Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) under IG 2017-ID. 20172-projektet – P.I. Corsi Fabio. SM anerkender Pædiatrisk Klinisk Forskningscenter "Romeo og Enrica Invernizzi", der understøtter hendes position. AB takker AIRC (ID. 20172-projektet) og University of Milan for forskningsstipendi. LS og MS postdoctoral og ph.d.-stipendier er støttet af Universitetet i Milano.

<ol>
	<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer.">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li><li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+and+their+microenvironments:+tilling+the+soil.+Commentary+re:+A.+M.+Scott+et+al.,+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer.">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li><li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+Sanctuary+of+the+devil.">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li><li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+foes+to+friends:+targeting+cancer-associated+fibroblasts.">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li><li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts:+origins,+functions+and+translational+impact.">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Li, X. -. Y., Hu, S. -. Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance.">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li><li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression.">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li><li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer.">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li><li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment.">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, 186-196 (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics.">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts:+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy.">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).</li><li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment.">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li><li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers.">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027 (2020).</li><li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors.">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li><li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;:+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies.">Fibroblast activation protein-&#945;: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;+in+fibrogenic+disorders+and+cancer:+more+than+a+prolyl-specific+peptidase.">Fibroblast activation protein-&#945; in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li><li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin.">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+nanocages:+A+biological+platform+for+drug+delivery,+imaging+and+theranostics+in+cancer.">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size.">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li><li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoferritin+applications+in+nanomedicine.">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li><li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity.">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy.">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li><li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma.">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li><li>Kov&#225;cs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts.">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).</li><li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax.">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328 (2021).</li><li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells.">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li><li>Dvo&#345;&#225;nkov&#225;, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+(CAFs)+for+biomedical+research.">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li><li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages.">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).</li><li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma.">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li><li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression.">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li><li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control.">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li><li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery.">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

CAF'er er ved at opstå som centrale aktører i remodeling ekstracellulære matrix, fremme metastaser progression, og begrænse adgangen til stoffet til tumor site34. Men på grund af deres heterogenitet, deres roller er stadig kontroversielle-nogle CAF'er er tumorigenic, mens nogle andre undertyper synes at have en tumor-undertrykkende rolle. I denne sammenhæng kan deres isolation være af ekstrem interesse for at kaste mere lys over deres meget omdiskutussionelle rolle i kræft progression, som vil have vigtige kliniske konsekvenser12,31. Desuden vil vellykket CAF-udvinding fra humane og prækliniske musetumormodeller også lette udviklingen af nye CAF-målretningslægemidler. Dette papir rapporterer en metode til effektivt at isolere og kultur primære CAF'er fra en syngeneic præklinisk model af brystkræft. Baseret på erfaring påvirker tre eksperimentelle trin for det meste protokollens succes.
Den første arbejder hurtigt for at undgå sammenlægning af celleophæng forbundet med risikoen for koagulation i kolonnen og aftagende celle efflux: faktisk, når celler, der passerede gennem kolonnen blev grupperet sammen, sandsynligheden for en suboptimal isolationsproces steg, og de endelige kulturer indeholdt "forurenende" celle kloner. Den anden er at samle celler fra forskellige tumorer efter udtømning passage for at sikre nok celler, der skal passeres igennem i den endelige berigelse trin. Det sidste kritiske spørgsmål er plating de ekstraherede celler ved høje celletætheder, sandsynligvis startende fra en enkelt brønd af 24-brønd plade til at øge cellevækst og koloni ekspansion for op til 4-5 passager. Hvis cellerne blev sået ved lave tætheder, udvidede de sig på den frie overflade og stoppede hurtigt med at replikere.
Flere undersøgelser har allerede beskrevet CAF ekstraktion metoder af både menneskelig og mus oprindelse, at studere deres rolle i at fremme kræft udvikling og invasivitet. Dette er blevet gjort i mange typer af tumorer, herunder brystkræft, modermærkekræft, cholangiocarcinom, og bugspytkirtel adenocarcinom35,36,37,38. På grund af manglen på specifikke CAF-markører og deres heterogenitet er resultaterne af disse processer dog stadig suboptimale.
