Name: analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells
Uploaded: 2021-06-13T14:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

Bu çalışma, çekirdek finansmanını Cancer Research UK (FC001042 ve FC001162), İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi (FC001042 ve FC001162) ve Wellcome trust'tan (FC001042 ve FC001162) alan Francis Crick Enstitüsü ve JPS'ye Wellcome Trust Araştırmacı Ödülü (108012 / Z / 15 / Z) tarafından desteklenmiştir. Cambridge Üniversitesi'ndeki çalışmalar, NIHR Cambridge Biyomedikal Araştırma Merkezi, Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) ve İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi (MR / S009752/1) tarafından ortaklaşa finanse edildi. İngiltere tarafından finanse edilen ikinci ödül, Avrupa Birliği tarafından desteklenen EDCTP2 programının bir parçasıdır.

<ol>
	<li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+transient+assay+for+studying+the+genetic+determinants+of+Fv1+restriction.">Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).</li><li>Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trim5alpha+protein+restricts+both+HIV-1+and+murine+leukemia+virus.">Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).</li><li>Arnold, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-dependent+regulation+of+SAMHD1+oligomerisation+couples+catalysis+and+restriction.">Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction.</a> PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).</li><li>Groom, H. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+xenotropic+murine+leukaemia+virus-related+virus+in+UK+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome.</a> Retrovirology. 7, 10 (2010).</li><li>Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+entry+mediated+by+receptor+priming+and+low+pH+triggering+of+an+envelope+glycoprotein.">Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein.</a> Cell. 103 (4), 679-689 (2000).</li><li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+virus+capsids+require+the+cognate+envelope+protein+for+particle+export.">Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export.</a> Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bainbridge, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+to+the+mouse+eye+using+an+HIV-based+lentiviral+vector;+efficient+long-term+transduction+of+corneal+endothelium+and+retinal+pigment+epithelium.">In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium.</a> Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+interferon-stimulated+genes+with+antiretroviral+activity.">Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity.</a> Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculating+HIV-1+infectious+titre+using+a+virtual+TCID50+method.">Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).</li><li>Ordonez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+enhances+nucleoside-analogue+efficacy+against+HIV-1+in+myeloid+cells.">SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells.</a> Scientific Reports. 7, 42824 (2017).</li><li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+specifically+affects+the+antiviral+potency+of+thymidine+analog+HIV+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).</li><li>Huber, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+has+differential+impact+on+the+efficacies+of+HIV+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).</li><li>Amie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+(dNTP)+levels.">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li><li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1.">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li></ol>

Açık Erişim amacıyla, yazarlar bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamışlardır. İfade edilen görüşler yazar(lar)a aittir ve mutlaka NIHR veya Sağlık ve Sosyal Bakım Bakanlığı'nın görüşleri değildir.

Yukarıdaki notlarda tartışıldığı gibi, protokolün kritik yönleri, VLP üretimi için doğru hücre fenotipini korumak ve SAMHD1 kısıtlamasını gözlemlemek için uygun ortamı yaratmak etrafında toplanmaktadır. İlk olarak, iki renkli akış sitometrisi ile kısıtlamanın doğru analizi, transdüke edilmiş ve enfekte olmuş hücrelerin uygun oranlarının elde edilmesine dayanır, böylece grafiğin her alanında analiz için yeterli hücre bulunur. Bu nedenle, araştırmacı 1'den daha az bir MOI'yi hedeflemelidir (bakınız Protokol). Çok yüksek veya çok düşük olan transdüksiyon ve enfeksiyon oranları, enfekte olmamış veya iki kat enfekte olmuş hücrelerin eksikliği nedeniyle analizde sorunlara yol açmaktadır. Aynı şekilde, karşılaştırılacak SAMHD1 vektörleri için benzer bir transdüksiyon oranı, aynı kompanzasyon matrisinin ve geçidin tüm deneye uygulanmasına izin vermenin anahtarıdır ve sonraki analize olan güveni arttırır.
İkincisi, kullanılan U937 hücrelerinin yaşı, başarılı bir şekilde farklılaşıp farklılaşmamalarında önemli bir faktördür. Başarılı farklılaşma, aderans gözlemi, farklılaşmayı takiben ortamın zaman içinde asitlenmesinin azalması ve tahlilde vahşi tip pozitif kontrol ile yeterli kısıtlama ile izlenebilir. 5 güne kadar farklılaşma başarılı olmuştur.
