Name: analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Francis Crick Institute, che riceve i suoi finanziamenti principali da Cancer Research UK (FC001042 e FC001162), dal Medical Research Council del Regno Unito (FC001042 e FC001162) e dal Wellcome trust (FC001042 e FC001162) e da un Wellcome Trust Investigator Award a JPS (108012 / Z / 15 / Z). Il lavoro presso l'Università di Cambridge è stato co-finanziato dal NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) e UK Medical Research Council (MR / S009752 / 1). Quest'ultimo premio finanziato dal Regno Unito fa parte del programma EDCTP2 sostenuto dall'Unione europea.

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+(dNTP)+levels.">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li><li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1.">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li></ol>

Ai fini dell'Open Access, gli autori hanno applicato una licenza di copyright pubblica CC BY a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questa presentazione. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle del NIHR o del Dipartimento della salute e dell'assistenza sociale.

Come discusso nelle note precedenti, gli aspetti critici del protocollo si concentrano sul mantenimento del corretto fenotipo cellulare per la produzione di VLP e per la creazione dell'ambiente appropriato per osservare la restrizione SAMHD1. In primo luogo, l'analisi accurata della restrizione mediante citometria a flusso bicolore si basa sul raggiungimento di proporzioni appropriate di cellule trasdotte e infette in modo che ci siano abbastanza cellule in ogni area del grafico per l'analisi. In quanto tale, il ricercatore dovrebbe mirare a un MOI inferiore a 1 (vedi Protocollo). I tassi di trasduzione e infezione troppo alti o troppo bassi portano a problemi con l'analisi a causa della mancanza di cellule non infette o doppiamente infette. Allo stesso modo, un tasso di trasduzione simile per i vettori SAMHD1 da confrontare è la chiave per consentire l'applicazione della stessa matrice di compensazione e gating all'intero esperimento, aumentando la fiducia nell'analisi successiva.
In secondo luogo, l'età delle cellule U937 utilizzate è un fattore chiave per differenziarsi con successo. Il successo della differenziazione può essere monitorato attraverso l'osservazione dell'aderenza, una ridotta acidificazione dei mezzi nel tempo dopo la differenziazione e un'adeguata restrizione da parte del controllo positivo del tipo selvatico nel test. La differenziazione fino a 5 giorni ha avuto successo.
Uno dei principali vantaggi di questo test è la sua flessibilità. Una varietà di versioni modificate di SAMHD1 (domini, amminoacidi, sequenze di specie) possono essere testate tramite semplice mutagenesi sito-diretta del vettore o clonazione. Allo stesso modo, le varianti del virus tester possono essere esplorate. Il test è stato utilizzato in precedenza per dimostrare che i mutanti della trascrittasi inversa dell'HIV-1 con ridotta capacità di legare dNTP sono più sensibili alla restrizione SAMHD1. Lo stesso principio può essere utilizzato per testare la restrizione di altri virus mediante SAMHD1. Inoltre, condizioni di differenziazione variabili o manipolazione artificiale delle concentrazioni intracellulari di dNTP possono essere utilizzate per sondare ulteriormente l'interazione tra condizioni intracellulari e attività SAMHD1, un'area di ricerca attiva nel laboratorio di Bishop. È stata anche descritta l'interazione di SAMHD1 con vari inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa e l'effetto di SAMHD1 mostrato utilizzando questo test modificato per l'uso nelle cellule primarie12,13,14,15.
L'adattamento del protocollo per l'uso nelle cellule primarie supera il limite posto dall'esame dei fenotipi metabolici nelle cellule trasformate. Tuttavia, il formato esistente consente un protocollo conveniente e meno impegnativo dal punto di vista tecnico per l'analisi ad alta produttività, in particolare con l'uso di un citometro a flusso con un campionatore ad alta produttività. Quando si adatta il protocollo, deve essere considerata la suscettibilità delle cellule internamente non trasdotte agli effetti degli astanti (ad esempio, segnalazione immunitaria).
