Name: analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מכון פרנסיס קריק, המקבל את מימון הליבה שלו מ- Cancer Research UK (FC001042 ו- FC001162), המועצה הבריטית למחקר רפואי (FC001042 ו- FC001162), וקרן Wellcome (FC001042 ו- FC001162) ועל ידי פרס חוקר האמון של Wellcome ל- JPS (108012 / Z / 15 / Z). העבודה באוניברסיטת קיימברידג' מומנה במשותף על ידי מרכז המחקר הביו-רפואי NIHR בקיימברידג', קרן אוולין (16/21), קרן רוזטריס (M590) והמועצה הבריטית למחקר רפואי (MR/S009752/1). הפרס האחרון במימון בריטניה הוא חלק מתוכנית EDCTP2 הנתמכת על ידי האיחוד האירופי.

<ol>
	<li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+transient+assay+for+studying+the+genetic+determinants+of+Fv1+restriction.">Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).</li><li>Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trim5alpha+protein+restricts+both+HIV-1+and+murine+leukemia+virus.">Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).</li><li>Arnold, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-dependent+regulation+of+SAMHD1+oligomerisation+couples+catalysis+and+restriction.">Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction.</a> PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).</li><li>Groom, H. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+xenotropic+murine+leukaemia+virus-related+virus+in+UK+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome.</a> Retrovirology. 7, 10 (2010).</li><li>Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+entry+mediated+by+receptor+priming+and+low+pH+triggering+of+an+envelope+glycoprotein.">Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein.</a> Cell. 103 (4), 679-689 (2000).</li><li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+virus+capsids+require+the+cognate+envelope+protein+for+particle+export.">Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export.</a> Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bainbridge, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+to+the+mouse+eye+using+an+HIV-based+lentiviral+vector;+efficient+long-term+transduction+of+corneal+endothelium+and+retinal+pigment+epithelium.">In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium.</a> Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+interferon-stimulated+genes+with+antiretroviral+activity.">Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity.</a> Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculating+HIV-1+infectious+titre+using+a+virtual+TCID50+method.">Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).</li><li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+enhances+nucleoside-analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells.">SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824 (2017).</li><li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+specifically+affects+the+antiviral+potency+of+thymidine+analog+HIV+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).</li><li>Huber, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+has+differential+impact+on+the+efficacies+of+HIV+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).</li><li>Amie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+(dNTP)+levels.">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li><li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1.">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li></ol>

לצורך גישה פתוחה, המחברים החילו רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY על כל גרסה של כתב יד מקובל של המחבר הנובעת מהגשה זו. הדעות המובעות הן של המחבר(ים) ולאו דווקא של NIHR או של מחלקת הבריאות והטיפול הסוציאלי.

כפי שנדון בהערות לעיל, ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקול מתרכזים סביב שמירה על פנוטיפ התא הנכון לייצור VLP וליצירת הסביבה המתאימה לשמירה על הגבלת SAMHD1. ראשית, הניתוח המדויק של הגבלה על ידי ציטומטריה של זרימה בשני צבעים מסתמך על השגת פרופורציות מתאימות של תאים מתמרים ונגועים, כך שיש מספיק תאים בכל אזור של העלילה לניתוח. ככזה, על החוקר לכוון ל-MOI של פחות מ-1 (ראו פרוטוקול). שיעורי התמרה וזיהום גבוהים מדי או נמוכים מדי מובילים לבעיות בניתוח עקב מחסור בתאים לא נגועים או נגועים כפליים. באותה מידה, קצב התמרה דומה עבור וקטורים SAMHD1 שיש להשוות הוא המפתח לאפשר את אותה מטריצת פיצוי ו- gating להיות מיושם על הניסוי כולו, הגדלת הביטחון בניתוח הבא.
שנית, גילם של תאי U937 שבהם נעשה שימוש הוא גורם מפתח בשאלה אם הם מתמיינים בהצלחה. ניתן לעקוב אחר הבחנה מוצלחת באמצעות תצפית על דבקות, החמצה מופחתת של המדיה לאורך זמן בעקבות הבחנה והגבלה נאותה על ידי סוג פראי של שליטה חיובית בבדיקה. בידול של עד 5 ימים היה מוצלח.
