Name: analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00
Duration: 9 min 43 s
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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Francis Crick, que recibe su financiación principal de Cancer Research UK (FC001042 y FC001162), el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (FC001042 y FC001162) y el Wellcome Trust (FC001042 y FC001162) y por un Premio Wellcome Trust Investigator a JPS (108012 / Z / 15 / Z). El trabajo en la Universidad de Cambridge fue cofinanciado por el NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MR / S009752 / 1). Este último premio financiado por el Reino Unido forma parte del programa EDCTP2 apoyado por la Unión Europea.

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+(dNTP)+levels.">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li><li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. 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A los efectos del acceso abierto, los autores han aplicado una licencia de derechos de autor pública CC BY a cualquier versión de manuscrito aceptado por el autor que surja de esta presentación. Las opiniones expresadas son las del autor (es) y no necesariamente las del NIHR o el Departamento de Salud y Asistencia Social.

Como se discutió en las notas anteriores, los aspectos críticos del protocolo se centran en retener el fenotipo celular correcto para la producción de VLP y para crear el entorno apropiado para observar la restricción de SAMHD1. En primer lugar, el análisis preciso de la restricción por citometría de flujo de dos colores se basa en lograr proporciones apropiadas de células transducidas e infectadas para que haya suficientes células en cada área de la gráfica para el análisis. Como tal, el investigador debe aspirar a un MOI de menos de 1 (ver Protocolo). Las tasas de transducción e infección que son demasiado altas o demasiado bajas conducen a problemas con el análisis debido a la falta de células no infectadas o doblemente infectadas. Del mismo modo, una tasa de transducción similar para los vectores SAMHD1 que se compararán es clave para permitir que se aplique la misma matriz de compensación y compuerta a todo el experimento, aumentando la confianza en el análisis posterior.
En segundo lugar, la edad de las células U937 utilizadas es un factor clave para diferenciarse con éxito. La diferenciación exitosa puede ser monitoreada a través de la observación de la adherencia, una acidificación reducida de los medios a lo largo del tiempo después de la diferenciación y una restricción adecuada por el control positivo de tipo salvaje en el ensayo. La diferenciación de hasta 5 días ha sido exitosa.
Una de las ventajas clave de este ensayo es su flexibilidad. Una variedad de versiones modificadas de SAMHD1 (dominios, aminoácidos, secuencias de especies) se pueden probar a través de la simple mutagénesis dirigida al sitio del vector o la clonación. Igualmente, se pueden explorar variantes del virus tester. El ensayo se ha utilizado previamente para demostrar que los mutantes de la transcriptasa inversa del VIH-1 con capacidad reducida para unirse a dNTP son más sensibles a la restricción SAMHD1. El mismo principio se puede utilizar para probar la restricción de otros virus por SAMHD1. Además, se pueden utilizar condiciones de diferenciación variables o manipulación artificial de las concentraciones intracelulares de dNTP para investigar aún más la interacción entre las condiciones intracelulares y la actividad de SAMHD1, un área de investigación activa en el laboratorio de Bishop. También se ha descrito la interacción de SAMHD1 con varios inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa, y se ha demostrado el efecto de SAMHD1 utilizando este ensayo modificado para su uso en células primarias12,13,14,15.
La adaptación del protocolo para su uso en células primarias supera la limitación planteada por el examen de fenotipos metabólicos en células transformadas. Sin embargo, el formato existente permite un protocolo conveniente y menos desafiante técnicamente para el análisis de alto rendimiento, especialmente con el uso de un citómetro de flujo con un muestreador de alto rendimiento. Al adaptar el protocolo, se debe considerar la susceptibilidad de las células no transducidas internamente a los efectos espectadores (por ejemplo, señalización inmune).
Al igual que con muchos aspectos de la biología celular, es esencial que tales ensayos se utilicen como parte de un enfoque holístico para comprender un fenómeno determinado. El uso paralelo de ensayos bioquímicos para la actividad SAMHD116, la cuantificación de grupos intracelulares de dNTP y la observación de fenotipos mutantes SAMHD1 en humanos, ex vivo y en modelos animales (llevados a cabo por laboratorios de todo el mundo, algunos descritos en este número) son clave para la comprensión evolutiva de esta proteína compleja.

