda bulunur. Manyetik soy tükenmesi, akış sitometrisine göre çok verimli bir hücre sıralamaya izin vererek 450 nm manyetik boncuk kullanılarak optimize edildi. Son olarak, protokol iki yüksek saflaştırılmış megakaryosit progenitör popülasyonunun sıralanması için etiketleme ve gating stratejisini sunar: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim)ve MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9parlak ). Bu tekniğin uygulanması kolaydır ve i) kimlikleri ve biyolojileri hakkında daha derin bir bilgi için moleküler karakterizasyon, ii) megakaryositlerin olgunlaşma mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacak in vitro farklılaşma tahlilleri veya iii) mikroçevrimle etkileşimin in vitro modellerini gerçekleştirmek için yeterli hücresel materyal sağlar.

MEP ve MKp olarak tanımlanan hücrelerin fenotipik analizi akış sitometrisi ile yapıldı. Hücreler, megakaryositik ve trombosit soylarının klasik belirteçleri olan CD41a ve CD42c'ye floresan konjuge antikorlarla etiketlendi. Her iki belirteç de MKp popülasyonunun hücreleri tarafından ifade edilirken, bu belirteçler MEP popülasyonunun hücrelerinin yüzeyinde henüz tespit edilmiştir (Şekil 4Ai,4Aii). Poliploidi megakaryositlerin ayırt edici özelliğidir. S?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors at JoVE.com