Bu tahlilin en önemli avantajlarından biri esnekliğidir. SAMHD1'in çeşitli modifiye versiyonları (alanlar, amino asitler, tür dizileri), vektörün veya klonlamanın basit bir saha yönelimli mutagenezi ile test edilebilir. Aynı şekilde, test edici virüsün varyantları da araştırılabilir. Tahlil daha önce dNTP'yi bağlama kapasitesi azaltılmış HIV-1 ters transkriptaz mutantlarının SAMHD1 kısıtlamasına karşı daha duyarlı olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Aynı prensip, diğer virüslerin SAMHD1 tarafından kısıtlanmasını test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, değişen farklılaşma koşulları veya hücre içi dNTP konsantrasyonlarının yapay manipülasyonu, hücre içi koşullar ile Bishop laboratuvarında aktif bir araştırma alanı olan SAMHD1 aktivitesi arasındaki etkileşimi daha da araştırmak için kullanılabilir. SAMHD1'in çeşitli nükleozid ters transkriptaz inhibitörleri ile etkileşimi de tanımlanmıştır ve bu tahlil kullanılarak SAMHD1'in etkisi birincil hücrelerde kullanılmak üzere modifiye edilmiştir12,13,14,15.
Primer hücrelerde kullanılmak üzere protokolün uyarlanması, transforme olmuş hücrelerdeki metabolik fenotiplerin incelenmesiyle ortaya çıkan sınırlamanın üstesinden gelir. Bununla birlikte, mevcut format, özellikle yüksek verimli bir örnekleyiciye sahip bir akış sitometresinin kullanılmasıyla, yüksek verim analizi için uygun ve teknik olarak daha az zorlayıcı bir protokole izin verir. Protokolü uyarlarken, dahili olarak dönüştürülmemiş hücrelerin seyirci etkilerine (örneğin, bağışıklık sinyalizasyonu) duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır.
Hücre biyolojisinin birçok yönüyle olduğu gibi, bu tür testlerin belirli bir fenomeni anlamak için bütünsel bir yaklaşımın parçası olarak kullanılması esastır. SAMHD1 aktivitesi16 için biyokimyasal tahlillerin paralel kullanımı, hücre içi dNTP havuzlarının nicelleştirilmesi ve insanlarda, ex vivo ve hayvan modellerinde SAMHD1 mutant fenotiplerinin gözlemlenmesi (dünyadaki laboratuvarlar tarafından yürütülen, bazıları bu sayıda tanımlanmıştır) bu karmaşık proteinin gelişen anlayışı için anahtardır.

Steril α motifli / histidin-aspartat alan içeren protein 1 (SAMHD1), miyeloid soyunun sessiz hücrelerinde İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü tip 1'in (HIV-1) replikasyonunu engeller. SAMHD1, bir dNTP trifosfohidrolaz olarak enzimatik aktivitesi yoluyla replikasyonu bloke eder, bu da hücre içi dNTP seviyelerinin azalmasına neden olur. Sonuç olarak, HIV-1 ters transkripsiyon işlemini verimli bir şekilde gerçekleştiremez. Bu ilk gözlemden bu yana geçen birkaç yıl içinde, özellikle spesifik alanların ve amino asitlerin SAMHD1'in antiviral aktivitesine katkısı konusunda çok ilerleme kaydedilmiştir. Bu içgörüler, biyokimyasal testlerin yanı sıra fizyolojik olarak ilgili sessiz miyeloid ortamını taklit eden hücre sistemleri kullanılarak yapılmıştır. U937 hücreleri1 , SAMHD1 aktivitesini analiz etmek için uygun bir miyeloid hücre sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun nedeni, SAMHD1 ekspresyonuna kıyasla düşük RNA seviyelerine bağlı olduğu düşünülen endojen SAMHD1 ekspresyonunun eksikliğidir (devam eden bir araştırma alanı). Burada, protokol, SAMHD1'in SAMHD1 kısıtlamasının mekanizmasını incelemek için U937 hücrelerinin SAMHD1'i birlikte eksprese eden virüs benzeri parçacıklarla ve sarı bir floresan protein (YFP) muhabiriyle geçici transdüksiyonunu açıklamaktadır. Retroviral kısıtlamaları incelemek için bu tür geçici iki renkli akış sitometri testleri ilk olarak Stoye laboratuvarı2'de geliştirildi ve o zamandan beri üçlü motif (TRIM) proteinleri3 de dahil olmak üzere diğer kısıtlama faktörlerini araştırmak için uyarlandı. Bu tahlillerden esinlenen Bishop laboratuvarı, U937 hücrelerinde SAMHD1 kısıtlamasını analiz etmek için iki renkli bir test geliştirdi.