Come per molti aspetti della biologia cellulare, è essenziale che tali saggi siano utilizzati come parte di un approccio olistico per comprendere un determinato fenomeno. L'uso parallelo di saggi biochimici per l'attività16 di SAMHD1, la quantificazione dei pool intracellulari di dNTP e l'osservazione dei fenotipi mutanti SAMHD1 nell'uomo, ex vivo e in modelli animali (condotti da laboratori di tutto il mondo, alcuni descritti in questo numero) sono fondamentali per la comprensione in evoluzione di questa complessa proteina.

La proteina 1 sterile contenente il dominio α-motivo/istidina-aspartato (SAMHD1) impedisce la replicazione del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) nelle cellule quiescenti della linea mieloide. SAMHD1 blocca la replicazione attraverso la sua attività enzimatica come una trifosfoidrolasi dNTP, che si traduce in una diminuzione dei livelli di dNTP intracellulari. Di conseguenza, l'HIV-1 non può eseguire il processo di trascrizione inversa in modo efficiente. Molti progressi sono stati fatti nei pochi anni successivi a questa osservazione iniziale, in particolare per quanto riguarda il contributo di domini specifici e aminoacidi all'attività antivirale di SAMHD1. Queste intuizioni sono state fatte utilizzando saggi biochimici e sistemi cellulari che imitano l'ambiente mieloide quiescente fisiologicamente rilevante. Le cellule U9371 sono ampiamente utilizzate come un comodo sistema di cellule mieloidi per analizzare l'attività di SAMHD1. Ciò è dovuto alla mancanza di espressione endogena di SAMHD1, che si pensa sia dovuta a bassi livelli di RNA rispetto alle cellule che esprimono SAMHD1 (un'area di ricerca in corso). Qui, il protocollo descrive la trasduzione transitoria di cellule U937 con particelle simili a virus che co-esprimono SAMHD1 e un reporter di proteina fluorescente gialla (YFP) per esaminare il meccanismo di restrizione SAMHD1 dell'HIV-1. Tali saggi transitori di citometria a flusso a due colori per esaminare le restrizioni retrovirali sono stati sviluppati per la prima volta nel laboratorio Stoye2 e da allora sono stati adattati per studiare altri fattori di restrizione, tra cui le proteine del motivo tripartito (TRIM)3. Ispirato da questi test, il laboratorio Bishop ha sviluppato un test a due colori per analizzare la restrizione SAMHD1 nelle cellule U937.
Il flusso di lavoro per l'esperimento è illustrato nella Figura 1. Le particelle simili al virus della leucemia murina (MLV) contenenti un messaggio bi-cistronico che codifica SAMHD1 insieme a YFP espresso da un IRES sono utilizzate per trasdurre le cellule U937. Le cellule vengono quindi trattate con phorbol miristate acetato (PMA) per indurre la differenziazione a un fenotipo quiescente. Le cellule sono successivamente infettate da particelle simili al virus HIV-1 che esprimono la proteina fluorescente rossa (RFP). Dopo 48 ore, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria a flusso bicolore. Questo test viene utilizzato anche con YFP e proteina fluorescente verde (GFP), che richiedono combinazioni di filtri meno standard per l'analisi della citometria a flusso. L'uso di HIV-RFP consente una compensazione più semplice e quindi il test è più facilmente accessibile agli utenti di citometria a flusso meno esperti e realizzabile con la maggior parte dei citometri.
Durante l'analisi, la proporzione di cellule infette da HIV viene confrontata tra le cellule che esprimono SAMHD1 e quelle prive di SAMHD1 all'interno dello stesso pozzetto di cellule. Ciò consente un controllo interno nel tubo di citometria pozzo / flusso, che è una caratteristica chiave. Il confronto dei livelli di infezione nelle cellule trasdotte e non trasdotte rivela un rapporto di restrizione. Un rapporto di 1,0 indica che il fattore trasdotto non ha alcun effetto sull'infettività. L'espressione di SAMHD1 di tipo selvatico porta a una riduzione di cinque volte dell'infezione da HIV in questo test, corrispondente a un rapporto di restrizione di 0,2. Mentre questo effetto è modesto rispetto ai fattori di restrizione più classici come TRIM5, l'effetto è comunque riproducibile e consente la classificazione degli espressivi SAMHD1 modificati in quelli che si limitano in modo equivalente alla proteina wild-type, quelli che non riescono a limitare e quelli con un fenotipo intermedio.
