Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) onder IG 2017-ID. 20172 project – P.I. Corsi Fabio. SM erkent Pediatric Clinical Research center "Romeo and Enrica Invernizzi" dat haar positie ondersteunt. AB bedankt AIRC (ID. 20172 project) en Universiteit van Milaan voor onderzoeksbeurs. LS en MS postdoctorale en doctorale beurzen worden ondersteund door de Universiteit van Milaan.

<ol>
	<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer.">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li><li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+and+their+microenvironments:+tilling+the+soil.+Commentary+re:+A.+M.+Scott+et+al.,+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer.">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li><li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+Sanctuary+of+the+devil.">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li><li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+foes+to+friends:+targeting+cancer-associated+fibroblasts.">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li><li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts:+origins,+functions+and+translational+impact.">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Li, X. -. Y., Hu, S. -. Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance.">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li><li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression.">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li><li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer.">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li><li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment.">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, 186-196 (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics.">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts:+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy.">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).</li><li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment.">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li><li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers.">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027 (2020).</li><li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors.">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li><li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;:+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies.">Fibroblast activation protein-&#945;: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;+in+fibrogenic+disorders+and+cancer:+more+than+a+prolyl-specific+peptidase.">Fibroblast activation protein-&#945; in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li><li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin.">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+nanocages:+A+biological+platform+for+drug+delivery,+imaging+and+theranostics+in+cancer.">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size.">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li><li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoferritin+applications+in+nanomedicine.">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li><li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity.">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy.">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li><li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma.">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li><li>Kov&#225;cs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts.">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).</li><li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax.">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328 (2021).</li><li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells.">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li><li>Dvo&#345;&#225;nkov&#225;, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+(CAFs)+for+biomedical+research.">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li><li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages.">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).</li><li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma.">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li><li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression.">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li><li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control.">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li><li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery.">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

CAFs zijn in opkomst als belangrijke spelers in het remodellereren van extracellulaire matrix, het bevorderen van metastaseprogressie en het beperken van de toegang tot geneesmiddelen tot de tumorplaats34. Vanwege hun heterogeniteit zijn hun rollen echter nog steeds controversieel - sommige CAFs zijn tumorgeen, terwijl sommige andere subtypen een tumoronderdrukkende rol lijken te hebben. In deze context kan hun isolatie van extreem belang zijn om meer licht te werpen op hun veelbesproken rol in de progressie van kanker, die belangrijke klinische implicaties zal hebben12,31. Bovendien zou succesvolle CAF-extractie uit menselijke en preklinische muistumormodellen ook de ontwikkeling van nieuwe CAF-gerichte geneesmiddelen vergemakkelijken. Dit artikel rapporteert een methode om primaire CAFs efficiënt te isoleren en te culeren uit een syngenetisch preklinisch model van borstkanker. Op basis van ervaring hebben drie experimentele stappen vooral invloed op het succes van het protocol.
De eerste werkt snel om aggregatie van celsuspensies geassocieerd met het risico op stolling in de kolom en vertragende celefflux te voorkomen: in feite, wanneer cellen die door de kolom gingen samen werden geclusterd, nam de kans op een suboptimaal isolatieproces toe en de laatste culturen bevatten "contaminant" celklonen. De tweede is het poolen van cellen van verschillende tumoren na de depletiepassage om voldoende cellen te garanderen om door te gaan in de laatste verrijkingsstap. Het laatste kritieke probleem is het platen van de geëxtraheerde cellen bij hoge celdichtheden, hoogstwaarschijnlijk beginnend bij een enkele put van de 24-putplaat om de celgroei en kolonie-uitbreiding voor maximaal 4-5 passages te stimuleren. Als de cellen bij lage dichtheden werden gezaaid, breidden ze zich uit op het vrije oppervlak en stopten ze snel met repliceren.
Verschillende studies hebben al CAF-extractiemethoden van zowel menselijke als muisoorsprong beschreven, om hun rol bij het bevorderen van de ontwikkeling en invasiviteit van kanker te bestuderen. Dit is gedaan in vele soorten tumoren, waaronder borstkanker, melanoom, cholangiocarcinoom en pancreasadeenocarcinoom35,36,37,38. Door het ontbreken van specifieke CAF-markers en hun heterogeniteit zijn de resultaten van deze processen echter nog steeds suboptimaal.
Hier werden de geïsoleerde cellen gebruikt om het CAF-targeting vermogen van HFn nanocages gefunctionaliseerd met anti-FAP targeting moieties te valideren. Het gebruik van primaire culturen van CAFs was een belangrijk voordeel, waardoor de validatie van de nanostrategie ex vivo mogelijk was met een veel eenvoudiger en kosteneffectief bindingsexperiment dan het direct in vivo te doen in deze voorbereidende fase van nanodrug-optimalisatie.
In die zin kunnen ex vivo testen op CAFs voorafgaan aan in vivo dierproeven door de screening en selectie van de meest veelbelovende nanodeeltjes mogelijk te maken voor de optimale targeting van CAF. Het hier gepresenteerde CAF-model kan ook worden gebruikt voor voorlopige werkzaamheidsstudies, bij het laden van nanodeeltjes met actieve geneesmiddelen. Dieren zullen pas later worden gebruikt om biodistributie, farmacokinetiek en werkzaamheidsstudies te evalueren.
Verschillende CAF-gerichte nanodrugs worden ontwikkeld, zoals ferritine nanocages voor fotodynamische therapie bij borstkanker en op peptiden gebaseerde deeltjes om doxorubicine te leveren in prostaatkankermodellen39,40. Er zijn echter niet veel studies gericht op de isolatie van CAFs als celplatforms voor nanodrugsoptimalisatie.
Dit protocol heeft enkele beperkingen. Ten eerste is het een tijdrovend protocol, dat de voorbereiding en aankoop van verschillende reagentia en materialen vereist. Ten tweede, vanwege de schaarste aan CAFs in de 4T1-borsttumor, is hun opbrengst laag. Nanodeeltjesexperimenten moeten worden gepland en uitgevoerd zodra het vereiste celnummer is bereikt, omdat primaire CAFs senescentie ondergaan en niet lang in cultuur kunnen worden gehouden. Kortom, deze methode van CAFs isolatie, kweken en karakterisering kan een krachtig hulpmiddel zijn om de ontwikkeling van nieuwe gerichte nanogeneesmiddelen in de strijd tegen kanker te versnellen.

