Name: analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

この研究は、Cancer Research UK(FC001042およびFC001162)、UK Medical Research Council(FC001042およびFC001162)、Wellcome Trust(FC001042およびFC001162)からコア資金を受けているFrancis Crick Institute、およびJPSのWellcome Trust Investigator Award(108012/Z/15/Z)の支援を受けた。ケンブリッジ大学での研究は、NIHRケンブリッジ生物医学研究センター、エブリントラスト(16/21)、ローズツリートラスト(M590)、および英国医学研究評議会(MR / S009752 / 1)によって共同資金提供されました。後者の英国資金による賞は、欧州連合が支援するEDCTP2プログラムの一部です。

<ol>
	<li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+transient+assay+for+studying+the+genetic+determinants+of+Fv1+restriction.">Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).</li><li>Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trim5alpha+protein+restricts+both+HIV-1+and+murine+leukemia+virus.">Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).</li><li>Arnold, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-dependent+regulation+of+SAMHD1+oligomerisation+couples+catalysis+and+restriction.">Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction.</a> PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).</li><li>Groom, H. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+xenotropic+murine+leukaemia+virus-related+virus+in+UK+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome.</a> Retrovirology. 7, 10 (2010).</li><li>Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+entry+mediated+by+receptor+priming+and+low+pH+triggering+of+an+envelope+glycoprotein.">Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein.</a> Cell. 103 (4), 679-689 (2000).</li><li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+virus+capsids+require+the+cognate+envelope+protein+for+particle+export.">Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export.</a> Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bainbridge, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+to+the+mouse+eye+using+an+HIV-based+lentiviral+vector;+efficient+long-term+transduction+of+corneal+endothelium+and+retinal+pigment+epithelium.">In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium.</a> Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+interferon-stimulated+genes+with+antiretroviral+activity.">Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity.</a> Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculating+HIV-1+infectious+titre+using+a+virtual+TCID50+method.">Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).</li><li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+enhances+nucleoside-analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells.">SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824 (2017).</li><li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+specifically+affects+the+antiviral+potency+of+thymidine+analog+HIV+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).</li><li>Huber, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+has+differential+impact+on+the+efficacies+of+HIV+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).</li><li>Amie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+(dNTP)+levels.">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li><li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1.">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li></ol>

オープンアクセスの目的のために、著者は、この提出から生じる著者受理原稿バージョンにCC BYパブリック著作権ライセンスを適用しました。表明された見解は著者のものであり、必ずしもNIHRまたは保健社会福祉省の見解ではありません。

上記のノートで説明したように、プロトコルの重要な側面は、VLP産生のための正しい細胞表現型を保持し、SAMHD1制限を観察するための適切な環境を作成することを中心にしています。第一に、2色フローサイトメトリーによる制限の正確な分析は、プロットの各領域に分析のために十分な細胞が存在するように、形質導入細胞と感染細胞の適切な比率を達成することに依存しています。そのため、研究者は1未満のMOIを目指す必要があります( プロトコルを参照)。形質導入率と感染率が高すぎたり低すぎたりすると、感染していない細胞や二重に感染した細胞がないため、分析に問題が発生します。同様に、比較するSAMHD1ベクターの同様の形質導入速度は、同じ補償マトリックスとゲーティングを実験全体に適用できるようにするための鍵であり、その後の分析の信頼性を高めます。
第二に、使用されるU937細胞の年齢は、それらがうまく分化するかどうかの重要な要素です。鑑別の成功は、アドヒアランスの観察、分化後の経時的な培地の酸性化の減少、およびアッセイにおける野生型ポジティブコントロールによる適切な制限を通じて監視できます。最大5日間の鑑別が成功しています。
このアッセイの主な利点の1つは、その柔軟性です。SAMHD1の様々な改変バージョン(ドメイン、アミノ酸、種配列)は、ベクターの単純な部位特異的突然変異誘発またはクローニングを介して試験することができる。同様に、テスターウイルスの亜種を調べることができます。このアッセイは、dNTPに結合する能力が低下したHIV-1逆転写酵素変異体がSAMHD1制限に対してより敏感であることを実証するために以前に使用されてきました。同じ原理を使用して、SAMHD1による他のウイルスの制限をテストできます。さらに、細胞内dNTP濃度の分化条件の変化または人為的な操作を使用して、細胞内条件とSAMHD1活性との間の相互作用をさらに調査することができ、これはビショップ研究室で活発な研究分野です。SAMHD1と様々なヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との相互作用も記載されており、初代細胞で使用するために改変されたこのアッセイを用いて示されたSAMHD1の効果12、13、14、15。
初代細胞で使用するためのプロトコルの適応は、形質転換細胞における代謝表現型を調べることによってもたらされる制限を克服する。ただし、既存のフォーマットでは、特にハイスループットサンプラーを備えたフローサイトメーターを使用する場合、ハイスループット分析のための便利で技術的に難しいプロトコルが可能になります。プロトコルを適応させる際には、内部で形質導入されていない細胞のバイスタンダー効果(例えば、免疫シグナル伝達)に対する感受性を考慮する必要があります。
細胞生物学の多くの側面と同様に、そのようなアッセイは、所与の現象を理解するための全体論的アプローチの一部として使用されることが不可欠です。SAMHD1活性16の生化学的アッセイの並行使用、細胞内dNTPプールの定量、およびヒト、 ex vivo 、および動物モデル(世界中のラボで実施されており、この号に記載されているものもあります)におけるSAMHD1変異表現型の観察は、この複雑なタンパク質の進化する理解の鍵です。

