Name: analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل معهد فرانسيس كريك ، الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (FC001042 و FC001162) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (FC001042 و FC001162) ، وصندوق ويلكوم (FC001042 و FC001162) وجائزة ويلكوم ترست للباحث إلى JPS (108012 / Z / 15 / Z). شارك في تمويل العمل في جامعة كامبريدج مركز كامبريدج للأبحاث الطبية الحيوية التابع للمؤسسة الوطنية لحقوق الإنسان، وصندوق إيفلين (16/21)، وصندوق روزتريز الاستئماني (M590)، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MR/S009752/1). الجائزة الأخيرة الممولة من المملكة المتحدة هي جزء من برنامج EDCTP2 الذي يدعمه الاتحاد الأوروبي.

<ol>
	<li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+transient+assay+for+studying+the+genetic+determinants+of+Fv1+restriction.">Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).</li><li>Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trim5alpha+protein+restricts+both+HIV-1+and+murine+leukemia+virus.">Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).</li><li>Arnold, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-dependent+regulation+of+SAMHD1+oligomerisation+couples+catalysis+and+restriction.">Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction.</a> PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).</li><li>Groom, H. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+xenotropic+murine+leukaemia+virus-related+virus+in+UK+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome.</a> Retrovirology. 7, 10 (2010).</li><li>Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+entry+mediated+by+receptor+priming+and+low+pH+triggering+of+an+envelope+glycoprotein.">Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein.</a> Cell. 103 (4), 679-689 (2000).</li><li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+virus+capsids+require+the+cognate+envelope+protein+for+particle+export.">Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export.</a> Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bainbridge, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+to+the+mouse+eye+using+an+HIV-based+lentiviral+vector;+efficient+long-term+transduction+of+corneal+endothelium+and+retinal+pigment+epithelium.">In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium.</a> Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+interferon-stimulated+genes+with+antiretroviral+activity.">Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity.</a> Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculating+HIV-1+infectious+titre+using+a+virtual+TCID50+method.">Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).</li><li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+enhances+nucleoside-analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells.">SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824 (2017).</li><li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+specifically+affects+the+antiviral+potency+of+thymidine+analog+HIV+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).</li><li>Huber, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+has+differential+impact+on+the+efficacies+of+HIV+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).</li><li>Amie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+(dNTP)+levels.">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li><li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1.">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li></ol>

لغرض الوصول المفتوح، قام المؤلفون بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي إصدار مخطوطة مقبولة من المؤلف ينشأ عن هذا التقديم. الآراء المعرب عنها هي آراء المؤلف (المؤلفين) وليس بالضرورة آراء المؤسسة الوطنية لحقوق الإنسان أو وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية.

كما نوقش في الملاحظات أعلاه ، تتمحور الجوانب الحرجة للبروتوكول حول الاحتفاظ بالنمط الظاهري الصحيح للخلية لإنتاج VLP ولخلق البيئة المناسبة لمراقبة قيود SAMHD1. أولا ، يعتمد التحليل الدقيق للتقييد بواسطة قياس التدفق الخلوي بلونين على تحقيق نسب مناسبة من الخلايا المحولة والمصابة بحيث يكون هناك ما يكفي من الخلايا في كل منطقة من مناطق المخطط للتحليل. على هذا النحو ، يجب أن يهدف الباحث إلى الحصول على وزارة الداخلية أقل من 1 (انظر البروتوكول). تؤدي معدلات النقل والعدوى التي تكون إما مرتفعة جدا أو منخفضة جدا إلى مشاكل في التحليل بسبب نقص الخلايا غير المصابة أو المصابة بشكل مضاعف. وبالمثل ، فإن معدل نقل مماثل لمتجهات SAMHD1 المراد مقارنتها هو المفتاح للسماح بتطبيق نفس مصفوفة التعويض والبوابة على التجربة بأكملها ، مما يزيد من الثقة في التحليل اللاحق.
ثانيا ، يعد عمر خلايا U937 المستخدمة عاملا رئيسيا في ما إذا كانت تفرق بنجاح. يمكن رصد التمايز الناجح من خلال مراقبة الالتزام ، وتقليل تحمض الوسائط بمرور الوقت بعد التمايز والتقييد الكافي من قبل التحكم الإيجابي للنوع البري في الفحص. كان التمايز لمدة تصل إلى 5 أيام ناجحا.
واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الفحص هي مرونته. يمكن اختبار مجموعة متنوعة من الإصدارات المعدلة من SAMHD1 (المجالات والأحماض الأمينية وتسلسل الأنواع) عن طريق الطفرات البسيطة الموجهة للموقع للناقل أو الاستنساخ. وبالمثل ، يمكن استكشاف متغيرات فيروس المختبر. وقد استخدم الفحص سابقا لإثبات أن طفرات النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 مع انخفاض القدرة على ربط dNTP هي أكثر حساسية لتقييد SAMHD1. يمكن استخدام نفس المبدأ لاختبار تقييد الفيروسات الأخرى بواسطة SAMHD1. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام ظروف التمايز المختلفة أو التلاعب الاصطناعي بتركيزات dNTP داخل الخلايا لزيادة التحقيق في التفاعل بين الظروف داخل الخلايا ونشاط SAMHD1 ، وهو مجال للبحث النشط في مختبر بيشوب. كما تم وصف تفاعل SAMHD1 مع مختلف مثبطات النسخ العكسي للنيوكليوزيد ، وأظهر تأثير SAMHD1 باستخدام هذا الفحص المعدل للاستخدام في الخلايا الأولية12،13،14،15.
إن تكييف البروتوكول للاستخدام في الخلايا الأولية يتغلب على القيود التي يفرضها فحص الأنماط الظاهرية الأيضية في الخلايا المتحولة. ومع ذلك ، فإن التنسيق الحالي يسمح ببروتوكول مناسب وأقل تحديا من الناحية الفنية لتحليل الإنتاجية العالية ، خاصة مع استخدام مقياس التدفق الخلوي مع جهاز أخذ عينات عالي الإنتاجية. عند تكييف البروتوكول ، ينبغي النظر في قابلية الخلايا غير المحولة داخليا لتأثيرات المارة (مثل الإشارات المناعية).
كما هو الحال مع العديد من جوانب بيولوجيا الخلية ، من الضروري استخدام هذه المقايسات كجزء من نهج شامل لفهم ظاهرة معينة. إن الاستخدام المتوازي للمقايسات البيوكيميائية لنشاطSAMHD1 16 ، والقياس الكمي لبرك dNTP داخل الخلايا ، ومراقبة الأنماط الظاهرية الطافرة SAMHD1 في البشر ، خارج الجسم الحي وفي النماذج الحيوانية (التي تقوم بها المختبرات في جميع أنحاء العالم ، وبعضها موصوف في هذا العدد) هي المفتاح للفهم المتطور لهذا البروتين المعقد.

يعيق البروتين 1 (SAMHD1) المعقم α / الهستيدين - الأسبارتات (SAMHD1) تكرار فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) في الخلايا الهادئة من السلالة النخاعية. يمنع SAMHD1 النسخ المتماثل من خلال نشاطه الأنزيمي كثلاثي فوسفوهيدرولاز dNTP ، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات dNTPs داخل الخلايا. ونتيجة لذلك ، لا يمكن ل HIV-1 إجراء عملية النسخ العكسي بكفاءة. وقد أحرز تقدم كبير في السنوات القليلة التي انقضت منذ هذه الملاحظة الأولية، ولا سيما فيما يتعلق بمساهمة مجالات محددة وأحماض أمينية في نشاط SAMHD1 المضاد للفيروسات. وقد تم إجراء هذه الرؤى باستخدام الفحوصات البيوكيميائية وكذلك أنظمة الخلايا التي تحاكي البيئة النخاعية الهادئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تستخدم خلايا U9371 على نطاق واسع كنظام خلية نخاعي مناسب لتحليل نشاط SAMHD1. ويرجع ذلك إلى نقص تعبير SAMHD1 الداخلي ، ويعتقد أنه يرجع إلى انخفاض مستويات الحمض النووي الريبي مقارنة بالخلايا المعبرة عن SAMHD1 (وهو مجال من مجالات البحث المستمر). هنا ، يصف البروتوكول النقل العابر لخلايا U937 مع جزيئات تشبه الفيروس تشارك في التعبير عن SAMHD1 ومراسل البروتين الفلوري الأصفر (YFP) لدراسة آلية تقييد SAMHD1 لفيروس نقص المناعة البشرية-1. تم تطوير هذه الفحوصات العابرة لقياس التدفق الخلوي بلونين لفحص قيود الفيروسات القهقرية لأول مرة في مختبر Stoye2 ومنذ ذلك الحين تم تكييفها للتحقيق في عوامل التقييد الأخرى ، بما في ذلك بروتينات الزخارف الثلاثية (TRIM)3. مستوحاة من هذه الفحوصات ، طور مختبر Bishop مقايسة بلونين لتحليل تقييد SAMHD1 في خلايا U937.