Deneyin iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bir IRES'ten eksprese edilen YFP ile birlikte SAMHD1'i kodlayan bi-sistronik bir mesaj içeren Murin Lösemi Virüsü (MLV) benzeri parçacıklar, U937 hücrelerini dönüştürmek için kullanılır. Hücreler daha sonra sessiz bir fenotipe farklılaşmayı indüklemek için forbol miristat asetat (PMA) ile muamele edilir. Hücreler daha sonra kırmızı floresan proteini (RFP) eksprese eden HIV-1 virüsü benzeri parçacıklarla enfekte olur. 48 saat sonra, hücreler toplanır ve iki renkli akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tahlil aynı zamanda YFP ve yeşil floresan protein (GFP) ile birlikte kullanılır ve akış sitometrisi analizi için daha az standart filtre kombinasyonu gerektirir. HIV-RFP kullanımı daha basit bir telafi sağlar ve böylece tahlil daha az deneyimli akış sitometrisi kullanıcıları için daha kolay erişilebilir ve çoğu sitometre ile elde edilebilir.
Analiz sırasında, HIV ile enfekte olmuş hücrelerin oranı, SAMHD1 eksprese eden hücreler ile aynı hücre kuyucuğunda SAMHD1'den yoksun olanlar arasında karşılaştırılır. Bu, iyi / akış sitometri tüpünde bir iç kontrol sağlar ve bu da önemli bir özelliktir. Transdüktif ve transdüe edilmemiş hücrelerdeki enfeksiyon düzeylerinin karşılaştırılması, bir kısıtlama oranını ortaya koymaktadır. 1.0 oranı, transdüke faktörün bulaşıcılık üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir. Vahşi tip SAMHD1 ekspresyonu, bu tahlilde HIV enfeksiyonunda beş kat azalmaya yol açar ve bu da 0.2'lik bir kısıtlama oranına karşılık gelir. Bu etki, TRIM5 gibi daha klasik kısıtlama faktörlerine kıyasla mütevazı olsa da, etki yine de tekrarlanabilir ve modifiye SAMHD1 ekspresyonlarının, vahşi tip proteine eşdeğer bir şekilde kısıtlayanlara, kısıtlamayanlara ve ara fenotipe sahip olanlara sınıflandırılmasına izin verir.
Bu test, mutant SAMHD1 dizilerini kodlayan virüslerle transdüks ederek SAMHD1 etki alanı ve amino asit mutantlarının kısıtlama fenotiplerini karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Örneğin, HD206-7AA katalitik alan değişimleri bu tahlilde kısıtlanamaz. Aynı şekilde, farklı test edici virüslerin duyarlılığı da belirlenebilir. Örneğin, HIV-1 ters transkriptaz mutantları SAMHD1 aracılı kısıtlamaya karşı daha hassastır (örneğin, 151V4). Bu protokol, virüs benzeri parçacık (VLP) üretiminin, U937'nin SAMHD1 ekspresyon vektörleri ile transdüksiyonunun, floresan bir muhabir taşıyan HIV enfeksiyonunun ve ardından akış sitometrisi ile yapılan analizin ayrıntılarını özetlemektedir. Bu makalede, hangi verilerin bekleneceği ve optimal olmayan sonuçların nasıl önleneceği anlatılmaktadır. Son olarak, SAMHD1, dNTP seviyeleri ve viral enfeksiyon arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için farklı SAMHD1 varyantlarını incelemenin yanı sıra, tahlil için alternatif kullanımlar özetlenmiştir. SAMHD1'in hücre metabolizmasının merkezindeki rolü göz önüne alındığında, kansere ek bağlantılar ile, bu yoğun bir ilgi alanı olmaya devam etmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FCT122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td>alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>ATCC recommends Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Any bright field light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (4 % in PBS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKB4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY 