滅菌αモチーフ/ヒスチジン-アスパラギン酸ドメイン含有タンパク質1(SAMHD1)は、骨髄系系統の静止細胞におけるヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)の複製を妨げます。SAMHD1は、dNTPトリホスホヒドロラーゼとしての酵素活性を介して複製をブロックし、その結果、細胞内dNTPのレベルが低下します。その結果、HIV-1は逆転写のプロセスを効率的に実行できません。この最初の観察から数年で、特にSAMHD1の抗ウイルス活性に対する特定のドメインとアミノ酸の寄与に関して、多くの進歩が見られました。これらの洞察は、生化学的アッセイおよび生理学的に関連する静止骨髄性環境を模倣する細胞系を使用して行われました。U937細胞1 は、SAMHD1活性を解析するための簡便な骨髄系細胞系として広く用いられている。これは、内因性のSAMHD1発現の欠如によるものであり、SAMHD1発現細胞と比較してRNAレベルが低いためと考えられています(進行中の研究分野)。ここで、プロトコルは、HIV-1のSAMHD1制限のメカニズムを調べるために、SAMHD1と黄色蛍光タンパク質(YFP)レポーターを共発現するウイルス様粒子によるU937細胞の一時的な形質導入について説明します。レトロウイルスの制限を調べるためのこのような一過性2色フローサイトメトリーアッセイは、Stoye研究所2で最初に開発され、それ以来、 三者モチーフ(TRIM)タンパク質3を含む他の制限因子を調査するように適応されています。これらのアッセイに触発されて、BishopラボはU937細胞におけるSAMHD1制限を分析するための2色アッセイを開発しました。
実験のワークフローを 図 1 に示します。IRESから発現したYFPと並んでSAMHD1をコードするバイシストロンメッセージを含むマウス白血病ウイルス(MLV)様粒子は、U937細胞を形質導入するために使用されます。次に、細胞をホルボールミリスチン酸酢酸塩(PMA)で処理して、静止表現型への分化を誘導します。細胞は次に、赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現するHIV-1ウイルス様粒子に感染する。48時間後、細胞を回収し、2色フローサイトメトリーで分析します。このアッセイは、YFPおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)でも使用されるため、フローサイトメトリー分析に必要な標準的なフィルターの組み合わせが少なくて済みます。HIV-RFPを使用すると、より簡単な補正が可能になり、経験の浅いフローサイトメトリーユーザーでもアッセイにアクセスしやすくなり、ほとんどのサイトメーターで達成できます。
分析中、HIV感染細胞の割合は、SAMHD1発現細胞とSAMHD1を欠く細胞との間で、同じ細胞ウェル内で比較されます。これにより、重要な機能であるウェル/フローサイトメトリーチューブの内部制御が可能になります。形質導入細胞と非形質導入細胞における感染レベルの比較は、制限率を明らかにする。1.0の比率は、形質導入因子が感染力に影響を及ぼさないことを示します。野生型SAMHD1発現は、このアッセイにおけるHIV感染の5倍の減少をもたらし、0.2の制限比に相当する。この効果は、TRIM5などのより古典的な制限因子と比較して控えめですが、それでも効果は再現性があり、修飾SAMHD1発現因子を野生型タンパク質と同等の方法で制限するもの、制限に失敗するもの、および中間表現型を持つものに分類することができます。
このアッセイは、変異SAMHD1配列をコードするウイルスで形質導入することにより、SAMHD1ドメインおよびアミノ酸変異体の制限表現型を特徴付けるために首尾よく使用されています。例えば、HD206-7AAの触媒部位置換は、このアッセイでは制限できない。同様に、異なるテスターウイルスの感受性を決定することができます。例えば、HIV-1逆転写酵素変異体は、SAMHD1媒介制限(例えば、151V4)に対してより感受性である。このプロトコルは、ウイルス様粒子(VLP)産生、SAMHD1発現ベクターによるU937の形質導入、蛍光レポーターを運ぶHIV感染、およびその後のフローサイトメトリーによる分析の詳細を概説しています。この記事では、予想されるデータと、最適ではない結果を回避する方法について説明します。最後に、SAMHD1、dNTPレベル、およびウイルス感染の間の相互作用をより徹底的に理解するために、さまざまなSAMHD1バリアントを調べることに加えて、アッセイの代替用途について概説します。細胞代謝の中心におけるSAMHD1の役割を考えると、癌との関連もあるため、これは引き続き非常に興味深い分野です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FCT122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td>alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>ATCC recommends Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Any bright field light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (4 % in PBS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKB4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY 
			FP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw-cap tubes</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRPSY</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10084450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Trypsin will also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0531</td>
			<td>alternative transfection reagents will also work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells

滅菌αモチーフ/ヒスチジン-アスパラギン酸ドメイン含有タンパク質1(SAMHD1)は、静止骨髄細胞におけるHIV-1の複製を阻害します。U937細胞は、SAMHD1 RNA発現のレベルが低いため、SAMHD1活性を分析するための便利な細胞系として広く使用されており、検出できない内因性タンパク質発現につながります。他のレトロウイルス制限因子を特徴付けるためにストイ研究所で開発された同様のアッセイに基づいて、ビショップラボはU937細胞中のSAMHD1を分析するための2色制限アッセイを開発しました。マウス白血病 SAMHD1を発現するウイルス様粒子は、IRESから発現するYFPとともに、U937細胞を形質導入するために使用されます。次いで、細胞をホルボールミリスチン酸酢酸塩で処理して、静止表現型への分化を誘導する。分化後、細胞は蛍光レポーターを発現するHIV-1ウイルス様粒子に感染する。48時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーで分析します。SAMHD1発現集団におけるHIV感染細胞の割合は、SAMHD1を欠く内部対照細胞におけるそれと比較される。この比較により、制限率が明らかになります。SAMHD1発現は、0.2の制限比に相当するHIV感染の5倍の減少をもたらす。最近、HIV感染のレポーター遺伝子として元のGFPをRFPに置き換えたことで、フローサイトメトリー解析が容易になりました。
このアッセイは、発現ベクターの部位特異的突然変異誘発に由来する、改変されたSAMHD1タンパク質をコードするウイルスで形質導入することにより、SAMHD1制限に対するアミノ酸置換の効果を特徴付けるために首尾よく使用されています。例えば、HD206−7AAの触媒部位置換は、1の制限表現型を示し、制限活性の喪失を示す。同様に、異なるテスターウイルスの感受性を決定することができます。アッセイは、分化状態、代謝状態、およびSAMHD1修飾因子の効果を組み込むようにさらに適合させて、SAMHD1、細胞代謝状態、およびウイルス制限との関係をよりよく理解することができる。