يظهر سير العمل الخاص بالتجربة في الشكل 1. تستخدم الجسيمات الشبيهة بفيروس سرطان الدم الفئراني (MLV) التي تحتوي على رسالة ثنائية السيسترونيك تشفر SAMHD1 إلى جانب YFP المعبر عنها من IRES لنقل خلايا U937. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع خلات فيربول ميريستات (PMA) للحث على التمايز إلى النمط الظاهري الهادئ. تصاب الخلايا بعد ذلك بجزيئات تشبه فيروس نقص المناعة البشرية-1 تعبر عن بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP). بعد 48 ساعة ، يتم حصاد الخلايا وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي بلونين. يستخدم هذا الفحص أيضا مع YFP وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، مما يتطلب مجموعات مرشحات أقل معيارية لتحليل قياس التدفق الخلوي. يسمح استخدام فيروس نقص المناعة البشرية-RFP بتعويض أكثر وضوحا ، وبالتالي يمكن الوصول إلى الفحص بسهولة أكبر لمستخدمي قياس التدفق الخلوي الأقل خبرة ، ويمكن تحقيقه باستخدام معظم مقاييس الخلايا.
أثناء التحليل ، تتم مقارنة نسبة الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بين الخلايا المعبرة عن SAMHD1 وتلك التي تفتقر إلى SAMHD1 داخل نفس البئر من الخلايا. هذا يوفر تحكما داخليا في أنبوب قياس الخلايا / التدفق الجيد ، وهي ميزة رئيسية. تكشف مقارنة مستويات العدوى في الخلايا المحولة وغير المحولة عن نسبة تقييد. تشير نسبة 1.0 إلى أن العامل المحول ليس له أي تأثير على العدوى. يؤدي تعبير SAMHD1 من النوع البري إلى انخفاض بنسبة خمسة أضعاف في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في هذا الفحص ، وهو ما يتوافق مع نسبة تقييد تبلغ 0.2. في حين أن هذا التأثير متواضع بالمقارنة مع عوامل التقييد الأكثر كلاسيكية مثل TRIM5 ، إلا أن التأثير قابل للتكرار ويسمح بتصنيف معبر SAMHD1 المعدل إلى تلك التي تقيد بطريقة مكافئة للبروتين من النوع البري ، وتلك التي تفشل في التقييد ، وتلك التي لها نمط ظاهري وسيط.
تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتوصيف مجال SAMHD1 والأنماط الظاهرية لتقييد طفرات الأحماض الأمينية عن طريق التحويل باستخدام الفيروسات التي تشفر تسلسلات SAMHD1 المتحولة. على سبيل المثال ، تفشل بدائل الموقع الحفاز HD206-7AA في التقييد في هذا الاختبار. وبالمثل ، يمكن تحديد قابلية فيروسات الاختبار المختلفة. على سبيل المثال ، تكون طفرات النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أكثر عرضة للتقييد بوساطة SAMHD1 (على سبيل المثال ، 151V4). يحدد هذا البروتوكول تفاصيل إنتاج الجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLP) ، ونقل U937 مع ناقلات التعبير SAMHD1 ، والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية التي تحمل مراسل الفلورسنت والتحليل اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتناول هذه المقالة البيانات التي يمكن توقعها وكيفية تجنب النتائج دون المستوى الأمثل. وأخيرا ، يتم تحديد الاستخدامات البديلة للفحص ، بالإضافة إلى فحص متغيرات SAMHD1 المختلفة لفهم التفاعل بين مستويات SAMHD1 و dNTP والعدوى الفيروسية بشكل أكثر شمولا. بالنظر إلى دور SAMHD1 في مركز استقلاب الخلايا ، مع روابط إضافية بالسرطان ، لا يزال هذا مجالا ذا اهتمام شديد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FCT122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td>alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>ATCC recommends Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Any bright field light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (4 % in PBS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKB4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY 
			FP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw-cap tubes</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRPSY</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10084450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Trypsin will also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0531</td>