אחד היתרונות המרכזיים של בדיקה זו הוא הגמישות שלה. ניתן לבדוק מגוון גרסאות שונות של SAMHD1 (תחומים, חומצות אמינו, רצפי מינים) באמצעות מוטגנזה פשוטה מכוונת אתר של הווקטור או השיבוט. באותה מידה, ניתן לחקור גרסאות של נגיף הבודק. הבדיקה שימשה בעבר כדי להוכיח כי מוטציות של HIV-1 טרנסקריפטאז הפוך עם יכולת מופחתת לקשור dNTP רגישות יותר להגבלת SAMHD1. אותו עיקרון יכול לשמש כדי לבדוק את ההגבלה של וירוסים אחרים על ידי SAMHD1. יתר על כן, ניתן להשתמש בתנאי התמיינות משתנים או במניפולציה מלאכותית של ריכוזי dNTP תוך-תאיים כדי לחקור עוד יותר את האינטראקציה בין תנאים תוך-תאיים לבין פעילות SAMHD1, תחום מחקר פעיל במעבדת בישופ. תוארה גם האינטראקציה של SAMHD1 עם מעכבי נוקלאוזיד הפוך טרנסקריפטאז שונים, וההשפעה של SAMHD1 שהוצגה באמצעות בדיקה זו שונתה לשימוש בתאים ראשוניים12,13,14,15.
התאמת הפרוטוקול לשימוש בתאים ראשוניים מתגברת על המגבלה הנשקפת מבדיקת פנוטיפים מטבוליים בתאים מותמרים. עם זאת, הפורמט הקיים מאפשר פרוטוקול נוח ופחות מאתגר מבחינה טכנית לניתוח תפוקה גבוהה, במיוחד עם שימוש בציטומטר זרימה עם דוגם בעל תפוקה גבוהה. בעת התאמת הפרוטוקול, יש לקחת בחשבון את הרגישות של התאים הפנימיים שאינם מותמרים להשפעות של עוברי אורח (למשל, איתות חיסוני).
כמו בהיבטים רבים של ביולוגיה של התא, חיוני שמבחנים כאלה ישמשו כחלק מגישה הוליסטית להבנת תופעה נתונה. השימוש המקביל במבחנים ביוכימיים לפעילות SAMHD116, כימות מאגרי dNTP תוך-תאיים, ותצפית על פנוטיפים מוטנטיים של SAMHD1 בבני אדם, ex vivo ובמודלים של בעלי חיים (המבוצעים על ידי מעבדות ברחבי העולם, חלקן מתוארות בגיליון זה) הם המפתח להבנה המתפתחת של חלבון מורכב זה.

חלבון סטרילי בעל מוטיב α/היסטידין-אספרטט המכיל תחום 1 (SAMHD1) מעכב שכפול של נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) בתאים שקטים של השושלת המיאלואידית. SAMHD1 חוסם את השכפול באמצעות פעילותו האנזימטית כטריפו-הידרולאז dNTP, מה שגורם לירידה ברמות של dNTPs תוך-תאיים. כתוצאה מכך, HIV-1 אינו יכול לבצע את תהליך השעתוק ההפוך ביעילות. התקדמות רבה הושגה בשנים הספורות שחלפו מאז תצפית ראשונית זו, במיוחד בנוגע לתרומתם של תחומים ספציפיים וחומצות אמינו לפעילות האנטי-ויראלית של SAMHD1. תובנות אלה נעשו באמצעות מבחנים ביוכימיים, כמו גם מערכות תאים המחקות את הסביבה המיאלואידית הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית. תאי U9371 נמצאים בשימוש נרחב כמערכת תאים מיאלואידית נוחה לניתוח פעילות SAMHD1. הסיבה לכך היא מחסור בביטוי SAMHD1 אנדוגני, שנחשב לתוצאה של רמות RNA נמוכות בהשוואה לתאים המבטאים SAMHD1 (תחום מחקר מתמשך). כאן, הפרוטוקול מתאר את ההתמרה החולפת של תאי U937 עם חלקיקים דמויי וירוס המבטאים יחד SAMHD1 וכתב חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי לבחון את המנגנון של הגבלת SAMHD1 של HIV-1. מבחני ציטומטריה של זרימה דו-צבעית חולפת כזו לבחינת הגבלות רטרו-ויראליות פותחו לראשונה במעבדת Stoye2 ומאז הותאמו כדי לחקור גורמי הגבלה אחרים, כולל חלבוני המוטיב המשולש (TRIM)3. בהשראת מבחנים אלה, מעבדת בישופ פיתחה בדיקה בשני צבעים לניתוח הגבלת SAMHD1 בתאי U937.