Questo test è stato utilizzato con successo per caratterizzare i fenotipi di restrizione del dominio SAMHD1 e dei mutanti degli aminoacidi trasducendo con virus che codificano sequenze SAMHD1 mutanti. Ad esempio, le sostituzioni del sito catalitico HD206-7AA non riescono a limitare in questo test. Allo stesso modo, è possibile determinare la suscettibilità di diversi virus tester. Ad esempio, i mutanti della trascrittasi inversa dell'HIV-1 sono più suscettibili alla restrizione mediata da SAMHD1 (ad esempio, 151V4). Questo protocollo delinea i dettagli della produzione di particelle virus-simili (VLP), la trasduzione di U937 con vettori di espressione SAMHD1, l'infezione da HIV che trasporta un reporter fluorescente e la successiva analisi mediante citometria a flusso. In questo articolo vengono illustrati quali dati aspettarsi e come evitare risultati non ottimali. Infine, vengono delineati usi alternativi per il test, oltre ad esaminare diverse varianti di SAMHD1 per comprendere più a fondo l'interazione tra SAMHD1, livelli di dNTP e infezione virale. Dato il ruolo di SAMHD1 al centro del metabolismo cellulare, con ulteriori collegamenti al cancro, questa continua ad essere un'area di intenso interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FCT122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td>alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>ATCC recommends Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Any bright field light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (4 % in PBS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKB4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY 
			FP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw-cap tubes</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRPSY</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10084450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Trypsin will also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0531</td>
			<td>alternative transfection reagents will also work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells

La proteina 1 sterile contenente dominio α-motivo/istidina-aspartato (SAMHD1) inibisce la replicazione dell'HIV-1 nelle cellule mieloidi quiescenti. Le cellule U937 sono ampiamente utilizzate come sistema cellulare conveniente per analizzare l'attività di SAMHD1 a causa di un basso livello di espressione dell'RNA SAMHD1, che porta a un'espressione proteica endogena non rilevabile. Sulla base di saggi simili sviluppati nel laboratorio Stoye per caratterizzare altri fattori di restrizione retrovirale, il laboratorio Bishop ha sviluppato un saggio di restrizione a due colori per analizzare SAMHD1 nelle cellule U937. Leucemia murina Le particelle simili al virus che esprimono SAMHD1, insieme a YFP espresso da un IRES, sono utilizzate per trasdurre le cellule U937. Le cellule vengono quindi trattate con phorbol miristato acetato per indurre la differenziazione in un fenotipo quiescente. Dopo la differenziazione, le cellule vengono infettate con particelle simili al virus HIV-1 che esprimono un reporter fluorescente. Dopo 48 ore, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria a flusso. La percentuale di cellule infette da HIV nella popolazione che esprime SAMHD1 è confrontata con quella nelle cellule di controllo interno prive di SAMHD1. Questo confronto rivela un rapporto di restrizione. L'espressione di SAMHD1 porta a una riduzione di cinque volte dell'infezione da HIV, corrispondente a un rapporto di restrizione di 0,2. La nostra recente sostituzione della RFP con la GFP originale come gene reporter per l'infezione da HIV ha facilitato l'analisi della citometria a flusso.