			<td>alternative transfection reagents will also work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells

يمنع البروتين المعقم α / الهيستيدين والأسبارتات المحتوي على المجال 1 (SAMHD1) تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1 في الخلايا النخاعية الهادئة. تستخدم خلايا U937 على نطاق واسع كنظام خلوي مناسب لتحليل نشاط SAMHD1 بسبب انخفاض مستوى تعبير الحمض النووي الريبي SAMHD1 ، مما يؤدي إلى تعبير البروتين الداخلي الذي لا يمكن اكتشافه. استنادا إلى فحوصات مماثلة تم تطويرها في مختبر Stoye لتوصيف عوامل تقييد الفيروسات القهقرية الأخرى ، طور مختبر Bishop مقايسة تقييد بلونين لتحليل SAMHD1 في خلايا U937. تستخدم الجسيمات الشبيهة بفيروس سرطان الدم الفئرانية التي تعبر عن SAMHD1 ، إلى جانب YFP المعبر عنها من IRES ، لنقل خلايا U937. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع خلات فيربول ميريستات للحث على التمايز إلى النمط الظاهري الهادئ. بعد التمايز ، تصاب الخلايا بجزيئات تشبه فيروس نقص المناعة البشرية-1 تعبر عن مراسل الفلورسنت. بعد 48 ساعة ، يتم حصاد الخلايا وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتم مقارنة نسبة الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في السكان الذين يعبرون عن SAMHD1 مع تلك الموجودة في خلايا التحكم الداخلي التي تفتقر إلى SAMHD1. تكشف هذه المقارنة عن نسبة تقييد. يؤدي تعبير SAMHD1 إلى انخفاض بنسبة خمسة أضعاف في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، وهو ما يتوافق مع نسبة تقييد تبلغ 0.2. وقد أدى استبدالنا الأخير ل RFP ب GFP الأصلي كجين مراسل لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية إلى تسهيل تحليل قياس التدفق الخلوي.
تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتوصيف تأثير بدائل الأحماض الأمينية على تقييد SAMHD1 عن طريق التحويل باستخدام الفيروسات التي تشفر بروتينات SAMHD1 المعدلة ، المشتقة من الطفرات الموجهة للموقع لمتجه التعبير. على سبيل المثال ، تظهر بدائل الموقع الحفاز HD206-7AA نمطا ظاهريا مقيدا من 1 ، مما يشير إلى فقدان نشاط التقييد. وبالمثل ، يمكن تحديد قابلية فيروسات الاختبار المختلفة. يمكن تكييف الفحص بشكل أكبر لدمج تأثير حالة التمايز ، وحالة التمثيل الغذائي ، ومعدلات SAMHD1 لفهم العلاقة بين SAMHD1 وحالة التمثيل الغذائي للخلية والتقييد الفيروسي بشكل أفضل.

يجب أن تسفر نتائج التحليل أعلاه عن نسبة تقييد تبلغ 0.25 أو أقل للتحكم الإيجابي SAMHD1 من النوع البري ، و 1.0 للتحكم السلبي. إذا كان هذان الفحصان لمراقبة الجودة صالحين ، ففكر في الأهمية الإحصائية للنتائج. وبالتالي فإن متغيرات SAMHD1 التي لا تظهر فرقا كبيرا عن النوع البري تحمل بدائل لا تؤثر على تقييد SAMHD1 في هذا السياق. تلك التي تختلف اختلافا كبيرا عن النوع البري تظهر قيودا ضعيفة. إذا لم تكن هذه تختلف اختلافا كبيرا عن التحكم السلبي ، فإنها تفتقر إلى القدرة على التقييد في هذا السياق (الشكل 4 اللوحات اليسرى).
إذا كانت قيمة تقييد SAMHD1 من النوع البري أكبر من 0.3 ، فقد تكون نتائج فيروسات الاختبار إرشادية ولكن لا يمكن الاعتماد عليها. قد ينتج التقييد غير الفعال بواسطة البروتين من النوع البري عن استخدام خلايا U937 في وقت مبكر جدا بعد الشفاء من إعادة التكوين (في غضون أسبوعين) ، أو عندما تكون قديمة جدا (>2-3 أشهر). قد تحتاج هذه المعلمات إلى تحديد تجريبي لمخزون خلية معين. عادة ، كلما انخفض الممر ، كلما تمايزت الخلايا بشكل أكثر موثوقية وبالتالي توفر البيئة المناسبة لتقييد SAMHD1. قد يؤدي مستوى العدوى غير المناسب إما مع SAMHD1-YFP أو HIV-RFP أيضا إلى صعوبات في كل من التعويض وتحديد نسبة التقييد في المراحل النهائية. ويرد مثال على ذلك في اللوحات اليمنى من الشكل 4.