Her blev de isolerede celler brugt til at validere CAF-målretningsevnen hos HFn nanocages, der blev funktionaliseret med anti-FAP rettet mod moietier. Anvendelsen af primærkulturer i CAF'er var en betydelig fordel, hvilket gjorde det muligt at validere nanostrategi ex vivo med et meget enklere og omkostningseffektivt bindende eksperiment end at gøre det direkte in vivo i denne indledende fase af nanodrugoptimering.
I den forstand kan ex vivo-test på CAF'er gå forud for in vivo dyreforsøg ved at tillade screening og udvælgelse af de mest lovende nanopartikler til optimal målretning af CAF. CAF-modellen, der præsenteres her, kan også anvendes til indledende effektundersøgelser, når nanopartikler indlæses med aktive lægemidler. Dyr vil først blive brugt senere til at evaluere biodistribution, farmakokinetik og effektundersøgelser.
Flere CAF-målretning nanodrugs er ved at blive udviklet, såsom ferritin nanocages til fotodynamisk behandling i brystkræft og peptid-baserede partikler til at levere doxorubicin i prostatakræft modeller39,40. Der er dog ikke mange undersøgelser, der har fokuseret på isolering af CAF'er som celleplatforme til nanodrugoptimering.
Denne protokol har nogle begrænsninger. For det første er det en tidskrævende protokol, der kræver forberedelse og køb af flere reagenser og materialer. For det andet, på grund af knapheden på CAF'er i 4T1 brysttumor, deres udbytte er lav. Nanopartikler eksperimenter bør planlægges og udføres, så snart det krævede cellenummer er opnået, da primære CAF'er gennemgår senescence og ikke kan opretholdes i kulturen i lang tid. Afslutningsvis kan denne metode til CAFs isolation, dyrkning og karakterisering være et kraftfuldt værktøj til at fremskynde udviklingen af nye målrettede nanomediciner i kampen mod kræft.

I løbet af de sidste årtier er det blevet klart, at dræbe tumorceller normalt ikke er tilstrækkeligt til at udrydde malignitet, da tumormikromiljøet kan fremkalde tumor tilbagefald og fremkalde terapeutisk resistens1,2. Et nyt paradigme er derefter opstået: målretning tumor stroma at fratage tumoren af understøttende faktorer og dermed øge effekten af kemoterapi3,4,5. Især kræft-associerede fibroblaster (CAFs) er en interessant stromal mål i mange solide tumorer6,7. CAF'er er en meget heterogen gruppe af celler, der interagerer med kræftceller og celler i immunsystemet gennem udskillelse af vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner; opbygge og ombygge den ekstracellulære matrix; og aktivere metastaseformation8,9,10,11,12. Afhængigt af tumortypen viser CAF'er pro-tumorigenic funktioner, mens andre undertyper af CAF'er ser ud til at have tumornedsættende funktioner13,14. For bedre at afklare denne dikotomi er en grundig karakterisering af CAF'er fra primære og metastatiske tumorer vigtig.
I denne sammenhæng har et nyt forskningsfelt fokuseret på udvikling af nanosized agenter designet til at målrette og / eller ødelægge CAF'er ved at levere aktive molekyler og lægemidler, der er i stand til at ombygge tumormikromiljøet15,16,17,18. Flere typer af nanopartikler er designet til at opnå CAF ablation af cytotoksiske lægemidler, at fremkalde CAF-målrettet fotodynamisk terapi, eller at omprogrammere CAF'er ved at vende tilbage dem til en quiescent tilstand eller fremkalde TNF-relaterede apoptose induceret ligand udtryk, som fremkalder apoptose af tilstødende kræftceller16,19. Desuden giver mange nanopartiklers potentiale til aktivt at målrette specifikke biologiske markører anledning til håb om at vælge CAF-delmængder, der skal målrettes. Selv om dens absolutte specificitet for CAF stadig er spørgsmålstegn ved, fibroblast aktivering protein (FAP) er en af de mest lovende mål for pro-tumorigenic stroma og udnyttes til at styre nanodrug levering, og dermed bane vejen for udviklingen af CAF-målretning nanoterapeutik20,21,22.