Questo test è stato utilizzato con successo per caratterizzare l'effetto delle sostituzioni aminoacidiche sulla restrizione di SAMHD1 trasducendo con virus che codificano proteine SAMHD1 alterate, derivate dalla mutagenesi sito-diretta del vettore di espressione. Ad esempio, le sostituzioni catalitiche del sito HD206-7AA mostrano un fenotipo di restrizione di 1, indicando una perdita di attività di restrizione. Allo stesso modo, è possibile determinare la suscettibilità di diversi virus tester. Il test può essere ulteriormente adattato per incorporare l'effetto dello stato di differenziazione, dello stato metabolico e dei modificatori SAMHD1 per comprendere meglio la relazione tra SAMHD1, stato metabolico cellulare e restrizione virale.

I risultati dell'analisi di cui sopra dovrebbero produrre un rapporto di restrizione di 0,25 o inferiore per il controllo positivo SAMHD1 wild-type e di 1,0 per il controllo negativo. Se questi due controlli di qualità sono validi, considerare la significatività statistica dei risultati. Le varianti SAMHD1 che non mostrano differenze significative rispetto al wild type portano quindi sostituzioni che non influiscono sulla restrizione SAMHD1 in questo contesto. Quelli significativamente diversi dal tipo selvaggio mostrano una restrizione compromessa. Se questi non sono significativamente diversi dal controllo negativo, allora non hanno la capacità di limitare in questo contesto (Figura 4 pannelli a sinistra).
Se il valore di restrizione SAMHD1 wild-type è maggiore di 0,3, i risultati per i virus tester possono essere indicativi ma non possono essere affidabili. Una restrizione inefficace da parte delle proteine wild-type può derivare dall'uso di cellule U937 troppo presto dopo il recupero dalla ricostituzione (entro 2 settimane) o quando sono troppo vecchie (>2-3 mesi). Potrebbe essere necessario determinare empiricamente questi parametri per un determinato stock cellulare. Tipicamente, più basso è il passaggio, più affidabile è la differenziazione delle cellule e quindi fornisce l'ambiente appropriato per la restrizione SAMHD1. Un livello di infezione inappropriato con SAMHD1-YFP o HIV-RFP può anche causare difficoltà sia con la compensazione che con la determinazione a valle del rapporto di restrizione. Un esempio è illustrato nei pannelli di destra della Figura 4.
Se il controllo negativo si discosta da 1,0 (al di fuori dell'intervallo 0,9-1,2), ciò potrebbe indicare un problema con l'analisi, la proporzione di cellule infette, la strategia di gating o la salute delle cellule stanno influenzando il test. Fare riferimento alle NOTE di cui sopra.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo. VLP, particelle virus-simili, PMA, phorbol miristato acetato. Le fasi numerate corrispondono alle fasi del protocollo. Figura prodotta utilizzando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> Figura 2: Schema dei plasmidi retrovirali . (A) Vettori di imballaggio (B) Vettori di trasferimento (C) Espressivo di inviluppo VSV-G. Vengono mostrati gli elementi chiave di codifica e normativi. Per i dettagli fare riferimento alla Tabella dei materiali. CMV IE: promotore immediato precoce del citomegalovirus, BGH: ormone della crescita bovino, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: promotore composito CMV-HIV-1 LTR, Psi: segnale di confezionamento HIV-1, cPPT/CTS: tratto polipurinico centrale/sequenza di terminazione centrale, SV40: virus vacuolante delle scimmie 40. Figura prodotta utilizzando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> Figura 3: Strategia di gating per l'analisi della citometria a flusso. (A) Controlli di compensazione: il pannello di sinistra mostra il gating FSC-A/SSC-A sulle cellule intatte per il controllo non trasdotto e non infetto. I pannelli centrale e destro mostrano schermate dei controlli di compensazione monocolore per YFP (medio) e RFP (a destra) con dati non compensati in nero e compensati in blu. (B) Matrice di compensazione corrispondente e grafici per i controlli di compensazione di cui sopra. (C) Strategia di gating. I detriti vengono eliminati