إذا انحرف التحكم السلبي عن 1.0 (خارج نطاق 0.9-1.2) ، فقد يشير ذلك إلى وجود مشكلة في التحليل ، إما أن نسبة الخلايا المصابة أو استراتيجية البوابة أو صحة الخلايا تؤثر على الفحص. ارجع إلى الملاحظات أعلاه.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> الشكل 1: بروتوكول تخطيطي محدد. VLP ، الجسيمات الشبيهة بالفيروسات ، PMA ، خلات phorbol myristate. تتوافق المراحل المرقمة مع المراحل في البروتوكول. الشكل المنتج باستخدام BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> الشكل 2: مخطط البلازميدات الفيروسية الرجعية . (أ) ناقلات التعبئة (ب) ناقلات النقل (ج) معبر المغلف VSV-G. يتم عرض عناصر الترميز والتنظيم الرئيسية. لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى جدول المواد. CMV IE: الفيروس المضخم للخلايا الفوري المبكر المروج ، BGH: هرمون النمو البقري ، pA: polyA ، RRE: Rev Response Element ، CMV-LTR: مركب CMV-HIV-1 LTR المروج ، Psi: إشارة تغليف HIV-1 ، cPPT / CTS: مسار البولي بورين المركزي / تسلسل الإنهاء المركزي ، SV40: فيروس إخلاء سيميان 40. الشكل المنتج باستخدام BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> الشكل 3: استراتيجية البوابات لتحليل التدفق الخلوي. (أ) ضوابط التعويض: تظهر اللوحة اليسرى بوابة FSC-A/SSC-A على الخلايا اللبقة للتحكم غير المنقول وغير المصاب. تعرض اللوحات المركزية واليمنى لقطات شاشة لعناصر التحكم في التعويض أحادية اللون ل YFP (في المنتصف) و RFP (يمين) مع بيانات غير معوض باللون الأسود وتعويضها باللون الأزرق. (ب) مصفوفة التعويض المقابلة وقطع الأراضي الخاصة بضوابط التعويض المذكورة أعلاه. (ج) استراتيجية البوابات. يتم التخلص من الحطام من خلال تحليل جميع الخلايا بواسطة FSC-A/SSC-A (اللوحة اليسرى). يتم استبعاد الثنائيات عن طريق البوابات على ارتفاع FSC مقابل المساحة (اللوحة المركزية). تعرض اللوحة اليمنى مثالا على تقييد فيروس نقص المناعة البشرية-1 بواسطة SAMHD1 من النوع البري. تظهر المحاور تألق ليزر أزرق وأصفر تعويضي يتوافق مع الخلايا الإيجابية YFP (SAMHD1) و RFP (HIV) على التوالي. يتم رسم البوابات الرباعية من خلال مقارنة عناصر التحكم السلبية وأحادية اللون ل RFP و YFP. تشير الأرقام إلى النسبة المئوية للسكان الوالدين. ستكون قيم التعويض ل YFP مع GFP أعلى بكثير ولكن من الممكن التمييز باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> الشكل 4: النتائج المتوقعة: البيانات المثالية مقابل البيانات دون المستوى الأمثل. (أ) مخططات YFP / RFP التمثيلية للبيانات المثلى (يسار) ودون المستوى الأمثل (يمين). تشير الأرقام إلى النسبة المئوية للسكان الوالدين. في اللوحة اليمنى ، تكون عدوى فيروس نقص المناعة البشرية منخفضة للغاية مما يخلق صعوبات في التعويض والبوابة. نسبة التقييد أعلى من المتوقع عند 0.5. (ب) قطع نسبة التقييد لمتغيرات SAMHD1 فيما يتعلق بالنوع البري (WT ، الأحمر) أو التحكم السلبي (HD206-7AA ، أسود) الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج إحصائي. تمثل كل نقطة قيمة نسخ متماثل. يتم عرض المتوسط والانحراف المعياري. كانت اختبارات t المقترنة بين كل مجموعة مهمة في جميع الحالات المتوقعة حيث تم عرضها. على اليسار: بيانات مثالية - يظهر WT التقييد