Dette papir beskriver isolering af primære CAF'er fra en syngeneic model af murin brystkræft og rapporterer deres anvendelse i undersøgelsen af målretning evne nanopartikler manipuleret til at genkende CAF markør, FAP. Ferritin nanocages anvendes som kandidat nanosystemer til at oprette metoden, da deres specificitet af levering kan formes ved overfladeeksponeringen af målretning moieties23,24. Desuden har ferritiner med succes vist sig at være fremragende biokompatierbare shuttles til antitumor applikationer, udløser hurtig ophobning af nyttelasten i tumormassen25,26,27. Til dato har prækliniske undersøgelser af CAF-målretning nanosystemer involveret in vitro-test på fibroblast cellelinjer stimuleret i kultur med omdanne vækstfaktor-beta til at fremkalde celle aktivering og udtryk for nogle immunophenotypic funktioner i CAFs28,29. Denne metode anvendes normalt på udødeliggjorte cellelinjer (såsom NIH3T3, LX-2) og er ret hurtig og enkel, hvilket giver aktiverede celler om et par timer eller dage. En begrænsning er, at selv om in vitro stimulation fremkalder ekspressionen af nogle gener tilskrives aktiverede myofibroblasts, kan det ikke helt generogulere alle de biologiske træk ved ægte CAF'er, især deres heterogenitet in vivo.
En anden strategi indebærer udvinding af primære CAF'er fra humane eller mus tumor prøver30,31. Dette sikrer, at CAF-aktivering sker i en fysiologisk sammenhæng, og at CAF-delpopulationernes heterogenitet opretholdes. Ifølge forskningsmålet kan CAF'er udledes af forskellige kilder, hvilket giver mulighed for at studere den mest pålidelige tilstand. Protokollen rapporteret her ville være værdifuldt for forskere, der søger at udføre en foreløbig evaluering af funktionaliteten af nye nanopartikler designet til at målrette CAF'er fra en murine brystkræft model. Isolerede CAF'er ville være nyttige til screening af de nanopartikler, der lover nok til at fortsætte til in vivoevaluering i dyremodeller af kræft. Dette vil være relevant i løbet af de første trin i nanopartikler produktion, kørsel nanoteknologi mod raffinement af nanopartikler design ved primært at overveje strategien for ligand immobilisering for at opnå optimale målretning egenskaber.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Kræft-associerede fibroblaster (CAFs) er centrale aktører i forbindelse med tumor mikromiljø. På trods af at være reduceret i antal i forhold til tumorceller, CAF'er regulere tumor progression og yde beskyttelse mod antitumor immunitet. Nye anticancer strategier har til formål at ombygge tumor mikromiljø gennem ablation af pro-tumorigenic CAFs eller omprogrammering af CAFs funktioner og deres aktivering status. En lovende tilgang er udviklingen af nanosized leveringsmidler, der er i stand til at målrette CAF'er, hvilket muliggør specifik levering af lægemidler og aktive molekyler. I den forbindelse kan en cellulær model af CAF'er være et nyttigt redskab til in vitro-screening og indledende undersøgelse af sådanne nanoformuleringer.
Denne undersøgelse beskriver isolation og kultur af primære CAF'er fra syngeneic 4T1 murine model af triple-negativ brystkræft. Magnetiske perler blev brugt i en 2-trins adskillelse proces til at udtrække CAF'er fra dissocierede tumorer. Immunophenotyping-kontrol blev udført ved hjælp af flowcytometri efter hver passage for at kontrollere procesudbyttet. Isolerede CAF'er kan anvendes til at studere målretning kapacitet forskellige nanoformuleringer designet til at tackle tumor mikromiljø. Fluorescerende mærket H-ferritin nanocages blev brugt som kandidat nanopartikler til at oprette metoden. Nanopartikler, enten nøgne eller konjugeret med en målretning ligand, blev analyseret for deres binding til CAF'er. Resultaterne tyder på, at ex vivo udvinding af bryst CAF'er kan være et nyttigt system til at teste og validere nanopartikler til specifik målretning af tumorigenic CAFs.