La proteína estéril que contiene el dominio α-motivo/histidina-aspartato (SAMHD1) impide la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en células quiescentes del linaje mieloide. SAMHD1 bloquea la replicación a través de su actividad enzimática como una trifosfohidrolasa dNTP, lo que resulta en una disminución de los niveles de dNTP intracelulares. Como resultado, el VIH-1 no puede realizar el proceso de transcripción inversa de manera eficiente. Se ha avanzado mucho en los pocos años transcurridos desde esta observación inicial, particularmente con respecto a la contribución de dominios y aminoácidos específicos a la actividad antiviral de SAMHD1. Estas ideas se han realizado utilizando ensayos bioquímicos, así como sistemas celulares que imitan el entorno mieloide quiescente fisiológicamente relevante. Las células U9371 son ampliamente utilizadas como un sistema de células mieloides conveniente para analizar la actividad de SAMHD1. Esto se debe a la falta de expresión endógena de SAMHD1, que se cree que se debe a los bajos niveles de ARN en comparación con las células que expresan SAMHD1 (un área de investigación en curso). Aquí, el protocolo describe la transducción transitoria de células U937 con partículas similares a virus que coexpresan SAMHD1 y un reportero de proteína fluorescente amarilla (YFP) para examinar el mecanismo de restricción SAMHD1 del VIH-1. Tales ensayos transitorios de citometría de flujo de dos colores para examinar las restricciones retrovirales se desarrollaron por primera vez en el laboratorio de Stoye2 y desde entonces se han adaptado para investigar otros factores de restricción, incluidas las proteínas del motivo tripartito (TRIM)3. Inspirado por estos ensayos, el laboratorio Bishop desarrolló un ensayo de dos colores para analizar la restricción de SAMHD1 en células U937.
El flujo de trabajo para el experimento se muestra en la figura 1. Las partículas similares al virus de la leucemia murina (MLV) que contienen un mensaje bicistrónico que codifica SAMHD1 junto con YFP expresado desde un IRES se utilizan para transducir células U937. Luego, las células se tratan con acetato de miristato de forbol (PMA) para inducir la diferenciación a un fenotipo quiescente. Las células se infectan con partículas similares al virus VIH-1 que expresan proteína fluorescente roja (RFP). Después de 48 h, las células se cosechan y se analizan mediante citometría de flujo de dos colores. Este ensayo también se utiliza con YFP y proteína fluorescente verde (GFP), que requiere menos combinaciones de filtros estándar para el análisis de citometría de flujo. El uso de VIH-RFP permite una compensación más directa y, por lo tanto, el ensayo es más fácilmente accesible para los usuarios de citometría de flujo menos experimentados y se puede lograr con la mayoría de los citómetros.
Durante el análisis, la proporción de células infectadas por el VIH se compara entre las células que expresan SAMHD1 y las que carecen de SAMHD1 dentro del mismo pocillo de células. Esto permite un control interno en el tubo de citometría de pozo/flujo, que es una característica clave. La comparación de los niveles de infección en células transducidas y no transducidas revela una relación de restricción. Una proporción de 1,0 indica que el factor transducido no tiene ningún efecto sobre la infectividad. La expresión de SAMHD1 de tipo salvaje conduce a una reducción de cinco veces en la infección por VIH en este ensayo, lo que corresponde a una relación de restricción de 0,2. Si bien este efecto es modesto en comparación con factores de restricción más clásicos como TRIM5, el efecto es, sin embargo, reproducible y permite la clasificación de expresores SAMHD1 modificados en aquellos que se restringen de manera equivalente a la proteína de tipo salvaje, aquellos que no restringen y aquellos con un fenotipo intermedio.