attraverso l'analisi di tutte le celle mediante FSC-A/SSC-A (pannello di sinistra). Le doppiette sono escluse dal gating sull'altezza FSC rispetto all'area (pannello centrale). Il pannello di destra mostra un esempio di restrizione dell'HIV-1 da parte di SAMHD1 wild-type. Gli assi mostrano una fluorescenza laser blu e gialla compensata corrispondente rispettivamente alle cellule YFP (SAMHD1) e RFP (HIV)-positive. Le porte del quadrante vengono disegnate attraverso il confronto dei controlli negativi e monocromatici per RFP e YFP. I numeri indicano la percentuale della popolazione dei genitori. I valori di compensazione per YFP con GFP saranno molto più alti, ma è possibile discriminare utilizzando set di filtri appropriati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> Figura 4: Risultati attesi: dati ideali e dati non ottimali. (A) Grafici rappresentativi YFP/RFP per dati ottimali (a sinistra) e subottimali (a destra). I numeri indicano la percentuale della popolazione dei genitori. Nel pannello di destra, l'infezione da HIV è troppo bassa creando difficoltà con la compensazione e il gating. Il rapporto di restrizione è superiore al previsto a 0,5. (B) Grafici del rapporto di restrizione per le varianti di SAMHD1 rispetto al tipo selvatico (WT, rosso) o al controllo negativo (HD206-7AA, nero) generato utilizzando software statistico. Ogni punto rappresenta un valore di replica. Vengono mostrate la media e la deviazione standard. I t-test accoppiati tra ciascun gruppo erano significativi in tutti i casi in cui mostrato. A sinistra: dati ideali - WT mostra la restrizione attesa di circa 0,2, negativo mostra 1,0. La variante R372D (grigia) è significativamente diversa da WT ma non significativa dal controllo negativo e quindi ha perso la capacità di limitare. A destra: dati non ottimali. Qui, il negativo si comporta come previsto, ma in tutte e sei le repliche il WT mostra solo un rapporto di restrizione di 0,5, a causa del basso tasso di infezione. La bassa varianza all'interno dei gruppi fa sì che R143H mostri un fenotipo intermedio statisticamente diverso dal WT e dal negativo, mentre G209S non restringe; Tuttavia, questo dovrebbe essere ripetuto con le cellule fresche poiché il controllo positivo non ha fornito il rapporto di restrizione atteso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Qui è descritto un metodo consolidato per determinare l'entità della restrizione dell'HIV-1 da parte della proteina inibitoria cellulare SAMHD1. Le cellule U937 della linea mieloide umana sono trasdotte con un vettore di espressione SAMHD1 che co-esprime YFP, differenziate e quindi sfidate con HIV-RFP. Il livello di restrizione è determinato dall'analisi della citometria a flusso.

Analisi della restrizione di SAMHD1 mediante citometria a flusso in cellule mieloidi umane U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Con il crescente interesse per il ruolo dei fattori cellulari nell'infezione da HIV dei macrofagi, abbiamo sviluppato un sistema flessibile di analisi, in particolare per SAM HG uno, che non è espresso nelle cellule U937. Il principale vantaggio del sistema è la sua flessibilità. Una volta configurato, può essere utilizzato per analizzare una varietà di proteine, cellule o virus bersaglio.È importante mantenere la salute delle cellule e anche sentirsi a proprio agio con la citometria a flusso multicolore. Accendere il citometro e il computer 10 minuti prima di iniziare l'analisi. Assicurarsi che i rifiuti siano vuoti e che il serbatoio della guaina sia pieno.Quindi accedi e apri il software di analisi. Dopo aver spostato il braccio, togliere il tubo dell'acqua. Impostare la portata su alta e premere prime.Attendi che la luce si spenga e ripeti questo processo altre tre volte. Riposizionare il tubo dell'acqua e farlo funzionare ad alta portata per tre minuti. Quindi, impostare la portata su bassa e premere standby fino all'acquisizione.Seleziona esperimento, nuovo esperimento e premi OK per selezionare esperimento vuoto, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'esperimento e aggiungi nuovo campione. Premere OK