In vivo model set-up for optimal CAFs isolation Injektionen af 105 4T1-luc celler i bryst fedt pad af kvindelige BALB / c mus fører til vækst af en påviselig tumormasse på 5 dage efter implantation. Ved at måle tumorvolumen af calipers og tumorcelle levedygtighed af BLI, tumorvækst blev overvåget i en måned efter implantation. For at finde et offervindue, der er tilstrækkeligt til CAFs-isolation, blev der søgt et optimalt kompromis mellem højere tumorstørrelse og BLI på den ene side og en spirende tumorsår og nekrose på den anden side (Figur 1). Som en nekrotisk kerne vises 20 dage efter implantation, og det forstørres ved 25 og 30 dage (som dokumenteret af BLI billeder i Figur 1C), dag 20 blev indstillet som det tidspunkt at optimere celle opsving efter isolationsprocessen. Selv efter omhyggeligt at fjerne alle synlige nekrotiske områder under de første trin i tumorhåndtering ex vivo, blev der fundet en høj procentdel af døde celler i slutningen af dissociation i enkelte celler (Tabel 1). Da denne procentdel kan være relevant, især med stigningen i tumorstørrelse, er fjernelse af døde celler altid nødvendig, når du arbejder med 4T1-modellen.
Optimering af CAFs isolationsprocedure, kultur og karakterisering To yderligere passager er nødvendige for at isolere befolkningen i CAF'er (CD90.2+ CD45-) fra panelet af indsamlede levedygtige celler: udtømning af ikke-tumor-associerede fibroblaster og berigelse af tumor-associerede fibroblaster (Figur 2). Udtømning perle cocktail effektivt fjerner CD45+ celler (tegner sig for 67,35% og 0,69% af de samlede celler før og efter udtømning, henholdsvis tabel 2), og blev altid brugt til at behandle en enkelt tumor i hver kolonne. Som vist i tabel 1faldt antallet af eluterede celler fra et gennemsnit på 3 × 106 til 1 × 105 efter udtømningstrinnet. På grund af dette massive fald i det samlede celletal er det praktisk at samle de indsamlede celler fra mindst 2 til maksimalt 4 tumorer i et enkelt rør, før du fortsætter med berigelsestrinnet. Ved at gøre dette, et tilstrækkeligt antal celler blev opnået til inkubation med tumor-associerede fibroblast perler og passerede gennem en enkelt adskillelse kolonne for at opnå et endeligt gennemsnit på 93% af CD90.2+ CD45- celler (Tabel 2).
Når seedet på væv kultur plader, disse genvundet celler knyttet til plast og afslørede en stor spindel-formet morfologi typisk for fibroblaster (Figur 3A,B) og forskellig fra 4T1 tumorceller (Figur 3D). Ikke samle tumorer efter udtømning forårsager cellulære udbytte med tumor-associerede fibroblast mikroperler at være for lav til at etablere en kultur. I andre tilfælde, når inkubationernes varighed og temperatur med mikroperler ikke opretholdes omhyggeligt, kan der forekomme en ikke-specifik binding. I sådanne tilfælde var berigelsestrinene mindre effektive, og der blev genvundet højere procentdele af CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45 - cd45- celler sammen med CD90.2+ CAF'erne (henholdsvis 5,97 ± 1,5 og 16,75 ± 1,1) (figur 4 og tabel 3). Disse forurenende celler var sandsynligvis ansvarlige for tilstedeværelsen i kulturen af små kloner med forskellige morfologi (Figur 4B, sorte pilespidser), der voksede hurtigere end CAF'er og sejrede over den primære CAF kultur (Figur 4C). Disse suboptimale resultater bekræftede vigtigheden af altid at dobbelttjekke både CD90.2- og CD45-udtryk samt cellemorfologi i slutningen af berigelsesprocessen og under cellevækst i kulturen.