المتوقع البالغ 0.2 تقريبا ، ويظهر السلبي 1.0. يختلف البديل R372D (الرمادي) اختلافا كبيرا عن WT ولكنه ليس مهما عن التحكم السلبي وبالتالي فقد القدرة على التقييد. على اليمين: بيانات دون المستوى الأمثل. هنا ، يتصرف السلبي كما هو متوقع ولكن في جميع النسخ المتماثلة الستة ، لا يظهر WT سوى نسبة تقييد تبلغ 0.5 ، بسبب انخفاض معدل الإصابة. التباين المنخفض داخل المجموعات يعني أن R143H يظهر نمطا ظاهريا وسيطا مختلفا إحصائيا عن WT والسلبي ، في حين أن G209S لا يقيد ؛ ومع ذلك ، ينبغي تكرار ذلك مع الخلايا الطازجة لأن التحكم الإيجابي لم يعط نسبة التقييد المتوقعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

الموصوفة هنا هي طريقة ثابتة لتحديد مدى تقييد فيروس نقص المناعة البشرية-1 بواسطة البروتين المثبط الخلوي SAMHD1. يتم نقل خلايا السلالة النخاعية البشرية U937 باستخدام ناقل تعبير SAMHD1 مشترك في التعبير عن YFP ، ويتم تمييزه ثم تحديه باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-RFP. يتم تحديد مستوى التقييد من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.

تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

مع تزايد الاهتمام بدور العوامل الخلوية في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية من البلاعم ، قمنا بتطوير نظام تحليل مرن ، خاصة بالنسبة ل SAM HG one ، والذي لا يتم التعبير عنه في خلايا U937. الميزة الرئيسية للنظام هي مرونته. بمجرد إعداده ، يمكن استخدامه لتحليل مجموعة متنوعة من البروتينات أو الخلايا أو الفيروسات المستهدفة.من المهم الحفاظ على صحة الخلايا وأيضا أن تكون مرتاحا لقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. قم بتشغيل مقياس الخلايا والكمبيوتر قبل 10 دقائق من بدء التحليل. تأكد من أن النفايات فارغة وأن خزان الغمد ممتلئ.ثم قم بتسجيل الدخول وافتح برنامج التحليل. بعد تحريك الذراع ، ارفع أنبوب الماء. اضبط معدل التدفق على عالي، ثم اضغط على زر Prime (prime).انتظر حتى ينطفئ الضوء وكرر هذه العملية ثلاث مرات أخرى. ضع أنبوب الماء مرة أخرى واركض بمعدل تدفق مرتفع لمدة ثلاث دقائق. ثم اضبط معدل التدفق على مستوى منخفض واضغط على وضع الاستعداد حتى الاكتساب.حدد تجربة، تجربة جديدة، واضغط على موافق لتحديد تجربة فارغة، وانقر بزر الماوس الأيمن على التجربة وأضف عينة جديدة. اضغط على موافق إلى لوحة فارغة. انقر بزر الماوس الأيمن لإعادة التسمية باسم مناسب وفتح العينة بالنقر فوق علامة الجمع للكشف عن أنبوب جديد.انقر نقرا مزدوجا فوق الأنبوب لرؤية إعدادات مقياس الخلايا في المفتش. في قائمة المعلمات ، احذف الفلوروكرومات غير المطلوبة باستثناء الليزر الأزرق 53030 والليزر الأصفر 61020. في ورقة العمل، قم بإنشاء مخطط نقطة منطقة تشتت أمامية مقابل مخطط نقطة منطقة تشتت جانبي، ورسم بياني YFP، ورسم بياني لطلب تقديم العروض، ورسم نقطة RFP مقابل YFP بالنقر فوق الرمز المقابل وتغيير المحاور بالنقر فوق تسمية المحور.قم بتحميل عنصر التحكم غير المصاب وغير المحول واضغط على زر التشغيل على الجهاز. ثم اضغط على اكتساب في لوحة معلومات الاستحواذ. اضبط فولتية التشتت الأمامية والجانبية في لوحة القيادة لوضع الخلايا في الربع السفلي الأيسر.بوابة حول هذا السكان وتسميتهم باسم P واحد. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرات الأخرى وحدد إظهار P one لإزالة الحطام من التحليل اللاحق. اضبط فولتية RFP و YFP لأسفل بحيث تقع الذروة على يسار الرسم البياني.قم بتحميل عنصر تحكم اللون الواحد ل YFP واضغط على الاكتساب. اضبط جهد YFP في لوحة القيادة بحيث تكون معظم خلايا الفلورسنت ضمن نطاق الكاشف. ثم كرر نفس الشيء لعنصر تحكم RFP.حدد التجربة. انتقل إلى إعداد التعويض وحدد إنشاء عناصر تحكم تعويض ولا بأس بالتبديل إلى ورقة عمل عادية ثم حدد ورقة عمل عادية غير ملطخة. اضغط أثناء الركض واحصل على التحكم غير الملطخ.ارسم بوابة P واحدة حول الخلايا السليمة وسجلها. قم بإزالة الأنبوب ووضع الجهاز في وضع الاستعداد. انقر بزر الماوس الأيمن على P واحد.انقر فوق تطبيق على جميع عناصر التحكم في التعويض وقم بالتبديل إلى ورقة العمل العادية ل RFP. اضغط على الجري ، وسجل عنصر تحكم RFP أحادي اللون وسيقوم البرنامج تلقائيا ببوابة الخلايا الإيجابية. ضع الجهاز في وضع الاستعداد وكرر نفس الشيء لعنصر تحكم YFP.حدد التجربة، وانتقل إلى إعداد التعويض، وحدد حساب التعويض، ثم انقر على الرابط واحفظ. قم بالتبديل إلى ورقة العمل العمومية وارجع إلى أنبوب العينة. احصل على الخلايا المحولة بالنوع البري SAM HD One المصاب بفيروس نقص المناعة البشرية RFP ، وتحقق من أنه يمكن رؤية أربع مجموعات متميزة في زوايا الأرباع المحاذاة رأسيا وأفقيا ل YFP و RFP.قم بإزالة الأنبوب واضغط على وضع الاستعداد. أعد تحميل العينة غير المحولة وغير المصابة واضغط على تشغيل. في لوحة معلومات الاستحواذ، اضبط بوابة التوقف على P one والأحداث لتسجيل 30000 حدث.اضغط على السجل. كرر نفس الشيء بالنسبة للعينات وعناصر التحكم الأخرى عن طريق الضغط على الأنبوب التالي بين كل أنبوب. أعد تسمية العينات أثناء التشغيل أو ما بعد الصقر، وقم بتصدير البيانات كملفات FCS نقطية.افتح البرنامج واسحب جميع ملفات FCS إلى لوحة المعلومات. حدد عناصر التحكم في التعويض واسحبها إلى المجلد الفرعي للتعويض. انقر نقرا مزدوجا فوق الأنبوب غير المحول وغير المصاب لفتح الملف وإعادة توجيه تشتت قطعة أرض مقابل تشتت جانبي.حدد أداة المضلع والبوابة على مجموعة الخلايا السليمة باستثناء الحطام في الزاوية السفلية اليسرى وقم بتسميتها خلايا. انقل التسمية حتى لا تحجب الخلايا. اسحب هذه البوابة إلى جميع مجموعات الأنابيب في شريط جميع العينات.قم بالتمرير عبر جميع السكان باستخدام أزرار الأسهم الأفقية لضمان بوابة مناسبة لكل أنبوب. انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا واضبط المحاور على الارتفاع مقابل المساحة. حدد المجموعة الكبيرة المفردة باستخدام بوابة مستطيلة لاستبعاد الثنائيات وللسماح للبرنامج باقتراح تسميتها كخلايا مفردة تلقائيا.ثم اسحب هذه البوابة إلى جميع مجموعات الخلايا وتحقق من أن البوابة مناسبة لجميع العينات. حدد مجموعة الخلايا المفردة للعينة غير المصابة وغير المحولة. قم بتغيير المحور Y إلى ليزر أزرق تعويضي ل YFP ومحور X لتعويض الليزر الأصفر عن RFP.حدد أداة البوابة الرباعية وانقر في أقصى اليمين العلوي من مجموعة الخلايا السلبية. قم بتطبيق هذا البوابة الأولية على جميع مجموعات الخلايا المفردة عن طريق السحب إلى البوابة الأصل في شريط جميع العينات. إذا كانت البوابات الرباعية لا تفصل السكان بشكل مرض ، فقم ببوابة الأرباع الفردية باستخدام أداة المضلع.