上記の分析の結果、野生型SAMHD1陽性対照では0.25以下、陰性対照では1.0の制限比が得られるはずです。これら2つの品質管理チェックが有効である場合は、結果の統計的有意性を考慮してください。したがって、野生型との有意差を示さないSAMHD1変異体は、この文脈でのSAMHD1制限に影響を与えない置換を有する。野生型と有意に異なるものは、制限障害を示す。これらがネガティブコントロールと有意に異ならない場合、このコンテキストで制限する能力が欠けています(図4 の左側のパネル)。
野生型SAMHD1制限値が0.3より大きい場合、テスターウイルスの結果は指標となる可能性がありますが、信頼することはできません。野生型タンパク質による無効な制限は、再構成からの回復後早すぎる(2週間以内)、またはU937細胞が古すぎる(>2〜3か月)ときにU937細胞を使用することに起因する可能性があります。これらのパラメータは、所与の細胞ストックに対して経験的に決定する必要があるかもしれない。典型的には、継代が低いほど、細胞はより確実に分化し、したがってSAMHD1制限のための適切な環境を提供する。SAMHD1-YFPまたはHIV-RFPのいずれかによる不適切な感染レベルも、補償と制限率の下流の決定の両方を困難にする可能性があります。図 4 の右側のパネルに例を示します。
ネガティブコントロールが1.0から逸脱している場合(0.9〜1.2の範囲外)、これは、感染細胞の割合、ゲーティング戦略、または細胞の健康状態がアッセイに影響を与えている分析に問題があることを示している可能性があります。上記の注を参照してください。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> 図1:概略図のアウトラインプロトコル。 VLP、ウイルス様粒子、PMA、ホルボールミリスチン酸アセテート。番号付きのステージは、プロトコルのステージに対応します。BioRender.com を使用して作成された図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> 図2:レトロウイルスプラスミドの概略図 。 (A)パッケージングベクター (B)転写ベクター (C)VSV-Gエンベロープエクスプレッサー。主要なコーディングと規制要素が示されています。詳細については、 材料表を参照してください。CMV IE:サイトメガロウイルス即時早期プロモーター、BGH:ウシ成長ホルモン、pA:ポリA、RRE:Rev応答要素、CMV-LTR:複合CMV-HIV-1 LTRプロモーター、Psi:HIV-1パッケージングシグナル、cPPT / CTS:中央ポリプリン管/中央終結シーケンス、SV40:サル空胞化ウイルス40。BioRender.com を使用して作成された図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> 図3:フローサイトメトリー解析のためのゲーティング戦略。 (A)補償コントロール:左パネルは、形質導入されていない、感染していないコントロールのインタクト細胞に対するFSC-A / SSC-Aゲーティングを示しています。中央と右のパネルには、YFP(中央)とRFP(右)の単色補正コントロールのスクリーンショットが表示され、補正されていないデータは黒、補正データは青で表示されます。(B)上記の報酬コントロールの対応する報酬マトリックスとプロット。(C)ゲーティング戦略。デブリは、FSC-A/SSC-A(左パネル)によるすべての細胞の分析によって除去されます。ダブレットは、FSCの高さと面積(中央パネル)のゲーティングによって除外されます。右パネルは、野生型SAMHD1によるHIV-1制限の例を示す。軸は、それぞれYFP(SAMHD1)およびRFP(HIV)陽性細胞に対応する補償された青色および黄色のレーザー蛍光を示す。象限ゲートは、RFPとYFPのネガティブコントロールと単色コントロールの比較によって描画されます。数字は親の人口の割合を示します。GFPを使用したYFPの補正値ははるかに高くなりますが、適切なフィルターセットを使用して識別することができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> 図4:期待される結果:理想的なデータと次善のデータ。 (A)最適(左)データと次善(右)データの代表的なYFP/RFPプロット。数字は親の人口の割合を示します。右側のパネルでは、HIV感染が低すぎて、補償とゲーティングが困難になっています。制限率は0.5と予想以上に高い。(B)統計ソフトウェアを使用して生成された野生型(WT、赤)または陰性対照(HD206-7AA、黒)に対するSAMHD1の変異体の制限比のプロット。各ポイントはレプリケート値を表します。平均と標準偏差が表示されます。各群間の対応のあるt検定は、示されたすべての場合において有意であった。左:理想的なデータ-WTは約0.2の期待制限を示し、負の値は1.0を示します。バリアントR372D(灰色)はWTとは有意に異なりますが、陰性対照とは有意ではないため、制限する能力が失われています。右:次善のデータ。ここでは、陰性は期待どおりに動作しますが、感染率が低いため、6つの反復すべてでWTは0.5の制限比しか示していません。グループ内の分散が低いということは、R143HがWTと統計的に異なる中間表現型を示し、負であることを意味しますが、G209Sは制限しません。ただし、ポジティブコントロールは期待される制限比を与えていないため、これは新鮮な細胞で繰り返す必要があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