Este ensayo se ha utilizado con éxito para caracterizar el dominio SAMHD1 y los fenotipos de restricción de los mutantes de aminoácidos mediante la transducción con virus que codifican secuencias SAMHD1 mutantes. Por ejemplo, las sustituciones de sitios catalíticos HD206-7AA no se restringen en este ensayo. Igualmente, se puede determinar la susceptibilidad de diferentes virus probadores. Por ejemplo, los mutantes de la transcriptasa inversa del VIH-1 son más susceptibles a la restricción mediada por SAMHD1 (por ejemplo, 151V4). Este protocolo describe los detalles de la producción de partículas similares a virus (VLP), la transducción de U937 con vectores de expresión SAMHD1, la infección con VIH portadora de un reportero fluorescente y el posterior análisis por citometría de flujo. En este artículo se describe qué datos esperar y cómo evitar resultados subóptimos. Finalmente, se describen los usos alternativos para el ensayo, además de examinar diferentes variantes de SAMHD1 para comprender la interacción entre SAMHD1, los niveles de dNTP y la infección viral más a fondo. Dado el papel de SAMHD1 en el centro del metabolismo celular, con vínculos adicionales con el cáncer, esta sigue siendo un área de intenso interés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FCT122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td>alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>ATCC recommends Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Any bright field light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (4 % in PBS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKB4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY 
			FP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw-cap tubes</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRPSY</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10084450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Trypsin will also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0531</td>
			<td>alternative transfection reagents will also work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells

La proteína 1 estéril que contiene el dominio α-motivo/histidina-aspartato (SAMHD1) inhibe la replicación del VIH-1 en células mieloides quiescentes. Las células U937 son ampliamente utilizadas como un sistema celular conveniente para analizar la actividad de SAMHD1 debido a un bajo nivel de expresión de ARN SAMHD1, lo que lleva a una expresión de proteínas endógenas indetectables. Basándose en ensayos similares desarrollados en el laboratorio de Stoye para caracterizar otros factores de restricción retroviral, el laboratorio Bishop desarrolló un ensayo de restricción de dos colores para analizar SAMHD1 en células U937. Las partículas similares al virus de la leucemia murina que expresan SAMHD1, junto con YFP expresada desde un IRES, se utilizan para transducir células U937. Las células se tratan con acetato de miristato de forbol para inducir la diferenciación a un fenotipo quiescente. Después de la diferenciación, las células se infectan con partículas similares al virus VIH-1 que expresan un reportero fluorescente. Después de 48 h, las células se cosechan y se analizan por citometría de flujo. La proporción de células infectadas por el VIH en la población que expresa SAMHD1 se compara con la de las células de control interno que carecen de SAMHD1. Esta comparación revela una relación de restricción. La expresión de SAMHD1 conduce a una reducción de cinco veces en la infección por VIH, lo que corresponde a una relación de restricción de 0,2. Nuestra reciente sustitución de RFP por la GFP original como el gen reportero para la infección por VIH ha facilitado el análisis de citometría de flujo.
Este ensayo se ha utilizado con éxito para caracterizar el efecto de las sustituciones de aminoácidos sobre la restricción de SAMHD1 mediante la transducción con virus que codifican proteínas SAMHD1 alteradas, derivadas de la mutagénesis dirigida al sitio del vector de expresión. Por ejemplo, las sustituciones de sitios catalíticos HD206-7AA muestran un fenotipo de restricción de 1, lo que indica una pérdida de actividad de restricción. Igualmente, se puede determinar la susceptibilidad de diferentes virus probadores. El ensayo se puede adaptar aún más para incorporar el efecto del estado de diferenciación, el estado metabólico y los modificadores de SAMHD1 para comprender mejor la relación entre SAMHD1, el estado metabólico celular y la restricción viral.

Los resultados del análisis anterior deberían arrojar una relación de restricción de 0.25 o menor para el control positivo SAMHD1 de tipo salvaje y 1.0 para el control negativo. Si estos dos controles de calidad son válidos, considere la significación estadística de los resultados. Las variantes de SAMHD1 que no muestran diferencias significativas con respecto al tipo salvaje, por lo tanto, llevan sustituciones que no afectan la restricción de SAMHD1 en este contexto. Aquellos significativamente diferentes del tipo salvaje muestran una restricción deteriorada. Si estos no son significativamente diferentes del control negativo, entonces carecen de la capacidad de restringir en este contexto (Figura 4 paneles izquierdos).
Si el valor de restricción SAMHD1 de tipo salvaje es mayor que 0,3, los resultados de los virus de prueba pueden ser indicativos, pero no se puede confiar en ellos. La restricción ineficaz por proteína de tipo salvaje puede resultar del uso de células U937 demasiado temprano después de la recuperación de la reconstitución (dentro de 2 semanas), o cuando son demasiado viejas (>2-3 meses). Es posible que sea necesario determinar empíricamente estos parámetros para un stock celular dado. Por lo general, cuanto más bajo es el paso, más confiablemente se diferencian las células y, por lo tanto, proporcionan el entorno apropiado para la restricción SAMHD1. El nivel de infección inadecuado con SAMHD1-YFP o VIH-RFP también puede dar lugar a dificultades tanto con la compensación como con la determinación posterior de la relación de restricción. Un ejemplo se ilustra en los paneles de la derecha de la Figura 4.