Brug af isolerede celler til at evaluere CAF-målretningspotentialet for manipulerede nanodrugs De nyisolerede CAF'er kan bruges til flere applikationer lige fra grundforskning til farmakologiske undersøgelser. Denne gruppes mål er at udvikle HFn nanocages, der specifikt kan målrette CAF'er. HFn blev funktionaliseret med et specifikt anti-FAP antistoffragment (HFn-FAP) ved to forskellige protein:antistofforhold (en lavere 1:1 og en højere 1:5), og deres binding med CAF'er blev testet. Da FAP blev brugt som overfladebiomarkør for pro-tumorigenic CAF'er, var det af grundlæggende betydning at kontrollere FAP-udtryk på isolerede CAF'er (Figur 3C). FAP udtryk blev fulgt over 5 passager i kultur for at bekræfte, at den primære CAF kultur fastholdt sine oprindelige egenskaber.
FAP-funktionalisering på HFn viste sig at bidrage til et betydeligt skift i retning af CAF-målretning sammenlignet med bar HFn, og den lavere mængde antistof (1:1) var nok til at observere denne effekt (Figur 5A). Dette blev dog ikke observeret med tumoren 4T1 celler, der anvendes til at oprette in vivo tumor model, hvori nøgne HFn viste højere binding end funktionaliseret HFn (Figur 5B). Dette skyldtes sandsynligvis fraværet af FAP-overekspression i 4T1-celler og den præferenceinteraktion af HFn med TfR1, som regulerer HFn-optagelse i celler, som bredt rapporteret af denne gruppe27,33. Disse resultater bekræfter nytten af at bruge primære kulturer af bryst CAF'er til foreløbigt at screene målretning kapacitet nanopartikler designet til at tackle tumor mikromiljø.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Figur 1: Etablering af 4T1 tumor model. Celler (105 celler/mus) blev sprøjtet ind i brystfedtpuden. Tumorvæksten blev efterfulgt i dag 5, 10, 15, 20, 25 og 30 efter implantation (A) ved at måle tumorvolumen med calipers og (B) ved bioluminescensbilleddannelse. Tumorvolumener og BLI udtrykkes som henholdsvis mm3 og tæller. Resultaterne rapporteres som gennemsnitlige ± SEM (n=6). (C) BLI ' repræsentative billeder der er indsamlet 5, 10, 15, 20, 25 og 30 dage efter celleimplantatering bekræfter tumorvækst indtil dag 25, hvor det ser ud til at nå et plateau. På sidste analysepunkt (30 dage) stiger BLI ikke sammenlignet med dag 25. Fra dag 20 begynder områder med nekrose og sårdannelse at blive synlige i den centrale del af tumoren. Farveskala: Min = 1.194, Maks . = 20.462. Forkortelser: BLI = bioluminescensbilleddannelse; SEM = standardfejl i middelværdien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Figur 2: Forberedelse af tumorprøve og flowcytometrikarakterisering af isolerede CAF'er. Tumorer blev fjernet og reduceret til (A)små stykker på ca. 1-2 mm ved hjælp af en skalpel; (B) enkeltcelleopsepension efter væv fordøjelse og mekanisk dissociation af en fjernet tumor; (C) cellepille, der er fremstillet efter lysis af røde blodlegemer; (D) flowcytometrianalyse af CD45 og CD90.2 udtryk i celler, der er opnået efter fjernelse af røde blodlegemer og døde celler , (E) efter udtømning af ikke-kræftrelaterede fibroblaster og (F) efter berigelse af kræftrelaterede fibroblaster, hvor størstedelen af cellerne er CD90,2+ CD45- (blåt rektangel). Forkortelser: CAF'er= kræftrelaterede fibroblaster; CD = klynge af differentiering; PE-A = phycoerythrin; FITC-A = områder af fluorescein isothiocyanat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Figur 3: Morfologisk analyse af CAF'er og FAP-udtryk. (A, B) CAFs morfologi blev kontrolleret i alle kulturpassager ved optisk mikroskopi (forskellige niveauer af sammenløb ved passage 2 og passage 5) og sammenlignet med (D) 4T1 tumorceller; skalabarer = 10 μm. (C) Fibroblast activation protein (FAP) udtryk blev evalueret ved flowcytometri i slutningen af isolationsprocessen på de indsamlede CD90.2+ CD45- celler for at bekræfte deres molekylære egenskaber. Der blev fastsat en fluorescenstærskel for ikke-farvede kontrolceller (rød graf) for at kvantificere den gennemsnitlige fluorescensintensitet og procentdelen af positive celler (FAP+) blandt antistofplettede celler (blå graf). Forkortelser: CAF'er= kræftrelaterede fibroblaster; FAP = fibroblast aktivering protein; CD = klynge af differentiering; MFI = middel fluorescensintensitet; Ab = antistof; FITC-A = område af fluorescein isothiocyanat; FAP+ = FAP-positive celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Figur 4: Eksempel på en suboptimal CAFs-isoleringsproces. (A) Flowcytometrievaluering efter det endelige isolationstrin afslørede tilstedeværelsen af forurenende CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45- celler. (B) Disse celler kan ses som kloner med lille rund morfologi ved såning (sorte pilespidser og indsat i nederste venstre hjørne af panelet), at (C) sejrede over CAF'er efter den tredje passage i kulturen. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: CAF = kræftrelateret fibroblast; CD = klynge af differentiering; PE-A = phycoerythrin; FITC-A = områder af fluorescein isothiocyanat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Figur 5: Binding af HFn nanocages på CAF'er og 4T1. HFn nanocages var fluorescerende mærket med FITC, funktionaliseret med et anti-FAP antistoffragment (HFn-FAP) ved to forskellige proteinantistofforhold (1:1 og 1:5) og inkuberet med (A) mål-CAF'er og (B) 4T1-celler ved 4 °C i 2 timer. Bindingen blev evalueret ved flowcytometri. (A) HFn-FAP-binding med CAFF'er øges betydeligt ved begge antistoffragmentkoncentrationer med tre gange sammenlignet med bar HFn. (B) i modsætning hertil blev der observeret en signifikant højere binding af bar HFn i 4T1-celler, hvor bindingen ikke forstærkes af FAP-genkendelse. Resultaterne rapporteres som gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige eksperimenter. p = 0,0003; °° p = 0,0021; °°° p = 0,0008. Forkortelser: CAF'er= kræftrelaterede fibroblaster; FAP = fibroblast aktivering protein; HFn = rekombinant variant af human ferritin tung kæde, der anvendes som bar nanopartikler eller konjugeret; HFN-FAP = HFn nanopartikler funktionaliseret med den variable del af et anti-FAP antistof fremstillet ved to HFn:Fab@FAP molarforhold, 1:1 og 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Celletal (gennemsnitlig ± SD)</td>
			<td>Udvindingsydelse i alt (pr. passage)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjernet tumor (Post rød blodcelle fjernelse)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjernet tumor (Post døde celle fjernelse)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post udtømning cocktail</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter berigelse</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Samlet celletal efter hvert trin i isolation af kræftrelaterede fibroblaster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cellefordeling (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjernet tumor (Post døde celle fjernelse)</td>
			<td>1.81 ± 0,98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post udtømning cocktail</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0,14 ± 0,13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter berigelse</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Cellefordeling i henhold til udtryk af CD90.2 og CD45 efter hver passage af isolation af kræftrelaterede fibroblaster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cellefordeling (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Postberigelse (ingen sammenlægning)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1.49 ± 0,4</td>
			<td>5.97 ± 1.5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: CD90.2- og CD45-udtryk af celler indsamlet efter et suboptimalt kræftrelateret fibroblastisolationseksperiment.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Dette papir har til formål at give en protokol for isolering og kultur af primære kræft-associerede fibroblaster fra en syngeneic murin model af triple-negativ brystkræft og deres anvendelse for den prækliniske undersøgelse af nye nanopartikler designet til at målrette tumor mikromiljø.