			FP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw-cap tubes</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRPSY</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10084450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Trypsin will also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0531</td>
			<td>alternative transfection reagents will also work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells

Steril α motifli / histidin-aspartat alan içeren protein 1 (SAMHD1), sessiz miyeloid hücrelerde HIV-1'in replikasyonunu inhibe eder. U937 hücreleri, düşük seviyede SAMHD1 RNA ekspresyonu nedeniyle SAMHD1 aktivitesini analiz etmek için uygun bir hücre sistemi olarak yaygın olarak kullanılır ve bu da tespit edilemeyen endojen protein ekspresyonuna yol açar. Diğer retroviral kısıtlama faktörlerini karakterize etmek için Stoye laboratuvarında geliştirilen benzer testlere dayanarak, Bishop laboratuvarı U937 hücrelerinde SAMHD1'i analiz etmek için iki renkli bir kısıtlama testi geliştirdi. Murin Lösemi SAMHD1'i eksprese eden virüs benzeri parçacıklar, bir IRES'ten ifade edilen YFP'nin yanı sıra, U937 hücrelerini dönüştürmek için kullanılır. Hücreler daha sonra sessiz bir fenotipe farklılaşmayı indüklemek için forbol miristat asetat ile muamele edilir. Farklılaşmayı takiben, hücrelere floresan bir muhabiri ifade eden HIV-1 virüsü benzeri parçacıklar bulaşır. 48 saat sonra, hücreler toplanır ve akış sitometrisi ile analiz edilir. SAMHD1 eksprese eden popülasyondaki HIV ile enfekte hücrelerin oranı, SAMHD1'den yoksun iç kontrol hücrelerindekiyle karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma bir kısıtlama oranını ortaya koymaktadır. SAMHD1 ekspresyonu, HIV enfeksiyonunda 0.2'lik bir kısıtlama oranına karşılık gelen beş kat azalmaya yol açar. Son zamanlarda HIV enfeksiyonu için muhabir gen olarak orijinal GFP yerine RFP'yi ikame etmemiz, akış sitometri analizini kolaylaştırmıştır.
Bu tahlil, amino asit ikamelerinin SAMHD1 kısıtlaması üzerindeki etkisini, ekspresyon vektörünün bölgeye yönelik mutagenezinden türetilen değiştirilmiş SAMHD1 proteinlerini kodlayan virüslerle dönüştürerek karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Örneğin, HD206-7AA katalitik alan ikameleri, kısıtlama aktivitesinin kaybolduğunu gösteren 1'lik bir kısıtlama fenotipi gösterir. Aynı şekilde, farklı test edici virüslerin duyarlılığı da belirlenebilir. Tahlil, SAMHD1, hücre metabolik durumu ve viral kısıtlama arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için farklılaşma durumunun, metabolik durumun ve SAMHD1 değiştiricilerin etkisini içerecek şekilde daha da uyarlanabilir.

Yukarıdaki analizin sonuçları, vahşi tip SAMHD1 pozitif kontrol için 0.25 veya daha düşük bir kısıtlama oranı ve negatif kontrol için 1.0 olmalıdır. Bu iki kalite kontrol kontrolü geçerliyse, sonuçların istatistiksel önemini göz önünde bulundurun. Bu nedenle, vahşi tipten anlamlı bir fark göstermeyen SAMHD1 varyantları, bu bağlamda SAMHD1 kısıtlamasını etkilemeyen ikameler taşır. Vahşi tipten önemli ölçüde farklı olanlar, bozulmuş kısıtlama gösterir. Bunlar negatif kontrolden önemli ölçüde farklı değilse, bu bağlamda kısıtlama yeteneğinden yoksundurlar (Şekil 4 sol paneller).