قم بالتمرير إلى النوع البري SAM HD عينة واحدة فقط للتحقق من البوابة الصحيحة بين الخلايا السلبية YFP غير المحولة والخلايا الإيجابية YFP. استخدم طريقة عرض الكفاف لتمييز الخلايا السالبة عن خلايا YFP الخافتة. استخدم أفضل تقسيم بين YFP السلبي والإيجابي الصالح لجميع العينات وقم بالتمرير عبر العينات للتحقق من البوابة فيما يتعلق بإيجابية YFP.قم بالتمرير إلى عينة طلب تقديم العروض غير المحولة بفيروس نقص المناعة البشرية المصابة وتحقق مما إذا كانت البوابة بين طلب تقديم العروض السلبي غير المصاب وإيجابية طلب تقديم العروض المصاب صحيحة. استخدم طريقة عرض الكفاف إذا لزم الأمر وقم بالتمرير عبر العينات المتبقية للتحقق من أن البوابة صالحة لجميع العينات. تتطلب كل عينة أربعة أرباع.Q1 YFP إيجابي ، Q2 إيجابي مزدوج ، Q3 RFP إيجابي و Q4 سلبي مزدوج. افتح محرر الجدول واسحب البوابات الرباعية الأربعة إلى لوحة المعلومات. حدد الملف والتفوق من القائمة المنسدلة.اختر وجهة الملف وانقر على إنشاء جدول. احفظ جدول البيانات الذي تم إنشاؤه وفقا لاصطلاحات تسمية الملفات المحلية. انقر على أيقونة محرر التخطيط لتصدير تمثيلات المؤامرات واستراتيجيات البوابة.حدد كل مجموعة سكانية واسحبها إلى المحرر باستخدام المحاور المطلوبة ووضع العلامات والتباعد. لإنشاء تخطيط بنفس المخططات المعروضة لجميع العينات ضمن قسم الدفعة، أدخل واحدا في العمود واضغط على إنشاء تقرير دفعي. في قائمة الملفات، حدد المقياس المراد عرضه وتجنب فواصل الصفحات.ثم احفظ بتنسيق الملف المطلوب. في جدول البيانات المصدر، قم بإنشاء الأعمدة كما هو موضح في مخطوطة النص. استخدم برنامج تحليل البيانات المناسب لمتوسط نسخ البيانات لكل بنية SAM HD واحدة، وحساب قيم نسبة التقييد.تم إنشاء مخططات YFP مقابل RFP تمثيلية للحصول على بيانات مثالية ودون المستوى الأمثل. وتشير خطة البيانات دون المستوى الأمثل إلى أن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية كانت منخفضة للغاية وخلقت صعوبات في التعويض والبوابة. كانت نسبة التقييد 0.5 ، وهي أعلى من النسبة المتوقعة البالغة 0.3.تم إنشاء مخططات نسبة التقييد لمتغيرات SAM HD one فيما يتعلق بالنوع البري والتحكم السلبي للحصول على البيانات المثلى ودون المستوى الأمثل. في البيانات المثلى ، أظهر النوع البري أن التقييد المتوقع يبلغ حوالي 0.2 والتحكم السلبي HD 206 إلى سبعة AA كان لديه نسبة تقييد 1.0. كان البديل R372D مختلفا اختلافا كبيرا عن النوع البري ، ولكنه لم يختلف اختلافا كبيرا عن التحكم السلبي وفقد القدرة على التقييد.في البيانات دون المستوى الأمثل ، تصرفت السيطرة السلبية كما هو متوقع ولكن النوع البري أظهر نسبة تقييد بلغت 0.5 بسبب انخفاض معدل الإصابة. أظهر R143D نمطا ظاهريا وسيطا مختلفا إحصائيا عن النوع البري والتحكم السلبي. كان البديل G209S مختلفا اختلافا كبيرا عن النوع البري ولكنه لم يختلف اختلافا كبيرا عن التحكم السلبي وبالتالي فقد القدرة على التقييد.من المهم أن يكون لديك الكثير من خلايا التحكم الخاصة بك خاصة إذا كنت جديدا في قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك أو بالتوازي ، يمكن إجراء تحليل كيميائي حيوي لنفس الطفرات لتشكيل صورة شاملة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...