Isolering af primær cancer-associerede fibroblaster fra en Syngeneic Murine Model af brystkræft til undersøgelse af målrettede nanopartikler

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Denne protokol gør det muligt at isolere og kultur primær kræft forbundet fibroblaster fra murin brystkræft, at screene nye nanopartikler designet til at målrette tumor mikro miljø. Primær CAF repræsenterer den mest pålidelige og fysiologiske model for in vitro undersøgelser af tumor stroma. I denne protokol beskriver vi, hvordan man opnår et optimalt udbytte.Til at begynde med forberede en fordøjelse mix til tumor dissociation, og suge de tre til fem millimeter tumor fragmenter i opløsningen efter tæt lukning af røret. Vend røret på hovedet og kontroller, at alle tumorstykker er i bunden af røret mod hætten. Derefter fastgøres røret til en mekanisk dissociater i det rigtige hus, og kør et dissociationsprogram specielt designet til hårde tumorer.Efter kørslen skal du løsne røret og placere det på hovedet for at inkubere prøven ved 37 grader Celsius i 40 minutter med blid rysten. Derefter sætte røret på dissociater i den rette bolig, og køre dissociation program for hårde tumorer to gange, at sikre ingen store væv stykker tilbage i slutningen af proceduren. Prøven filtreres gennem en 40 mikron celles si i et 50 milliliterrør.Vask derefter filteret med 10 milliliter RPMI 1640 medium og centrifuge. Efter centrifugering skal pelleten genbruges i PBE-buffer, der består af PBS, 0,5% BSA og to millimolar EDTA, og tælle cellerne med Trypan Blue. Reparer bindingsbufferen for død celle ved at fortynde 20X bindingsbufferopløsningen med sterilt dobbeltdestilleret vand.Vask cellerne med fem milliliter 1X bindingsbuffer og centrifuge. Efter centrifugering skal cellepillen genbruges med 0,1 milliliter af døde cellefjernelsesmikuer i op til 10 til de syvende celler og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter. Under inkubationen forberedes en magnetisk stand under emhætten og hænger ferromagnetiske adskillelseskolonner på den, med spidserne pegende ned.Ekvilibrere kolonnerne med 0,5 milliliter koldbindingsbuffer, og vent, indtil opløsningen er strømmet igennem. Efter inkubation tilsættes 400 mikroliter koldbindingsbuffer til perle- og celleaffjedringen. Læg hele volumen på kolonnen og opsamle spildevandet i et 15 milliliterrør.Vask kolonnen fire gange med 0,5 milliliter koldbindingsbuffer, og opsamle det samlede spildevand i samme rør. For udtømning af ikke-kræft associerede fibroblaster, filtrere celle suspension ved hjælp af en 70 mikron celle si fugtet med PBS, og centrifuge cellerne. Fjern supernatanten, og brug pelleten i 80 mikroliter kold PBE-buffer.Tilføj 20 mikroliter af ikke tumor-associerede fibroblast udtømning cocktail. Bland godt, og inkuber prøven ved 4 grader Celsius i 15 minutter i mørket. Under inkubationen med perler forberede ferromagnetiske udtømning kolonner på en magnetisk stativ.Ekvilibrere kolonnerne med to milliliter kold PBE-buffer og vent, indtil opløsningen er strømmet igennem. Efter inkubation tilsættes 400 mikroliter buffer til perle- og celleaffjedringen. Læg hele volumen på kolonnen og opsamle spildevandet i et 15 milliliterrør.Vask kolonnen to gange med to milliliter PBE. Opsamle det samlede spildevand i samme rør, og centrifugere spildevandet. For det positive udvalg af kræft-associerede fibroblaster, genbruge pellet i 80 mikroliter af kolde PBE buffer.Derefter ved 20 mikroliter af tumor-associerede fibroblaster mikroperler, og inkubere prøverne ved 4 grader Celsius i 15 minutter i mørke. Under inkubation forberede ferromagnetiske adskillelse kolonner på en magnetisk stativ og ekvilibrere dem med 0,5 milliliter kold PBE buffer. Efter inkubation tilsættes 400 mikroliter PBE til perle- og celleaffjedringen.Læg