Wild-type SAMHD1 kısıtlama değeri 0,3'ten büyükse, test edici virüsler için sonuçlar gösterge niteliğinde olabilir, ancak bunlara güvenilemez. Vahşi tip protein tarafından etkisiz kısıtlama, U937 hücrelerinin sulandırmadan sonra (2 hafta içinde) veya çok yaşlandıklarında (>2-3 ay) çok erken kullanılmasından kaynaklanabilir. Bu parametrelerin belirli bir hücre stoğu için ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir. Tipik olarak, geçiş ne kadar düşük olursa, hücreler o kadar güvenilir bir şekilde farklılaşır ve bu nedenle SAMHD1 kısıtlaması için uygun ortamı sağlar. SAMHD1-YFP veya HIV-RFP ile uygunsuz enfeksiyon seviyesi, hem kompanzasyon hem de kısıtlama oranının aşağı yönde belirlenmesinde zorluklara neden olabilir. Bir örnek, Şekil 4'ün sağ panellerinde gösterilmiştir.
Negatif kontrol 1.0'dan saparsa (0.9-1.2 aralığının dışında), bu, enfekte olmuş hücrelerin oranı, geçit stratejisi veya hücrelerin sağlığı testi etkileyen analizle ilgili bir soruna işaret edebilir. Yukarıdaki NOTLAR'a bakın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> Şekil 1: Şematik anahat protokolü. VLP, virüs benzeri parçacıklar, PMA, forbol miristat asetat. Numaralandırılmış aşamalar protokoldeki aşamalara karşılık gelir. BioRender.com kullanılarak üretilen figür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> Şekil 2: Retroviral plazmidlerin şeması . (A) Ambalaj vektörleri (B) Transfer vektörleri (C) VSV-G zarf ekspresörü. Anahtar kodlama ve düzenleyici öğeler gösterilir. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. CMV IE: sitomegalovirüs hemen-erken promotör, BGH: sığır büyüme hormonu, pA: poliA, RRE: Rev Yanıt Elemanı, CMV-LTR: kompozit CMV-HIV-1 LTR promotörü, Psi: HIV-1 paketleme sinyali, cPPT / CTS: merkezi polipürin yolu / merkezi sonlandırma dizisi, SV40: simian vakumlama virüsü 40. BioRender.com kullanılarak üretilen figür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> Şekil 3: Akış sitometrisi analizi için geçit stratejisi. (A) Telafi kontrolleri: sol panel, dönüştürülmemiş, enfekte olmamış kontrol için dokunaklı hücreler üzerindeki FSC-A / SSC-A geçidini gösterir. Merkezi ve sağ paneller, YFP (orta) ve RFP (sağda) için tek renkli telafisi kontrollerinin ekran görüntülerini, telafi edilmemiş veriler siyah ve mavi olarak gösterir. (B) Yukarıdaki tazminat kontrolleri için karşılık gelen tazminat matrisi ve grafikleri. (C) Geçit stratejisi. Enkaz, tüm hücrelerin FSC-A/SSC-A (sol panel) ile analizi ile elimine edilir. Çiftler, FSC yüksekliğine karşı alana (merkezi panel) göre geçit verilerek hariç tutulur. Sağ panel, vahşi tip SAMHD1 tarafından HIV-1 kısıtlamasının bir örneğini göstermektedir. Eksenler sırasıyla YFP (SAMHD1) ve RFP (HIV) pozitif hücrelere karşılık gelen kompanse mavi ve sarı lazer floresansını gösterir. Kadran kapıları, RFP ve YFP için negatif ve tek renkli kontrollerin karşılaştırılmasıyla çizilir. Rakamlar ebeveyn popülasyonunun yüzdesini gösterir. GFP'li YFP için telafi değerleri çok daha yüksek olacaktır, ancak uygun filtre setleri kullanılarak ayırt edilmesi mümkün olacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> Şekil 4: Beklenen sonuçlar: ideal ve yetersiz veriler. (A) Optimal (sol) ve optimal olmayan (sağ) veriler için temsili YFP/RFP grafikleri. Rakamlar ebeveyn popülasyonunun yüzdesini gösterir. Sağ panelde, HIV enfeksiyonu çok düşüktür ve telafi ve geçit ile ilgili zorluklar yaratmaktadır. Kısıtlama