זרימת העבודה של הניסוי מוצגת באיור 1. חלקיקים דמויי נגיף לוקמיה מורין (MLV) המכילים מסר דו-ציסטרוני המקודד SAMHD1 לצד YFP המבוטא מ-IRES משמשים להמרת תאי U937. לאחר מכן מטפלים בתאים ב-phorbol myristate acetate (PMA) כדי לגרום להתמיין לפנוטיפ שקט. התאים נגועים לאחר מכן בחלקיקים דמויי נגיף HIV-1 המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). לאחר 48 שעות, התאים נקטפים ומנותחים על ידי ציטומטריה של זרימה בשני צבעים. בדיקה זו משמשת גם עם YFP וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), הדורשים שילובי מסננים פחות סטנדרטיים לניתוח ציטומטריה של זרימה. השימוש ב- HIV-RFP מאפשר פיצוי פשוט יותר ולכן הבדיקה נגישה יותר למשתמשי ציטומטריית זרימה פחות מנוסים, וניתנת להשגה עם רוב הציטומטרים.
במהלך הניתוח, משווים את שיעור התאים הנגועים ב-HIV בין תאים המבטאים SAMHD1 לבין תאים חסרי SAMHD1 בתוך אותה באר של תאים. זה מאפשר בקרה פנימית בצינור ציטומטריה של באר/זרימה, שהיא תכונה מרכזית. השוואת רמות ההדבקה בתאים מותמרים ולא מותמרים מגלה יחס הגבלה. יחס של 1.0 מציין כי לגורם המתמר אין השפעה על ההדבקה. ביטוי SAMHD1 מסוג פראי מוביל להפחתה של פי חמישה בהידבקות ב- HIV בבדיקה זו, המתאימה ליחס הגבלה של 0.2. בעוד שאפקט זה צנוע בהשוואה לגורמי הגבלה קלאסיים יותר כגון TRIM5, ההשפעה בכל זאת ניתנת לשחזור ומאפשרת סיווג של מבטאי SAMHD1 שעברו שינוי לאלה המגבילים באופן שווה לחלבון מסוג בר, אלה שאינם מצליחים להגביל, ואלה עם פנוטיפ ביניים.
בדיקה זו שימשה בהצלחה כדי לאפיין את תחום SAMHD1 ואת פנוטיפים להגבלת המוטנטים של חומצות אמינו על ידי התמרה עם וירוסים המקודדים רצפי SAMHD1 מוטנטיים. לדוגמה, החלפות האתר הקטליטי HD206-7AA אינן מצליחות להגביל בבדיקה זו. באותה מידה, ניתן לקבוע את הרגישות של וירוסים בודקים שונים. לדוגמה, מוטנטים של HIV-1 מסוג טרנסקריפטאז הפוך רגישים יותר להגבלה בתיווך SAMHD1 (לדוגמה, 151V4). פרוטוקול זה מתאר את הפרטים של ייצור חלקיקים דמויי וירוס (VLP), התמרה של U937 עם וקטורים ביטוי SAMHD1, זיהום ב- HIV הנושא כתב פלואורסצנטי והניתוח שלאחר מכן על ידי ציטומטריה של זרימה. מאמר זה דן באילו נתונים לצפות וכיצד להימנע מתוצאות לא אופטימליות. לבסוף, מתוארים שימושים חלופיים לבדיקה, בנוסף לבחינת גרסאות שונות של SAMHD1 כדי להבין את יחסי הגומלין בין רמות SAMHD1, dNTP וזיהום ויראלי בצורה יסודית יותר. בהתחשב בתפקיד של SAMHD1 במרכז חילוף החומרים של התאים, עם קישורים נוספים לסרטן, זה ממשיך להיות תחום של עניין אינטנסיבי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FCT122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td>alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>ATCC recommends Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Any bright field light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (4 % in PBS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKB4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY 
			FP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw-cap tubes</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRPSY</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10084450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Trypsin will also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0531</td>