per spegnere il pannello. Fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare con un nome appropriato e aprire l'esemplare facendo clic sul segno più per visualizzare un nuovo tubo.Fare doppio clic sul tubo per visualizzare le impostazioni del citometro nell'ispettore. Nel menu dei parametri, eliminare i fluorocromi non richiesti ad eccezione del laser blu 53030 e del laser giallo 61020. Nel foglio di lavoro, creare un'area di dispersione diretta rispetto al grafico a punti dell'area di dispersione laterale, all'istogramma YFP, all'istogramma RFP e al grafico a punti RFP rispetto a YFP facendo clic sull'icona corrispondente e modificando gli assi facendo clic sull'etichetta dell'asse.Caricare il controllo non infetto e non trasdotto e premere Run sulla macchina. Quindi premere acquisisci nel dashboard di acquisizione. Regolare le tensioni di dispersione diretta e laterale nel dashboard per posizionare le celle nel quadrante inferiore sinistro.Chiudi questa popolazione ed etichettala come P uno. Fare clic con il pulsante destro del mouse sugli altri grafici e selezionare Mostra P uno per rimuovere i detriti dall'analisi successiva. Regolare le tensioni RFP e YFP verso il basso in modo che il picco si trovi a sinistra dell'istogramma.Caricare il controllo a colore singolo per YFP e acquisire pressa. Regolare la tensione YFP nel cruscotto in modo che la maggior parte delle celle fluorescenti si trovi all'interno dell'intervallo del rilevatore. Quindi ripetere lo stesso per il controllo RFP.Seleziona l'esperimento. Vai alla configurazione della compensazione e seleziona crea controlli di compensazione e ok per passare a un foglio di lavoro normale, quindi seleziona un foglio di lavoro normale non macchiato. Premere sulla corsa e acquisire per il controllo non macchiato.Disegna un cancello P attorno alle celle intatte e registra. Rimuovere il tubo e mettere la macchina in standby. Fare clic con il tasto destro su P uno.Fai clic su Applica a tutti i controlli di compensazione e passa al normale foglio di lavoro RFP. Premi Esegui e registra il controllo RFP a colore singolo e il software cancellerà automaticamente le celle positive. Mettere la macchina in standby e ripetere lo stesso per il controllo YFP.Seleziona esperimento, vai su Impostazione compensazione, seleziona Calcola compenso e quindi fai clic su link e salva. Passare al foglio di lavoro globale e tornare al tubo del campione. Acquisire le cellule trasdotte con SAM HD di tipo selvaggio infettate da RFP HIV e verificare che quattro popolazioni distinte possano essere viste negli angoli dei quadranti allineati verticalmente e orizzontalmente per YFP e RFP.Rimuovere il tubo e premere standby. Ricaricate il campione non trasdotto e non infetto e premete Esegui. Nella dashboard di acquisizione, impostare il cancello di arresto su P uno e gli eventi per registrare 30.000 eventi.Registra stampa. Ripetere lo stesso per altri campioni e controlli premendo il tubo successivo tra ogni tubo. Rinominare gli esempi durante l'esecuzione o post-hawk ed esportare i dati come file FCS punto.Apri il software e trascina tutti i file FCS nel cruscotto. Selezionare i controlli di compensazione e trascinarli nella sottocartella di retribuzione. Fare doppio clic sul tubo non trasdotto e non infetto per aprire il file e inoltrare la dispersione di un grafico a dispersione laterale contro.Selezionare lo strumento poligono e il cancello sulla popolazione di celle intatta esclusi i detriti nell'angolo in basso a sinistra e denominarla celle. Sposta l'etichetta in modo che non oscuri le celle. Trascina questa porta sull'intera popolazione di tubi nella barra di tutti i campioni.Scorri l'intera popolazione utilizzando i pulsanti freccia orizzontale per garantire il gating appropriato per ogni tubo. Fare doppio clic sulle celle e regolare gli assi in base all'altezza rispetto all'area. Selezionare la singola grande popolazione utilizzando un cancello rettangolare per escludere doppietti e consentire al software di suggerire di nominarla automaticamente come celle singole.Quindi, trascina questa porta su