oranı 0,5 ile beklenenden daha yüksektir. (B) İstatistiksel yazılım kullanılarak oluşturulan vahşi tip (WT, kırmızı) veya negatif kontrol (HD206-7AA, siyah) ile ilgili olarak SAMHD1 varyantları için kısıtlama oranı grafikleri. Her nokta bir çoğaltma değerini temsil eder. Ortalama ve standart sapma gösterilmiştir. Her grup arasındaki eşleştirilmiş t-testleri, gösterildiği yerde beklenen tüm vakalarda anlamlıydı. Solda: İdeal veri - WT beklenen kısıtlamayı yaklaşık 0,2, negatif 1,0 gösterir. R372D (gri) varyantı WT'den önemli ölçüde farklıdır, ancak negatif kontrolden önemli değildir ve bu nedenle kısıtlama yeteneğini kaybetmiştir. Sağ: Optimal olmayan veriler. Burada, negatif beklendiği gibi davranır, ancak altı kopyanın hepsinde WT, düşük enfeksiyon oranı nedeniyle yalnızca 0.5'lik bir kısıtlama oranı gösterir. Gruplar içindeki düşük varyans, R143H'nin WT ve negatiften istatistiksel olarak farklı bir ara fenotip gösterdiği anlamına gelirken, G209S kısıtlamaz; ancak, pozitif kontrol beklenen kısıtlama oranını vermediğinden bu taze hücrelerle tekrarlanmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells at JoVE.com

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Burada açıklanan, hücresel inhibitör protein SAMHD1 tarafından HIV-1 kısıtlamasının derecesini belirlemek için kurulmuş bir yöntemdir. İnsan miyeloid soy U937 hücreleri, YFP'yi birlikte eksprese eden bir SAMHD1 ekspresyon vektörü ile dönüştürülür, farklılaştırılır ve daha sonra HIV-RFP ile zorlanır. Kısıtlama seviyesi akım sitometri analizi ile belirlenir.

İnsan Miyeloid U937 Hücrelerinde Akış Sitometrisi ile SAMHD1 Kısıtlamasının Analizi

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Makrofajların HIV enfeksiyonunda hücresel faktörlerin rolüne olan ilginin artmasıyla, özellikle U937 hücrelerinde ifade edilmeyen SAM HG için esnek bir analiz sistemi geliştirdik. Sistemin en büyük avantajı esnekliğidir. Kurulduktan sonra, çeşitli proteinleri, hücreleri veya hedef virüsleri analiz etmek için kullanılabilir.Hücrelerin sağlığını korumak ve ayrıca çok renkli akış sitometrisi ile rahat olmak önemlidir. Analize başlamadan 10 dakika önce sitometreyi ve bilgisayarı açın. Atıkların boş olduğundan ve kılıf tankının dolu olduğundan emin olun.Ardından oturum açın ve analiz yazılımını açın. Kolunu hareket ettirdikten sonra, su tüpünü çıkarın. Akış hızını yüksek olarak ayarlayın ve asal basın.Işığın sönmesini bekleyin ve bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. Su tüpünü geri yerleştirin ve üç dakika boyunca yüksek bir akış hızında çalıştırın. Ardından, akış hızını düşük olarak ayarlayın ve edinime kadar bekleme moduna geçin.Deneme, yeni deneme'yi seçin ve boş deneme seçmek için Tamam'a basın, denemeye sağ tıklayın ve yeni örnek ekleyin. Paneli boşaltmak için Tamam'a basın. Uygun bir adla yeniden adlandırmak için sağ tıklayın ve yeni bir tüp ortaya çıkarmak için artı işaretine tıklayarak örneği açın.Denetçideki sitometre ayarlarını görmek için tüpe çift tıklayın. Parametreler menüsünde, mavi lazer 53030 ve sarı lazer 61020 dışındaki gereksiz florokromları silin. Çalışma sayfasında, ilgili simgeye tıklayarak ve eksen etiketine tıklayarak eksenleri değiştirerek yan dağılım alanı nokta grafiği, YFP histogramı, RFP histogramı ve RFP'ye karşı YFP nokta grafiği için bir ileri dağılım alanı ve yan dağılım alanı nokta grafiği oluşturun.Virüs bulaşmamış, dönüştürülmemiş