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Önemli Megakaryosit Progenitor popülasyonlarının izolasyonu, hücre kültüründeki soy hiyerarşisinin moleküler tahliller üzerinde tek hücre seviyesine kadar ince analizini sağlar. Bu protokol, MEP ve MKP popülasyonlarının hücre sıralamaları için verimli bir süreçte, gerekli hayvan sayısını en aza indirerek daha etik bir uygulamayı birleştirir. Kemik için, toplama sekiz ila 12 haftalık bir C57 siyah altı farenin gövdesini% 70 etanol ile püskürtün.Omurgaya dik olarak cildin beş ila bir santimetrelik bir kesisini yapmak için makas kullanın. Ve deriyi aşağı çekerek tüm vücudun etrafını parçala. Fareyi diseksiyon pedi üzerine yüzüstü yerleştirin, ardından parmakları veya makası açıkta kalan omurga boyunca yukarıdan aşağıya kaydırarak pelvik kemikleri bulun.İlyak armasını bulmak için, arka uzuvların yakınındaki bel bölgesindeki küçük tümseği tanımlayın. Makası omurgaya paralel, omurlara karşı ve iliak tepe tümseğine yakın yerleştirdikten sonra, omurganın yan tarafındaki kasları pelvik kemiğin üzerinde, makası omurlar boyunca kuyruğa doğru kaydırarak kesmeye devam edin. Daha sonra omurlar ve iliak tepe arasında keserek omurlara mümkün olduğunca yakın kalın.Ve uzuvları vücuttan ayırmak için kalan kasları kesin. Kopuk uzuvları temiz bir yüzeye aktarın. Vücudun geri kalanını kurumsal yönergelere uygun olarak attıktan sonra, çevredeki dokuyu çıkararak pelvik, femoral ve tibial kemikleri ortaya çıkarmak için neşter ve neşter kullanın.Uyluk kemiğinin distal ucunu tutmak için önlük kullanın ve eklem etrafındaki kasları bir neşterle hafifçe dilimleyerek femoral başı pelvik kemikten dikkatlice ayırın. Pelvik kemikten kalan kası kazıyın ve femoral başı tutan boşluğun ortasında kesin. İlyumu saklayın ve kemiğin üçgen ince tarafını atın.Neşter kullanarak, iliyumun etrafındaki artık dokuları çıkarın ve temizlenen kemiği% 2 Yenidoğan Baldır Serumu ile desteklenmiş steril PBS'ye yerleştirin. Daha sonra ayak bileğindeki ayağı bacaktan kesmek için makas kullanın. Kaval kemiğinin alt kısmını asalarla tutarak, kası dizine doğru kazıyın.Fibulayı atın. Daha sonra neşterle tibial plato boyunca bir kesim yapın ve kaval kemiğini steril PBS% 2 NBCS'ye yerleştirin. Uyluk kemiğinin etrafındaki artık dokuları çıkardıktan sonra, femurun üst tarafını asalarla tutun ve neşter bıçağını diz kapağının tabanına yerleştirin.Diz kapağını ayırmak için uyluk kemiğine paralel olarak diz kapağına doğru bir kuvvet uygulayın. Daha sonra uyluk kemiğini steril PBS% 2 NBCS'ye yerleştirin. Laminer akış kabininde, kemikleri steril PBS% 2 NBCS ile doldurulmuş steril bir Petri kabına aktarın.Uyluk kemiğinin başını kesmek için neşter kullanın. Bir mililitrelik şırıngayı steril PBS%2 NBCS ile doldurun ve prize 21 kalibrelik bir iğne takın. Daha sonra beş mililitrelik polipropilen tüpü iki mililitre steril PBS% 2 NBCS ile doldurun.Uyluk kemiğini uzunlakları tutarak, iğneyi sol oluğa, diz kapağı çıkarıldıktan sonra rotasyon uygulayarak, iğnenin tamamen kemiğe, eğime kadar yerleştirilmesini sağlayın. İğne takıldıktan sonra, iğne ile kemiği iki mililitre PBS% 2 NBCS içeren tüpe aktarın. Daha sonra PBS%2 NBCS'yi şırınnadan kemik temiz olana kadar dağıtın ve aspire edin.İğneyi uyluk kemiğinden çıkarın ve uyluk kafasının olduğu karşı taraftaki deliğe yerleştirin. Tamponu dağıttıktan ve aspire ettikten sonra kemiği atın. İlyak tepesi ve kaval kemiği için, kemiği tutmak için forseps kullanın ve dönüşü uygulayarak iğneyi hafifçe açık tarafa yerleştirin.İğnenin tamamen kemiğe, eğime kadar sokulmasını sağlamak. Daha sonra iğne ile kemiği iki mililitre PBS% 2 NBCS içeren tüpe aktarın. PBS%2 NBCS'yi şırınnadan kemik temizlenine kadar dağıtın ve aspire edin.Tüm hücre süspansiyonunu steril beş mililitre polistiren tüpe yerleştirilen 40 mikron hücreli süzgeç kapağından geçirin ve 500 mikrolitre PBS% 2 NBCS ekleyin. Hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini toplam kemik iliği olarak ayırın. Daha sonra boyama işlemi için buzda saklayın.Filtrelenmiş süspansiyonu santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatant attıktan sonra, peletin taze hazırlanmış bir birincil antikor kokteylinde, buz üzerinde inkübasyonla birlikte 30 ila 45 dakika boyunca yeniden süzülün. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini Lin Gözenekleri Fraksiyonu etiketli steril beş mililitre polistiren tüpe ayırın ve 90 mikrolitre PBS% 2 NBCS ekleyin.Bu arada, 30 saniye boyunca kapsamlı girdap ile şişede yeniden oluşturarak manyetik tükenme için bir boncuk hazırlayın. Hedef hücre başına iki boncuklara karşılık gelen bir boncuk hacmini beş mililitre polipropilen tüpe aktarın ve mıknatısın üzerine tüp yerleştirerek boncukları PBS% 2 NBCS ile iki kez yıkayın. Yıkama tamponunu steril bir cam pastör pipetle çıkardıktan sonra, boncukları 500 mikrolitre steril PBS% 2 NBCS'de yeniden ıslatın.Manyetik tükenmenin ilk adımı için, yıkanmış hücrelerin peletine 250 mikrolitre boncuk ekleyin ve buzda beş dakika boyunca hafif karıştırma ile kuluçkaya yatırın. Daha sonra iki mililitre steril PBS% 2 NBCS ekleyin, nazik karıştırma ile ve tüpü iki dakika boyunca mıknatısa yerleştirin. Manyetik olmayan fraksiyonu steril bir cam pastör pipetle toplamaya devam edin.Ve manyetik tükenmenin ikinci adımı için, kalan 250 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Parafinle kapatılmış tüpü dört santigrat derecede 20 dakika boyunca bir tüp silindirine yerleştirin. Daha sonra nazik karıştırma ile iki mililitre steril PBS% 2 NBCS ekleyin.Ve tüpü mıknatısla iki dakika yerleştirin. Manyetik olmayan fraksiyonu steril bir cam pastör pipet ile etiketli, manyetik olmayan Lin Neg Fraksiyonu etiketli steril bir beş mililitre polipropilen tüpüne toplayın ve metin el yazmasında açıklandığı gibi hücre sıralama megakaryositleri progenitörlerine devam edin. Hücre sıralama için gating stratejisi için, Lin Neg popülasyonunda, C-kitini ifade eden hücreler ve Sca-1 veya CD16/32 antijeninin düşük veya hiç ifade edilemez bir ifadesi seçilir.Bu popülasyonda MEP, CD150 pozitif ve CD9 dim hücreleri olarak tanımlanır. CD150 pozitif ve CD9 parlak hücreler olarak MKP. Temsili Akış SitometriSi Analizi'nde, MEP ve Mkp olarak tanımlanan hücreler, megakaryositik ve trombosit soylarının CD41a ve CD42c klasik belirteçleri için floresan konjuge antikorlarla etiketlenmiştir.Her iki belirteç de MKp popülasyonunun hücreleri tarafından ifade edildi ve MEP popülasyonunun hücrelerinin yüzeyinde tespit edildi. Sıralanmış megakaryositlerin DNA içeriği, hücrelerin MEP popülasyonu için çoğunlukla 2n olduğunu göstermiştir. Ve MKp hücrelerinin küçük bir kısmı yabancıdır.Bu popülasyonlarda daha yüksek ploidy hücreleri önemli ölçüde saptamamıştır. Yarı katı klonojenik tahlillerde hem MEP hem de MKp popülasyonlarında CFU-MK saptanmıştır. BFU-E, MKp popülasyonunda saptanmamış, mep ve CD150 negatif CD9 dim progenitor hücre popülasyonunda saptanmıştır.Farklılaşmanın üçüncü gününde mikroskobik gözlem, MEP ve MKp'nin esas olarak büyük hücreler olarak tanımlanan megakaryositler ürettiğini göstermektedir. Üç günlük kültürden sonra elde edilen megakaryositler CD41 ve CD42c ekspresyolu kullanılarak tanımlanmıştır ve sırasıyla MEP ve MKp hücre popülasyonlarından üretilen hücrelerin% 54'ünü ve% 82'sini temsil eder. Üretilen megakaryositlerin ploidy'si, MKp popülasyonundan elde edilen megakaryositten daha büyüktü, MEP popülasyonu ile karşılaştırıldığında.Sadece MKp popülasyonundan elde edilen hücreler, proplatelet emisyonu yeteneğine sahipdi ve bu da MKp popülasyonu için daha gelişmiş bir olgunlaşma aşaması olduğunu düşündürmektedir. Pelvik kemiğin kullanımı, hücre sayısına büyük ölçüde artarken, iki adımlı manyetik tükenme, soy tükenmesinin etkinliğini artırır. Bu protokol, transkriptomik ve proteomik analiz ile birlikte biyogenez uygulayan ilgili mekanizmaları kesinlikle deşifre etmek zorunda kalacak olan tek hücreli MEP ve MKp popülasyonunun sonraki kültürüne izin verir.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Fare Adrenal Kromafin Hücre İzolasyonu

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Mouse Dorsal Forebrain Explant Isolation

Fare Dorsal önbeyin Eksplant İzolasyon

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...