hele volumen på kolonnen, og lad de umærkede celler strømme igennem i et 15 milliliterrør. Vask kolonnen tre gange med 0,5 milliliter PBE buffer, og opsamle det samlede spildevand i samme rør. Fjern kolonnen fra magneten og læg den i et 1,5 milliliterrør.Tilsæt en milliliter PBE på kolonnen, og skub straks stemplet ind i kolonnen for at skylle cellerne ud. Efter centrifugering, genbruge celle pellet i et passende volumen af DMEM, og frø cellerne i en vævskultur plade. Kontroller celletætheden under et mikroskop, og placer pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid for at gøre det muligt for cellerne at klæbe og vokse.Injektionen af 4T1 luciferaseceller i brystfedtpuden af hunmus førte til væksten af en påviselig tumormasse fem dage efter implantation. For at finde et offer vindue, der er tilstrækkeligt til CAF isolation, et optimalt kompromis blev søgt mellem højere tumor størrelse og bioluminescens billeddannelse på den ene side, og en spirende tumor ulceration og nekrose på den anden side. Dag 20 blev sat som det tidspunkt for at optimere cellegendannelsen efter isolationsprocessen.To yderligere passager var nødvendige for at isolere befolkningen i CAF'er, fra panelet af indsamlede levedygtige celler, udtømning af ikke tumor associerede fibroblaster, og berigelse af tumor associerede fibroblaster. CAF celler afslørede store spindel formet morfologi, typisk for fibroblaster, og var forskellige fra 4T1 tumorceller. FAP udtryk fulgt over fem passager bekræfter, at primær CAF kultur fastholdt sine oprindelige egenskaber.Når inkubationernes varighed og temperatur med mikroperler ikke blev opretholdt, blev kloner med forskellig morfologi fundet blandt den isolerede kultur. Disse forurenende celler voksede hurtigere og sejrede over den primære CAF-kultur. CAF'er, der var bindet med human ferritin hfn-FAP-funktionaliseret nanostof, steg med en-til-en og en-til-fem antistoffragmentkoncentrationer med tre gange sammenlignet med bar HFN.Tværtimod, for tumor 4T1 celler, bare HFN viste højere binding end funktionaliseret HFN. For at øge udbyttet urenhed af isolerede CAF, holde buffere koldt, respektere inkubationstid med perler, og trække op til fire tumorer pr kolonne før den endelige berigelse trin. De isolerede CAF'er kan bruges til at screene flere kandidat nano lægemidler i form af bindende, optagelse, og farmakologisk effekt, før du fortsætter med prækliniske in vivo eksperimenter.CAF isolation tillod os at teste, om nanopartikler kan bruges til at målrette tumor mikromiljø. Således bane vejen for nye målrettede behandlinger, der arbejder i synergi med kemoterapi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancer Effekten af ​​Fotodynamisk terapi med lungekræft-Målrettet Nanopartikler

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection Model at studere levermetastaser af brystkræft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

En syngen musemodel af metastaserende renalcellecarcinom for Kvantitativ og Longitudinal Vurdering af Prækliniske Terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En mus Model af træthed induceret af perifere Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En Syngeneic bugspytkirtelkræft musen Model til at studere virkningerne af irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En bioluminescerende og fluorescerende Orthotopic Syngeneic Murine Model af Androgen-afhængige og kastration-resistente prostatakræft

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunofænotypning af Orthotopic Homograft (Syngeneic) af Murine primære KPC pancreas duktalt adenokarcinom ved flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic Transplantation af Syngeneic lunge adenocarcinom celler at studere PD-L1 udtryk

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...