kontrolü yükleyin ve makinede çalıştır'a basın. Ardından, edinme panosunda acquire (edinim) düğmesine basın. Sol alt kadrandaki hücreleri konumlandırmak için gösterge tablosundaki ileri ve yan saçılma voltajlarını ayarlayın.Bu popülasyonun etrafına kapı açın ve onu P biri olarak etiketleyin. Diğer grafiklere sağ tıklayın ve enkazı sonraki analizden kaldırmak için P'yi bir tane göster'i seçin. RFP ve YFP voltajlarını, tepe noktası histogramın soluna oturacak şekilde ayarlayın.YFP için tek renk kontrolünü yükleyin ve al düğmesine basın. Kontrol panelindeki YFP voltajını, en fazla floresan hücresi dedektör aralığında olacak şekilde ayarlayın. Ardından RFP denetimi için de aynısını tekrarlayın.Denemeyi seçin. Ücret kurulumuna gidin ve ücret denetimleri oluştur'u seçin ve normal bir çalışma sayfasına geçmek için Tamam'ı seçin, ardından lekesiz normal bir çalışma sayfası seçin. Koşuya basın ve lekesiz kontrol için edinin.Sağlam hücrelerin etrafına bir P kapısı çizin ve kaydedin. Tüpü çıkarın ve makineyi bekleme moduna alın. P one'a sağ tıklayın.Tüm ücret kontrollerine uygula'ya tıklayın ve RFP normal çalışma sayfasına geçin. Çalıştırmaya basın ve tek renkli RFP kontrolünü kaydedin ve yazılım otomatik olarak pozitif hücreleri geçecektir. Makineyi bekleme moduna alın ve YFP kontrolü için aynısını tekrarlayın.Denemeyi seçin, ücret kurulumuna gidin, tazminatı hesapla'yı seçin ve ardından bağlantıya tıklayın ve kaydedin. Genel çalışma sayfasına geçin ve numune tüpüne dönün. HIV RFP ile enfekte olmuş vahşi tip SAM HD ile dönüştürülmüş hücreleri edinin ve YFP ve RFP için dikey ve yatay olarak hizalanmış kadranların köşelerinde dört ayrı popülasyonun görülebildiğini kontrol edin.Tüpü çıkarın ve bekleme moduna basın. Dönüştürülmemiş, virüs bulaşmamış örneği yeniden yükleyin ve çalıştır'a basın. Alma panosunda, durdurma kapısını P bir ve olayları 30.000 olay kaydedecek şekilde ayarlayın.Kayıt düğmesine basın. Her tüp arasında bir sonraki tüpe basarak diğer numuneler ve kontroller için de aynısını tekrarlayın. Çalışırken veya hawk sonrası örnekleri yeniden adlandırın ve verileri nokta FCS dosyaları olarak dışa aktarın.Yazılımı açın ve tüm FCS dosyalarını panoya sürükleyin. Ücret denetimlerini seçin ve bunları ücret alt klasörüne sürükleyin. Dosyayı açmak için dönüştürülmemiş, virüs bulaşmamış tüpe çift tıklayın ve bir grafiğin karşı tarafına saçılma scatter'ını iletin.Sol alt köşedeki kalıntıları hariç tutarak sağlam hücre popülasyonundaki çokgen aracını ve kapıyı seçin ve hücreleri adlandırın. Etiketleri, hücreleri gizlemeyecek şekilde hareket ettirin. Bu kapıyı tüm örnekler çubuğundaki tüm tüp popülasyonuna sürükleyin.Her tüp için uygun geçişi sağlamak için yatay ok düğmelerini kullanarak tüm popülasyon arasında gezinin. Hücrelere çift tıklayın ve eksenleri alana karşı yüksekliğe ayarlayın. Çiftleri hariç tutmak ve yazılımın otomatik olarak tek hücreler olarak adlandırmayı önermesine izin vermek için dikdörtgen bir kapı kullanarak tek büyük popülasyonu seçin.Ardından, bu geçidi tüm hücre popülasyonlarına sürükleyin ve geçidin tüm örnekler için uygun olup olmadığını kontrol edin. Enfekte olmamış, dönüştürülmemiş örnek için tek hücre popülasyonunu seçin. Y eksenini YFP için telafi edilmiş mavi lazere ve X eksenini RFP için telafi edilmiş sarı lazere değiştirin.Kadran geçit aracını seçin ve negatif hücre popülasyonunun sağ üst uç noktasına tıklayın. Bu ön geçidi, tüm