ここに記載されるのは、細胞抑制性タンパク質SAMHD1によるHIV−1制限の程度を決定するための確立された方法である。ヒト骨髄系譜U937細胞は、YFPを共発現するSAMHD1発現ベクターで形質導入され、分化され、HIV-RFPでチャレンジされます。制限のレベルは、フローサイトメトリー分析によって決定されます。

ヒト骨髄性U937細胞におけるフローサイトメトリーによるSAMHD1制限の解析

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

マクロファージのHIV感染における細胞因子の役割への関心が高まる中、特にU937細胞では発現していないSAM HG ONについて、柔軟な解析システムを開発しました。システムの主な利点は、その柔軟性です。セットアップが完了すると、さまざまなタンパク質、細胞、または標的ウイルスの分析に使用できます。細胞の健康を維持し、マルチカラーフローサイトメトリーに慣れていることが重要です。分析を開始する10分前にサイトメーターとコンピューターの電源を入れます。廃棄物が空で、シースタンクがいっぱいであることを確認してください。次に、ログインして分析ソフトウェアを開きます。アームを動かした後、ウォーターチューブを外します。流量を高く設定し、プライムを押します。ライトが消えるのを待って、このプロセスをさらに3回繰り返します。水管を元に戻し、高流量で3分間運転します。次に、流量を低く設定し、取得するまでスタンバイを押します。実験を選択し、新しい実験を選択し、[OK]を押して空の実験を選択し、実験を右クリックして新しい標本を追加します。OKを押してパネルを空白にします。右クリックして適切な名前に変更し、プラス記号をクリックして試験片を開き、新しいチューブを表示します。チューブをダブルクリックして、インスペクターにサイトメーターの設定を表示します。パラメータメニューで、青色レーザー53030と黄色レーザー61020以外の不要な蛍光色素を削除します。ワークシートで、対応するアイコンをクリックし、軸ラベルをクリックして軸を変更して、前方散布領域対側散布領域ドットプロット、YFPヒストグラム、RFPヒストグラム、およびRFP対YFPドットプロットを作成します。感染していない、トランスデュースされていないコントロールをロードし、マシンで実行を押します。次に、取得ダッシュボードで[取得]を押します。ダッシュボードで前方散乱電圧と側面散乱電圧を調整して、セルを左下の象限に配置します。この人口の周りをゲートし、P oneとしてラベルを付けます。他のプロットを右クリックし、P 1を表示を選択して、後続の解析から破片を除去します。RFP電圧とYFP電圧を下げて、ピークがヒストグラムの左側になるようにします。YFPのシングルカラーコントロールをロードし、取得を押します。ダッシュボードでYFP電圧を調整して、ほとんどの蛍光セルが検出器の範囲内にあるようにします。次に、RFPコントロールについても同じことを繰り返します。実験を選択します。報酬設定に移動し、報酬コントロールの作成を選択し、正常ワークシートに切り替えてから、染色されていない通常のワークシートを選択します。実行を押して、汚れのないコントロールを取得します。無傷のセルの周りにゲートPを1つ描き、記録します。チューブを取り外し、機械をスタンバイ状態にします。P oneを右クリックします。すべての報酬コントロールに適用をクリックし、RFPの通常のワークシートに切り替えます。実行を押して、単色RFPコントロールを記録すると、ソフトウェアは自動的に正のセルをゲートします。マシンをスタンバイ状態にし、YFPコントロールについても同じことを繰り返します。実験を選択し、報酬設定に移動し、報酬の計算を選択してから、リンクをクリックして保存します。グローバルワークシートに切り替えて、試験片チューブに戻ります。HIV RFPに感染した野生型SAM HD 1で形質導入された細胞を取得し、YFPとRFPのために垂直方向と水平方向に整列した象限の隅に4つの異なる集団が見られることを確認します。チューブを取り外し、スタンバイを押します。形質導入されていない、感染していないサンプルをリロードし、runを押します。取得ダッシュボードで、停止ゲートをP oneに設定し、イベントは30, 000イベントを記録するように設定します。レコードを押します。各チューブの間に次のチューブを押して、他のサンプルとコントロールについても同じことを繰り返します。実行中またはホーク後にサンプルの名前を変更し、データをドットFCSファイルとしてエクスポートします。ソフトウェアを開き、すべてのFCSファイルをダッシュボードにドラッグします。