tutte le popolazioni di cellule e controlla che il gating sia appropriato per tutti i campioni. Selezionare la popolazione di singole cellule per il campione non infetto e non trasdotto. Cambiare l'asse Y in laser blu compensato per YFP e l'asse X in laser giallo compensato per RFP.Seleziona lo strumento di gating del quadrante e fai clic all'estremo in alto a destra della popolazione cellulare negativa. Applicare questo gating preliminare a tutte le popolazioni di singole cellule trascinando sul gate padre nella barra di tutti i campioni. Se le porte dei quadranti non separano la popolazione in modo soddisfacente, eseguire il controllo dei singoli quadranti utilizzando lo strumento poligono.Scorrere fino al tipo wild SAM HD un solo campione per verificare il corretto gating tra le celle YFP negative non trasdotte e YFP positive. Utilizzare la vista di contorno per discriminare le celle negative dalle celle YFP deboli. Utilizzare la migliore divisione tra YFP negativo e positivo valida per tutti i campioni e scorrere i campioni per verificare il gating rispetto alla positività YFP.Scorrere fino al campione infetto di RFP HIV non trasdotto e verificare se il gating tra RFP negativo non infetto e RFP positivo infetto è corretto. Se necessario, utilizzare la vista contorno e scorrere gli esempi rimanenti per verificare che il gating sia valido per tutti i campioni. Ogni campione richiede quattro quadranti.Q1 YFP positivo, Q2 doppio positivo, Q3 RFP positivo e Q4 doppio negativo. Aprire l'editor di tabelle e trascinare le quattro porte del quadrante nella dashboard. Seleziona per archiviare ed eccellere dal menu a discesa.Scegli la destinazione del file e fai clic su crea tabella. Salvare il foglio di calcolo generato in base alle convenzioni di denominazione dei file locali. Fare clic sull'icona dell'editor di layout per esportare le rappresentazioni di trame e strategie di gating.Seleziona ogni popolazione e trascinala nell'editor con gli assi, l'etichettatura e la spaziatura richiesti. Per creare un layout con gli stessi grafici mostrati per tutti i campioni nella sezione batch, immetterne uno nella colonna e premere crea report batch. Nel menu File, selezionate la scala in base alla larghezza ed evitate interruzioni di pagina.Quindi salvare nel formato di file richiesto. Nel foglio di calcolo esportato, generare le colonne come descritto nel testo manuscritto. Utilizzare un software di analisi dei dati appropriato per calcolare la media dei dati di replica per ciascun costrutto SAM HD e calcolare i valori del rapporto di restrizione.Sono stati generati grafici rappresentativi YFP rispetto a RFP per dati ottimali e subottimali. Il grafico dei dati non ottimale indica che l'infezione da HIV era troppo bassa e creava difficoltà con la compensazione e il gating. Il rapporto di restrizione era 0,5, che è superiore al rapporto atteso di 0,3.I grafici del rapporto di restrizione per le varianti di SAM HD uno rispetto al wild type e al controllo negativo sono stati generati per i dati ottimali e subottimali. Nei dati ottimali, il tipo wild ha mostrato la restrizione attesa di circa 0,2 e il controllo negativo HD 206 a sette AA aveva il rapporto di restrizione di 1,0. La variante R372D era significativamente diversa dal tipo selvaggio, ma non significativamente diversa dal controllo negativo e ha perso la capacità di limitare.Nei dati non ottimali, il controllo negativo si è comportato come previsto, ma il tipo selvatico ha mostrato un rapporto di restrizione di 0,5 a causa del basso tasso di infezione. L'R143D ha mostrato un fenotipo intermedio statisticamente diverso dal wild type e dal controllo negativo. La variante G209S era significativamente diversa dal tipo wild ma non significativamente diversa dal controllo negativo e quindi ha perso la capacità di limitare.È importante avere molte cellule di controllo, in particolare se sei nuovo alla citometria a flusso. In seguito a questo o in parallelo, l'analisi biochimica degli stessi mutanti può essere effettuata per formare un quadro olistico.

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