örnekler çubuğundaki üst kapıya sürükleyerek tüm tek hücreli popülasyonlara uygulayın. Kadran kapıları popülasyonu tatmin edici bir şekilde ayırmazsa, poligon aracını kullanarak bireysel kadranları kapılayın.Dönüştürülmemiş YFP negatif ve YFP pozitif hücreler arasındaki doğru geçidi kontrol etmek için wild tipi SAM HD'ye tek bir örnek kaydırın. Negatif hücreleri loş YFP hücrelerinden ayırmak için kontur görünümünü kullanın. Tüm numuneler için geçerli olan YFP negatif ve pozitif arasındaki en iyi ayrımı kullanın ve geçidi YFP pozitifliğine göre kontrol etmek için numuneler arasında gezinin.Dönüştürülmemiş HIV RFP ile enfekte olmuş örneğe ilerleyin ve enfekte olmamış RFP negatif ile enfekte RFP pozitif arasındaki geçidin doğru olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse kontur görünümünü kullanın ve geçitin tüm örnekler için geçerli olup olmadığını kontrol etmek için kalan örnekler arasında gezinin. Her örnek dört kadran gerektirir.Q1 YFP pozitif, Q2 çift pozitif, Q3 RFP pozitif ve Q4 çift negatif. Tablo düzenleyicisini açın ve dört kadran kapısını panoya sürükleyin. Açılır menüden dosyalamak ve excel seçmek için seçin.Dosya hedefinizi seçin ve tablo oluştur'a tıklayın. Oluşturulan elektronik tabloyu yerel dosya adlandırma kurallarına göre kaydedin. Grafiklerin ve geçit stratejilerinin temsillerini dışa aktarmak için düzen editörü simgesine tıklayın.Her popülasyonu seçin ve gerekli eksenler, etiketleme ve aralıklarla düzenleyiciye sürükleyin. Toplu iş bölümünün altındaki tüm numuneler için gösterilen grafiklerle aynı grafiklere sahip bir düzen oluşturmak için sütuna bir tane girin ve toplu iş raporu oluştur düğmesine basın. Dosya menüsünde, genişliğe ölçeklendirilecek ölçeği seçin ve sayfa sonlarından kaçının.Ardından gerekli dosya biçiminde kaydedin. Dışa aktarılan elektronik tabloda, sütunları metin makalesinde açıklandığı gibi oluşturun. Her SAM HD bir yapı için çoğaltılan verilerin ortalamasını almak ve kısıtlama oranı değerlerini hesaplamak için uygun veri analizi yazılımını kullanın.Optimal ve yetersiz veriler için temsili YFP ve RFP grafikleri oluşturulmuştur. Optimal olmayan veri grafiği, HIV enfeksiyonunun çok düşük olduğunu ve tazminat ve geçit ile ilgili zorluklar yarattığını göstermektedir. Kısıtlama oranı 0,5 idi ve bu da beklenen 0,3 oranından daha yüksekti.SAM HD bir'in vahşi tip ve negatif kontrole göre varyantları için kısıtlama oranı grafikleri, optimal ve yetersiz veriler için oluşturulmuştur. Optimal verilerde, vahşi tip yaklaşık 0.2 beklenen kısıtlamayı gösterdi ve negatif kontrol HD 206 ila yedi AA 1.0 kısıtlama oranına sahipti. R372D varyantı, vahşi tipten önemli ölçüde farklıydı, ancak negatif kontrolden önemli ölçüde farklı değildi ve kısıtlama yeteneğini kaybetti.Optimal olmayan verilerde, negatif kontrol beklendiği gibi davrandı, ancak vahşi tip, düşük enfeksiyon oranı nedeniyle 0.5'lik bir kısıtlama oranı gösterdi. R143D, vahşi tipten ve negatif kontrolden istatistiksel olarak farklı bir ara fenotip gösterdi. G209S varyantı, vahşi tipten önemli ölçüde farklıydı, ancak negatif kontrolden önemli ölçüde farklı değildi ve bu nedenle kısıtlama yeteneğini kaybetti.Kontrol hücrelerinizden bolca olması önemlidir, özellikle de akış sitometrisinde yeniyseniz. Bunu takiben veya paralel olarak, bütünsel bir resim oluşturmak için aynı mutantların biyokimyasal analizi yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...