			<td>alternative transfection reagents will also work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells

חלבון סטרילי בעל מוטיב α/היסטידין-אספרטט המכיל חלבון 1 (SAMHD1) מעכב שכפול של HIV-1 בתאים מיאלואידים שקטים. תאי U937 נמצאים בשימוש נרחב כמערכת תאים נוחה לניתוח פעילות SAMHD1 עקב רמה נמוכה של ביטוי RNA SAMHD1, מה שמוביל לביטוי חלבון אנדוגני שאינו ניתן לגילוי. בהתבסס על מבחנים דומים שפותחו במעבדת Stoye כדי לאפיין גורמי הגבלה רטרו-ויראליים אחרים, מעבדת בישופ פיתחה מבחן הגבלה בשני צבעים לניתוח SAMHD1 בתאי U937. מורין לוקמיה חלקיקים דמויי וירוס המבטאים SAMHD1, לצד YFP המתבטא מ-IRES, משמשים להמתרת תאי U937. לאחר מכן מטפלים בתאים ב-phorbol myristate אצטט כדי לגרום להתמיין לפנוטיפ שקט. לאחר ההתמיינות, התאים נגועים בחלקיקים דמויי נגיף HIV-1 המבטאים כתב פלואורסצנטי. לאחר 48 שעות, תאים נקצרים ומנותחים על ידי ציטומטריה של זרימה. שיעור התאים הנגועים ב- HIV באוכלוסייה המבטאת SAMHD1 מושווה לזה שבתאי בקרה פנימיים חסרי SAMHD1. השוואה זו מגלה יחס הגבלה. ביטוי SAMHD1 מוביל להפחתה של פי חמישה בהידבקות ב- HIV, המתאים ליחס הגבלה של 0.2. ההחלפה האחרונה שלנו של RFP עבור GFP המקורי כגן המדווח להידבקות ב- HIV הקלה על ניתוח ציטומטריה של זרימה.
בדיקה זו שימשה בהצלחה לאפיון ההשפעה של תחליפי חומצות אמינו על הגבלת SAMHD1 על ידי התמרה עם וירוסים המקודדים חלבוני SAMHD1 שהשתנו, שמקורם במוטגנזה מכוונת אתר של וקטור הביטוי. לדוגמה, החלפות האתר הקטליטי HD206-7AA מראות פנוטיפ הגבלה של 1, המציין אובדן פעילות הגבלה. באותה מידה, ניתן לקבוע את הרגישות של וירוסים בודקים שונים. ניתן להתאים את הבדיקה עוד יותר כדי לשלב את ההשפעה של מצב ההתמיינות, מצב חילוף החומרים ומשנים של SAMHD1 כדי להבין טוב יותר את הקשר בין SAMHD1, מצב חילוף החומרים של התא והגבלה נגיפית.

תוצאות הניתוח לעיל אמורות להניב יחס הגבלה של 0.25 ומטה עבור הבקרה החיובית SAMHD1 מסוג פראי, ו-1.0 עבור הבקרה השלילית. אם שתי בדיקות בקרת איכות אלה תקפות, שקול את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות. גרסאות SAMHD1 שאינן מראות הבדל משמעותי מסוג פראי נושאות לפיכך תחליפים שאינם משפיעים על הגבלת SAMHD1 בהקשר זה. אלה השונים באופן משמעותי מסוג פראי מראים הגבלה לקויה. אם אלה אינם שונים באופן משמעותי מהשליטה השלילית, אז הם חסרים את היכולת להגביל בהקשר זה (איור 4 לוחות שמאליים).
אם ערך ההגבלה של SAMHD1 מסוג פראי גדול מ-0.3, התוצאות עבור וירוסים בודקים עשויות להיות אינדיקטיביות, אך לא ניתן להסתמך עליהן. הגבלה לא יעילה של חלבון מסוג בר עלולה לנבוע משימוש מוקדם מדי בתאי U937 לאחר ההחלמה מחדש (תוך שבועיים), או כאשר הם מבוגרים מדי (>2-3 חודשים). ייתכן שיהיה צורך לקבוע פרמטרים אלה באופן אמפירי עבור מלאי תאים נתון. בדרך כלל, ככל שהמעבר נמוך יותר, כך התאים מתמיינים בצורה אמינה יותר ולכן מספקים את הסביבה המתאימה להגבלת SAMHD1. רמת הדבקה בלתי הולמת עם SAMHD1-YFP או HIV-RFP עלולה גם לגרום לקשיים הן בפיצוי והן בקביעת יחס ההגבלה במורד הזרם. דוגמה לכך מודגמת בלוחות הימניים של איור 4.