Si el control negativo se desvía de 1.0 (fuera del rango de 0.9-1.2), esto puede indicar un problema con el análisis, ya sea la proporción de células infectadas, la estrategia de activación o la salud de las células que afectan el ensayo. Consulte las NOTAS anteriores.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> Figura 1: Protocolo de esquema esquemático. VLP, partículas similares a virus, PMA, acetato de forbol miristato. Las etapas numeradas corresponden a etapas en protocolo. Figura producida utilizando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> Figura 2: Esquema de plásmidos retrovirales . (A) Vectores de empaquetamiento (B) Vectores de transferencia (C) Expresor de envoltura VSV-G. Se muestran los elementos clave de codificación y regulación. Para obtener más detalles, consulte la Tabla de materiales. CMV IE: promotor inmediato-temprano del citomegalovirus, BGH: hormona de crecimiento bovino, pA: polyA, RRE: elemento de respuesta Rev, CMV-LTR: promotor compuesto de LTR CMV-VIH-1, Psi: señal de empaquetamiento del VIH-1, cPPT/CTS: tracto central de polipurinas/secuencia de terminación central, SV40: virus vacuolante simio 40. Figura producida utilizando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> Figura 3: Estrategia de gating para el análisis de citometría de flujo. (A) Controles de compensación: el panel izquierdo muestra la activación FSC-A/SSC-A en las células intactas para el control no transducido y no infectado. Los paneles central y derecho muestran capturas de pantalla de controles de compensación de un solo color para YFP (medio) y RFP (derecha) con datos no compensados en negro y compensados en azul. (B) Matriz de compensación correspondiente y parcelas para los controles de compensación anteriores. (C) Estrategia de acceso. Los desechos se eliminan mediante el análisis de todas las células mediante FSC-A / SSC-A (panel izquierdo). Los dobletes se excluyen mediante la puerta en altura FSC versus área (panel central). El panel derecho muestra un ejemplo de restricción del VIH-1 por SAMHD1 de tipo salvaje. Los ejes muestran fluorescencia láser azul y amarilla compensada correspondiente a las células YFP (SAMHD1) y RFP (VIH) positivas, respectivamente. Las puertas de cuadrante se dibujan a través de la comparación de controles negativos y de un solo color para RFP e YFP. Los números indican el porcentaje de la población parental. Los valores de compensación para YFP con GFP serán mucho más altos, pero es posible discriminar utilizando conjuntos de filtros apropiados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> Figura 4: Resultados esperados: datos ideales versus subóptimos. (A) Gráficos representativos de YFP/RFP para datos óptimos (izquierda) y subóptimos (derecha). Los números indican el porcentaje de la población parental. En el panel derecho, la infección por el VIH es demasiado baja, lo que crea dificultades con la compensación y la contratación. La relación de restricción es más alta de lo esperado en 0.5. (B) Gráficos de la relación de restricción para variantes de SAMHD1 con respecto al tipo salvaje (WT, rojo) o el control negativo (HD206-7AA, negro) generado utilizando software estadístico. Cada punto representa un valor de replicación. Se muestran la media y la desviación estándar. Las pruebas t pareadas entre cada grupo fueron significativas en todos los casos esperados donde se mostraron. Izquierda: Datos ideales - WT muestra la restricción esperada de aproximadamente 0.2, negativa muestra 1.0. La variante R372D (gris) es significativamente diferente de WT pero no significativa del control negativo y, por lo tanto, ha perdido la capacidad de restringir. Derecha: Datos subóptimos. Aquí, el negativo se comporta como se esperaba, pero en las seis réplicas el WT solo muestra una relación de restricción de 0.5, debido a la baja tasa de infección. La baja varianza dentro de los grupos significa que R143H muestra un fenotipo intermedio estadísticamente diferente del WT y el negativo, mientras que G209S no restringe; Sin embargo, esto debe repetirse con células frescas ya que el control positivo no ha dado la relación de restricción esperada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Aquí se describe un método establecido para determinar el grado de restricción del VIH-1 por la proteína inhibidora celular SAMHD1. Las células U937 del linaje mieloide humano se transducen con un vector de expresión SAMHD1 que coexpresa YFP, se diferencian y luego se desafían con VIH-RFP. El nivel de restricción se determina mediante análisis de citometría de flujo.