報酬コントロールを選択し、報酬サブフォルダーにドラッグします。トランスデュースされていない、感染していないチューブをダブルクリックしてファイルを開き、前方散乱プロットと側方散乱プロットを行います。ポリゴンツールを選択し、左下隅の破片を除く無傷のセル集団にゲートし、セルに名前を付けます。セルが隠れないようにラベルを移動します。このゲートを、すべてのサンプルバーのチューブの母集団全体にドラッグします。水平矢印ボタンを使用して母集団全体をスクロールし、各チューブに適切なゲーティングを確保します。セルをダブルクリックして、軸を高さと面積に調整します。長方形のゲートを使用して単一の大きな母集団を選択し、ダブレットを除外し、ソフトウェアが単一セルとして自動的に名前を付けるように提案できるようにします。次に、このゲートをすべての細胞集団にドラッグし、ゲーティングがすべてのサンプルに適していることを確認します。感染していない、形質導入されていないサンプルの単一細胞集団を選択します。Y軸をYFPの補正された青色レーザーに変更し、X軸をRFPの補正された黄色のレーザーに変更します。象限ゲーティングツールを選択し、負の細胞集団の右上端をクリックします。この予備ゲーティングをすべての単一細胞集団に適用するには、すべてのサンプルバーの親ゲートにドラッグします。象限ゲートで人口が十分に区切られない場合は、ポリゴン ツールを使用して個々の象限をゲートします。野生型SAM HDワンオンリーサンプルまでスクロールして、形質導入されていないYFP陰性細胞とYFP陽性細胞の間の正しいゲーティングを確認します。等高線ビューを使用して、負のセルと薄暗いYFPセルを区別します。すべてのサンプルに有効なYFP陰性と陽性の間の最良の分割を使用し、サンプルをスクロールしてYFP陽性に関してゲーティングを確認します。形質導入されていないHIV RFP感染サンプルまでスクロールし、感染していないRFP陰性と感染RFP陽性の間のゲーティングが正しいかどうかを確認します。必要に応じて等高線ビューを使用し、残りのサンプルをスクロールして、ゲーティングがすべてのサンプルに対して有効であることを確認します。各サンプルには4つの象限が必要です。Q1 YFP陽性、Q2ダブルポジティブ、Q3 RFPポジティブ、Q4ダブルネガティブ。テーブル エディターを開き、4 つの象限ゲートをダッシュボードにドラッグします。ドロップダウンからファイリングとエクセルを選択します。ファイルの保存先を選択し、[テーブルの作成]をクリックします。生成されたスプレッドシートをローカルファイルの命名規則に従って保存します。レイアウトエディタアイコンをクリックして、プロットとゲーティング戦略の表現をエクスポートします。各母集団を選択し、必要な軸、ラベル、間隔を指定してエディターにドラッグします。バッチセクションの下のすべてのサンプルに同じプロットが表示されているレイアウトを作成するには、列に1つを入力し、バッチレポートの作成を押します。ファイルメニューで、幅に合わせて拡大縮小を選択し、改ページを避けます。次に、必要なファイル形式で保存します。エクスポートされたスプレッドシートで、テキスト原稿の説明に従って列を生成します。適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、SAM HD 1つのコンストラクトごとにレプリケートデータを平均し、制限率の値を計算します。代表的なYFP対RFPプロットは、最適および準最適データに対して生成されました。次善のデータプロットは、HIV感染が低すぎて、補償とゲーティングが困難になったことを示しています。制限率は0.5で、予想比の0.3を上回った。SAM HD Oneの変異株について、野生型および陰性対照に対する制限比のプロットを最適および準最適データについて生成した。最適データでは、野生型は約0.2の予想制限を示し、7つのAAに対する陰性対照HD 206の制限比は1.0であった。バリアントR372Dは野生型とは有意に異なっていましたが、陰性対照と有意差はなく、制限する能力を失いました。次善のデータでは、陰性対照は期待どおりに行動したが、野生型は感染率が低いため0.5の制限率を示した。R143Dは、野生型および陰性対照とは統計的に異なる中間表現型を示した。変異体G209Sは野生型とは有意に異なっていたが、陰性対照と有意差はなかったため、制限する能力を失っている。特にフローサイトメトリーを初めて使用する場合は、コントロール細胞をたくさん持つことが重要です。これに続いて、または並行して、同じ変異体の生化学的分析を実行して全体像を形成することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...