אם הבקרה השלילית חורגת מ-1.0 (מחוץ לטווח של 0.9-1.2), הדבר עשוי להצביע על בעיה בניתוח, או ששיעור התאים הנגועים, אסטרטגיית ה-gating או בריאות התאים משפיעים על הבדיקה. עיין בהערות לעיל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> איור 1: פרוטוקול מתאר סכמטי. VLP, חלקיקים דמויי וירוס, PMA, phorbol myristate אצטט. השלבים הממוספרים תואמים לשלבים בפרוטוקול. איור שהופק באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> איור 2: סכימה של פלסמידים רטרו-ויראליים . (A) וקטורי אריזה (B) וקטורי העברה (C) מבעבע מעטפת VSV-G. רכיבי קידוד ורגולציה מרכזיים מוצגים. לפרטים ראו את טבלת החומרים. CMV IE: מקדם ציטומגלווירוס מיידי-מוקדם, BGH: הורמון גדילה בקר, pA: polyA, RRE: אלמנט תגובת Rev, CMV-LTR: מקדם CMV-HIV-1 LTR מרוכב, Psi: אות אריזה HIV-1, cPPT / CTS: מערכת פוליפורין מרכזית / רצף סיום מרכזי, SV40: וירוס vacuolating simian 40. איור שהופק באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> איור 3: אסטרטגיית גיטינג לניתוח ציטומטריה של זרימה. (A) בקרות פיצוי: הפאנל השמאלי מציג FSC-A/SSC-A על תאים בתוך טקט עבור הבקרה הלא מתמרת והלא נגועה. חלוניות מרכזיות וימניות מציגות צילומי מסך של פקדי פיצוי בצבע יחיד עבור YFP (אמצע) ו- RFP (מימין) עם נתונים ללא פיצוי בשחור ופיצוי בכחול. (ב) מטריצת פיצויים מתאימה ומגרשים לבקרת פיצויים לעיל. (ג) אסטרטגיית גטינג. פסולת מסולקת באמצעות ניתוח של כל התאים על ידי FSC-A/SSC-A (פאנל שמאלי). כפילים אינם נכללים על-ידי סימון בגובה FSC לעומת שטח (לוח מרכזי). הלוח הימני מציג דוגמה להגבלת HIV-1 על ידי SAMHD1 מסוג פראי. הצירים מראים פלואורסצנטיות לייזר כחולה וצהובה מפוצצת המתאימה לתאים חיוביים ל-YFP (SAMHD1) ול-RFP (HIV) בהתאמה. שערים מרובעים משורטטים באמצעות השוואה של פקדים שליליים ובצבע יחיד עבור RFP ו- YFP. המספרים מציינים אחוז מאוכלוסיית ההורים. ערכי הפיצוי עבור YFP עם GFP יהיו גבוהים בהרבה אך ניתן להפלות באמצעות ערכות מסננים מתאימות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> איור 4: תוצאות צפויות: נתונים אידיאליים לעומת נתונים לא אופטימליים. (A) חלקות YFP/RFP מייצגות לנתונים אופטימליים (משמאל) ולא אופטימליים (מימין). המספרים מציינים אחוז מאוכלוסיית ההורים. בפאנל הימני, הידבקות ב- HIV נמוכה מדי ויוצרת קשיים עם פיצוי וגאט. יחס ההגבלה גבוה מהצפוי ועומד על 0.5. (B) חלקות של יחס הגבלה עבור גרסאות של SAMHD1 ביחס לסוג פראי (WT, אדום) או הבקרה השלילית (HD206-7AA, שחור) שנוצרה באמצעות תוכנה סטטיסטית. כל נקודה מייצגת ערך משוכפל. ממוצע וסטיית תקן מוצגים. מבחני t זוגיים בין כל קבוצה היו משמעותיים בכל המקרים הצפויים היכן שהוצגו. משמאל: נתונים אידיאליים - WT מראה את ההגבלה הצפויה של כ 0.2, שלילי מראה 1.0. הגרסה R372D (אפורה) שונה