Análisis de la restricción SAMHD1 por citometría de flujo en células mieloides humanas U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Con el creciente interés en el papel de los factores celulares en la infección por VIH de los macrófagos, hemos desarrollado un sistema flexible de análisis, particularmente para SAM HG uno, que no se expresa en las células U937. La principal ventaja del sistema es su flexibilidad. Una vez que está configurado, se puede usar para analizar una variedad de proteínas, células o virus objetivo.Es importante mantener la salud de las células y también sentirse cómodo con la citometría de flujo multicolor. Encienda el citómetro y la computadora 10 minutos antes de comenzar el análisis. Asegúrese de que los residuos estén vacíos y que el tanque de la vaina esté lleno.Luego inicie sesión y abra el software de análisis. Después de mover el brazo, retire el tubo de agua. Ajuste el caudal a alto y pulse prime.Espere a que se apague la luz y repita este proceso tres veces más. Vuelva a colocar el tubo de agua y funcione a un caudal alto durante tres minutos. Luego, ajuste el caudal a bajo y presione el modo de espera hasta la adquisición.Seleccione experimento, nuevo experimento y presione OK para seleccionar experimento en blanco, haga clic derecho en el experimento y agregue una nueva muestra. Presione OK para el panel en blanco. Haga clic derecho para cambiar el nombre con un nombre apropiado y abra la muestra haciendo clic en el signo más para revelar un nuevo tubo.Haga doble clic en el tubo para ver la configuración del citómetro en el inspector. En el menú de parámetros, elimine los fluorocromos no necesarios, excepto el láser azul 53030 y el láser amarillo 61020. En la hoja de cálculo, cree un diagrama de puntos de área de dispersión directa frente a área de dispersión lateral, histograma YFP, histograma RFP y gráfico de puntos RFP versus YFP haciendo clic en el icono correspondiente y cambiando los ejes haciendo clic en la etiqueta del eje.Cargue el control no infectado y no transducido y presione ejecutar en la máquina. A continuación, pulse adquirir en el panel de adquisiciones. Ajuste los voltajes de dispersión directa y lateral en el tablero para colocar las celdas en el cuadrante inferior izquierdo.Puerta alrededor de esta población y etiquétela como P uno. Haga clic derecho en las otras gráficas y seleccione mostrar P uno para eliminar los restos del análisis posterior. Ajuste los voltajes RFP y YFP hacia abajo para que el pico se encuentre a la izquierda del histograma.Cargue el control de color único para YFP y presione adquirir. Ajuste el voltaje YFP en el tablero para que las celdas más fluorescentes estén dentro del rango del detector. A continuación, repita lo mismo para el control RFP.Seleccione el experimento. Vaya a la configuración de compensación y seleccione crear controles de compensación y esté bien para alternar a una hoja de trabajo normal y luego seleccione una hoja de trabajo normal sin teñir. Presione sobre la marcha y adquiera para el control sin mancha.Dibuje una puerta P alrededor de las celdas intactas y registre. Retire el tubo y ponga la máquina en modo de espera. Haga clic derecho en P uno.Haga clic en aplicar a todos los controles de compensación y cambie a la hoja de trabajo normal de RFP. Presione la ejecución y grabe el control RFP de un solo color y el software bloqueará automáticamente las celdas positivas. Ponga la máquina en modo de espera y repita lo mismo para el control YFP.Seleccione experimento, vaya a configuración de compensación, seleccione calcular compensación y luego haga clic en el enlace y guarde. Cambie a la hoja de cálculo global y vuelva al tubo de muestra. Adquirir las células transducidas con SAM HD de tipo salvaje infectadas con RFP de VIH, y comprobar que se pueden ver cuatro poblaciones distintas en las esquinas de los cuadrantes alineadas vertical y horizontalmente para YFP y RFP.Retire el tubo y pulse el modo de espera. Vuelva a cargar la muestra no transducida y no infectada y pulse ejecutar. En el panel de adquisición, establezca la puerta de detención en P uno y los eventos para registrar 30, 000 eventos.Registro de prensa. Repita lo mismo para otras muestras y controles presionando el siguiente tubo entre cada tubo. Cambie el nombre de las muestras mientras se ejecuta o post-hawk, y exporte los datos como archivos punto FCS.Abra el software y arrastre todos los archivos FCS al tablero. Seleccione los controles de compensación y arrástrelos a la subcarpeta de compensación. Haga doble clic en el tubo no transducido y no infectado para abrir el archivo y dispersar hacia adelante una gráfica de dispersión versus lateral.Seleccione la herramienta de polígono y la puerta en la población de celdas intactas, excluyendo los residuos en la esquina inferior izquierda y asígnele el