משמעותית מ-WT אך לא משמעותית מהשליטה השלילית ולכן איבדה את היכולת להגביל. מימין: נתונים לא אופטימליים. כאן, השלילי מתנהג כצפוי אך בכל ששת המשוכפלים ה- WT מראה רק יחס הגבלה של 0.5, בשל שיעור הדבקה נמוך. השונות הנמוכה בתוך הקבוצות פירושה R143H מראה פנוטיפ ביניים שונה סטטיסטית מ-WT ושלילי, בעוד ש-G209S אינו מגביל; עם זאת, יש לחזור על כך עם תאים טריים מכיוון שהבקרה החיובית לא נתנה את יחס ההגבלה הצפוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

המתוארת כאן היא שיטה מבוססת כדי לקבוע את מידת ההגבלה של HIV-1 על ידי חלבון מעכב תאים SAMHD1. שושלת מיאלואידית אנושית של תאי U937 מתמרים עם וקטור ביטוי SAMHD1 המבטא במשותף YFP, מתמיינים ואז מאותגרים עם HIV-RFP. רמת ההגבלה נקבעת על ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה.

ניתוח של הגבלת SAMHD1 על ידי ציטומטריה של זרימה בתאי מיאלואיד U937 אנושיים

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

עם העניין הגובר בתפקידם של גורמים תאיים בהידבקות ב-HIV של מקרופאגים, פיתחנו מערכת ניתוח גמישה, במיוחד עבור SAM HG אחד, שאינו בא לידי ביטוי בתאי U937. היתרון העיקרי של המערכת הוא הגמישות שלה. לאחר הגדרתו, ניתן להשתמש בו כדי לנתח מגוון חלבונים, תאים או נגיפי מטרה.חשוב לשמור על בריאות התאים וגם להרגיש בנוח עם ציטומטריה של זרימה צבעונית. הפעל את הציטומטר ואת המחשב 10 דקות לפני תחילת הניתוח. ודאו שהפסולת ריקה ומיכל הנדן מלא.לאחר מכן היכנס ופתח את תוכנת הניתוח. לאחר הזזת הזרוע, הורידו את צינור המים. הגדר את קצב הזרימה לגבוה ולחץ על prime.המתן עד שהאור יכבה וחזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות. החזירו את צינור המים לפעולה ורצו בקצב זרימה גבוה במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה לנמוך ולחץ על מצב המתנה עד לרכישה.בחר ניסוי, ניסוי חדש, ולחץ על אישור כדי לבחור ניסוי ריק, לחץ לחיצה ימנית על הניסוי והוסף דגימה חדשה. לחץ על אישור לחלונית ריקה. לחץ לחיצה ימנית כדי לשנות שם עם שם מתאים ופתח את הדגימה על ידי לחיצה על סימן הפלוס כדי לחשוף צינור חדש.לחץ פעמיים על הצינור כדי לראות את הגדרות הציטומטר במפקח. בתפריט הפרמטרים, מחק את הפלואורוכרומים הלא נדרשים למעט הלייזר הכחול 53030 והלייזר הצהוב 61020. בגליון העבודה, צור אזור פיזור קדימה לעומת תרשים נקודה של אזור פיזור צדדי, היסטוגרמה של YFP, היסטוגרמה של RFP ותרשים נקודה של RFP לעומת YFP על-ידי לחיצה על הסמל המתאים ושינוי הצירים על-ידי לחיצה על תווית הציר.טען את הבקרה הלא נגועה והלא מתורגמת ולחץ על הפעל על המכשיר. לאחר מכן לחץ על רכישה בלוח המחוונים של הרכישה. התאם את מתחי הפיזור קדימה והצד בלוח המחוונים כדי למקם את התאים ברביע השמאלי התחתון.שער סביב אוכלוסייה זו ותייג אותה כ- P אחד. לחץ לחיצה ימנית על העלילות האחרות ובחר הצג P אחד כדי להסיר את הפסולת מהניתוח הבא. כוונן את מתחי ה-RFP וה-YFP כלפי מטה כך שהשיא יישב משמאל להיסטוגרמה.טען את פקד הצבע היחיד עבור YFP ולחץ על רכישה. התאם את מתח ה- YFP בלוח המחוונים כך שהתאים הפלואורסצנטיים ביותר יהיו בטווח הגלאים. לאחר מכן חזור על אותו הדבר עבור פקד RFP.בחר את הניסוי. עבור אל הגדרת התגמול ובחר צור פקדי פיצוי ואשר לך לעבור לגליון עבודה רגיל ולאחר מכן בחר גליון עבודה רגיל שאינו מוכתם. לחץ תוך כדי ריצה ורכוש עבור השליטה הלא מוכתמת.צייר שער P אחד סביב התאים השלמים והקליט. הסר את הצינור והנח את המכונה על המתנה. לחץ לחיצה ימנית על P אחד.לחץ על החל על כל בקרות הפיצוי ועבור לגליון העבודה הרגיל של RFP. לחץ על הריצה והקלט את בקרת ה- RFP בצבע יחיד והתוכנה תשער באופן אוטומטי את התאים החיוביים. העבר את ההתקן למצב המתנה וחזור על אותו הדבר עבור פקד YFP.בחר ניסוי, עבור אל הגדרת פיצוי, בחר חשב פיצוי ולאחר מכן לחץ על קישור ושמור. עבור לגליון העבודה הכללי וחזור לצינור הדגימה. רכשו את התאים המתמרים עם SAM HD פראי אחד נגוע ב- HIV RFP, ובדקו כי ניתן לראות ארבע אוכלוסיות שונות בפינות הרבעים מיושרות אנכית ואופקית עבור YFP ו- RFP.הסר את הצינור ולחץ על מצב המתנה. טען מחדש את הדגימה הלא מתוקשרת והלא נגועה ולחץ על הפעלה. בלוח המחוונים של הרכישה, הגדר את שער העצירה ל- P אחד ואת האירועים לרישום 30, 000 אירועים.הקלט הקשה. חזור על אותו הדבר עבור דגימות ופקדים אחרים על ידי לחיצה על הצינור הבא בין כל צינור. שנה את שמות הדוגמאות תוך כדי ריצה או פוסט-הוק, וייצא את הנתונים כקבצי FCS נקודה.פתח את התוכנה וגרור את כל קבצי FCS ללוח המחוונים. בחר את פקדי הפיצוי וגרור אותם לתיקיית המשנה של הפיצויים. לחץ פעמיים על הצינור הלא מתומר והלא נגוע כדי לפתוח את הקובץ ולפזר קדימה פיזור לעומת צד של עלילה.בחר בכלי המצולע ובשער על אוכלוסיית התאים השלמים למעט לכלוך בפינה השמאלית התחתונה ותן לו שם תאים. הזז את התווית כך שלא תסתיר את התאים. גרור את השער הזה לכל אוכלוסיית הצינורות בסרגל כל הדגימות.גלול בין כל האוכלוסייה באמצעות לחצני החצים האופקיים כדי להבטיח כוונון מתאים לכל צינור. לחץ פעמיים על התאים והתאם את הצירים לגובה לעומת שטח. בחר את האוכלוסייה הגדולה היחידה באמצעות שער מלבני כדי לא לכלול כפילים ולאפשר לתוכנה להציע לתת לה שם כתאים בודדים באופן אוטומטי.לאחר מכן, גרור שער זה לכל אוכלוסיות התאים ובדוק שה- gating מתאים לכל הדגימות. בחר את אוכלוסיית התאים הבודדים עבור הדגימה הלא נגועה והלא מותמרת. שנה את ציר Y ללייזר כחול מפוצה עבור ציר YFP וציר X ללייזר צהוב מפוצה עבור RFP.בחר בכלי ההטיה הרביע ולחץ בקצה הימני העליון של אוכלוסיית התאים השליליים. החל הגדרה ראשונית זו על כל אוכלוסיות התאים הבודדים על-ידי גרירה אל שער האב בסרגל כל הדגימות. אם שערי הרביע אינם מפרידים בין האוכלוסייה באופן משביע רצון, שער את הרבעים הבודדים באמצעות כלי המצולע.