nombre de celdas. Mueva la etiqueta para que no oscurezca las celdas. Arrastre esta puerta a toda la población de tubos en la barra de todas las muestras.Desplácese por toda la población utilizando los botones de flecha horizontal para garantizar la activación adecuada para cada tubo. Haga doble clic en las celdas y ajuste los ejes a la altura frente al área. Seleccione la población grande única utilizando una puerta rectangular para excluir dobletes y permitir que el software sugiera nombrarla como celdas individuales automáticamente.Luego, arrastre esta puerta a todas las poblaciones de celdas y verifique que la puerta cerrada sea apropiada para todas las muestras. Seleccione la población de células individuales para la muestra no infectada y no transducida. Cambie el eje Y a láser azul compensado para YFP y el eje X a láser amarillo compensado para RFP.Seleccione la herramienta de activación por cuadrante y haga clic en el extremo superior derecho de la población de celdas negativas. Aplique esta activación preliminar a todas las poblaciones de células individuales arrastrando a la puerta principal en la barra de todas las muestras. Si las puertas del cuadrante no separan la población satisfactoriamente, compuerta los cuadrantes individuales utilizando la herramienta polígono.Desplácese hasta el tipo salvaje SAM HD una sola muestra para verificar la activación correcta entre las células YFP negativas y YFP positivas no transducidas. Utilice la vista de contorno para discriminar las celdas negativas de las células YFP atenuadas. Use la mejor división entre YFP negativo y positivo que sea válida para todas las muestras y desplácese por las muestras para verificar la activación con respecto a la positividad de YFP.Desplácese hasta la muestra infectada con RFP de VIH no transducida y verifique si la activación entre la RFP negativa no infectada y la RFP positiva infectada es correcta. Utilice la vista de contorno si es necesario y desplácese por las muestras restantes para comprobar que la puerta de acceso es válida para todas las muestras. Cada muestra requiere cuatro cuadrantes.Q1 YFP positivo, Q2 doble positivo, Q3 RFP positivo y Q4 doble negativo. Abra el editor de tablas y arrastre las cuatro puertas del cuadrante al tablero. Seleccione para archivar y sobresalir en el menú desplegable.Elija el destino de su archivo y haga clic en crear tabla. Guarde la hoja de cálculo generada de acuerdo con las convenciones de nomenclatura de archivos locales. Haga clic en el icono del editor de diseño para exportar las representaciones de parcelas y estrategias de acceso.Seleccione cada población y arrástrela al editor con los ejes, el etiquetado y el espaciado necesarios. Para crear un diseño con los mismos gráficos que se muestran para todas las muestras en la sección de lotes, introduzca uno en la columna y pulse crear informe de lotes. En el menú de archivo, seleccione la escala a ancho y evite saltos de página.A continuación, guarde en el formato de archivo requerido. En la hoja de cálculo exportada, genere las columnas como se describe en el texto manuscrito. Utilice el software de análisis de datos adecuado para promediar los datos replicados para cada construcción SAM HD y calcular los valores de la relación de restricción.Se generaron gráficos representativos de YFP versus RFP para datos óptimos y subóptimos. La gráfica de datos subóptimos indica que la infección por VIH era demasiado baja y creaba dificultades con la compensación y la recuperación. La relación de restricción fue de 0,5, que es más alta que la relación esperada de 0,3.Los gráficos de relación de restricción para las variantes de SAM HD uno con respecto al tipo salvaje y control negativo se generaron para los datos óptimos y subóptimos. En los datos óptimos, el tipo salvaje mostró la restricción esperada de aproximadamente 0,2 y el control negativo HD 206 a siete AA tuvo la relación de restricción de 1,0. La variante R372D era significativamente diferente del tipo salvaje, pero no significativamente diferente del control negativo y perdió la capacidad de restringir.En los datos subóptimos, el control negativo se comportó como se esperaba, pero el tipo salvaje mostró una relación de restricción de 0,5 debido a la baja tasa de infección. El R143D mostró un fenotipo intermedio estadísticamente diferente del tipo salvaje y el control negativo. La variante G209S era significativamente diferente del tipo salvaje, pero no significativamente diferente del control negativo y, por lo tanto, ha perdido la capacidad de restringir.Es importante tener muchas de sus células de control, especialmente si es nuevo en la citometría de flujo. Después de esto o en paralelo, se puede llevar a cabo un análisis bioquímico de los mismos mutantes para formar una imagen holística.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...