גלול אל הסוג הפראי SAM HD דגימה אחת בלבד כדי לבדוק את ההתאמה הנכונה בין התאים השליליים של YFP שאינם מותמרים לבין התאים החיוביים של YFP. השתמש בתצוגת קווי המתאר כדי להבחין בין התאים השליליים לבין תאי YFP עמומים. השתמש בחלוקה הטובה ביותר בין YFP שלילי לחיובי שתקף לכל הדגימות וגלול בין הדגימות כדי לבדוק את ה- gating ביחס לחיוביות של YFP.גלול אל הדגימה הנגועה ב- HIV RFP לא מותמר ובדוק אם ההבחנה בין RFP שלילי לא נגוע לחיובי RFP נגוע נכונה. השתמש בתצוגת קווי המתאר במידת הצורך וגלול בין הדוגמאות הנותרות כדי לבדוק שה- gating תקף עבור כל הדוגמאות. כל דגימה דורשת ארבעה רבעים.Q1 YFP חיובי, Q2 חיובי כפול, Q3 RFP חיובי ורבעון 4 שלילי כפול. פתח את עורך הטבלה וגרור את ארבעת שערי הרבעים לתוך לוח המחוונים. בחר כדי לתייק ולהצטיין מהתפריט הנפתח.בחר את יעד הקובץ שלך ולחץ על צור טבלה. שמור את הגיליון האלקטרוני שנוצר בהתאם למוסכמות מקומיות למתן שמות לקבצים. לחץ על סמל עורך הפריסה כדי לייצא את ייצוגי העלילות ואסטרטגיות ההגשה.בחר כל אוכלוסייה וגרור אותה לעורך עם הצירים, התוויות והמרווחים הנדרשים. כדי ליצור פריסה עם אותן חלקות המוצגות עבור כל הדוגמאות תחת מקטע האצווה, הזן אחת מהן בעמודה והקש על צור דוח אצווה. בתפריט קובץ, בחר את קנה המידה לרוחב והימנע ממעברי עמוד.לאחר מכן שמור בפורמט הקובץ הנדרש. בגיליון האלקטרוני המיוצא, צור את העמודות כמתואר בכתב היד של הטקסט. השתמש בתוכנת ניתוח נתונים מתאימה כדי לממוצע את נתוני השכפול עבור כל מבנה SAM HD אחד, ולחשב את ערכי יחס ההגבלה.חלקות YFP מייצגות לעומת RFP נוצרו עבור נתונים אופטימליים ולא אופטימליים. עלילת הנתונים התת-אופטימלית מצביעה על כך שההדבקה ב- HIV הייתה נמוכה מדי ויצרה קשיים בפיצוי ובגטינג. יחס ההגבלה היה 0.5, שהוא גבוה מהיחס הצפוי של 0.3.חלקות יחס ההגבלה עבור גרסאות של SAM HD אחד ביחס לסוג הפרוע ושליטה שלילית נוצרו עבור הנתונים האופטימליים והתת-אופטימליים. בנתונים האופטימליים, הסוג הפרוע הראה את ההגבלה הצפויה של כ-0.2 ובקרה שלילית HD 206 ל-7 AA הייתה בעלת יחס הגבלה של 1.0. הגרסה R372D הייתה שונה באופן משמעותי מהסוג הפראי, אך לא שונה באופן משמעותי מהשליטה השלילית ואיבדה את היכולת להגביל.בנתונים הלא אופטימליים, הבקרה השלילית התנהגה כצפוי אך הסוג הפראי הראה יחס הגבלה של 0.5 בשל שיעור ההדבקה הנמוך. R143D הראה פנוטיפ ביניים שונה סטטיסטית מהסוג הפראי והבקרה השלילית. הגרסה G209S הייתה שונה משמעותית מהסוג הפראי אך לא שונה משמעותית מהבקרה השלילית ולכן איבדה את היכולת להגביל.חשוב שיהיו לכם הרבה תאי בקרה, במיוחד אם אתם חדשים בזרימת ציטומטריה. בעקבות זאת או במקביל, ניתוח ביוכימי של אותם מוטנטים יכול להתבצע כדי ליצור תמונה הוליסטית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...