In de afgelopen decennia is het duidelijk geworden dat het doden van tumorcellen meestal niet voldoende is om maligniteit uit te roeien, omdat de tumormicro-omgeving tumorherval kan veroorzaken en therapeutische resistentie kan induceren1,2. Er is toen een nieuw paradigma ontstaan: gericht op tumorstroma om de tumor van ondersteunende factoren te beroven en zo de werkzaamheid van chemotherapeutica te verhogen3,4,5. In het bijzonder zijn kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) een interessant stromale doelwit in veel solide tumoren6,7. CAFs zijn een zeer heterogene groep cellen die interageren met kankercellen en cellen van het immuunsysteem door de afscheiding van groeifactoren, cytokines en chemokines; de extracellulaire matrix opbouwen en hermodelleren; en metastasevorming8,9,10, 11,12mogelijk maken. Afhankelijk van het tumortype vertonen CAFs pro-tumorigene functies, terwijl andere subtypen van CAFs tumoronderdrukkende functies lijken te hebben13,14. Om deze tweedeling beter te verduidelijken, is een grondige karakterisering van CAFs van primaire en gemetastaseerde tumoren belangrijk.
In deze context heeft een opkomend onderzoeksgebied zich gericht op de ontwikkeling van nanosized agentia die zijn ontworpen om CAFs aan te vallen en / of te vernietigen door actieve moleculen en geneesmiddelen te leveren die in staat zijn om de tumormicro-omgeving te hermodelleren15,16,17,18. Verschillende soorten nanodeeltjes zijn ontworpen om CAF-ablatie te bereiken door cytotoxische geneesmiddelen, om CAF-gerichte fotodynamische therapie te induceren, of om CAFs te herprogrammeren door ze terug te brengen naar een rustige toestand of TNF-gerelateerde apoptose geïnduceerde ligandexpressie te induceren, die apoptose van naburige kankercellen induceert16,19. Bovendien geeft het potentieel van veel nanodeeltjes om zich actief te richten op specifieke biologische markers aanleiding tot de hoop om CAF-subsets te selecteren om te targeten. Hoewel de absolute specificiteit voor CAF nog steeds in twijfel wordt getrokken, is fibroblastactivatie-eiwit (FAP) een van de meest veelbelovende doelwitten van pro-tumorgeen stroma en wordt het gebruikt om de levering van nanodrugs te sturen, waardoor het pad wordt vrijgemaakt voor de ontwikkeling van CAF-gerichte nanotherapeutica20,21,22.
Dit artikel beschrijft de isolatie van primaire CAFs van een syngenetisch model van murine borstkanker en rapporteert hun gebruik in de studie van het targetingvermogen van nanodeeltjes die zijn ontworpen om de CAF-marker, FAP, te herkennen. Ferritine nanocages worden gebruikt als kandidaat nanosystemen om de methode op te zetten, omdat hun specificiteit van afgifte kan worden gevormd door de oppervlakteblootstelling van richtmoieties23,24. Bovendien is met succes bewezen dat ferritines uitstekende biocompatibele shuttles zijn voor antitumortoepassingen, waardoor een snelle accumulatie van de lading in de tumormassa25,26,27wordt veroorzaakt. Tot op heden hebben preklinische studies van CAF-gerichte nanosystemen in vitro testen op fibroblastcellijnen gestimuleerd in cultuur met transformerende groeifactor-bèta om celactivatie en de expressie van sommige immunofenotypische kenmerken van CAFs28,29te induceren. Deze methode wordt meestal toegepast op onsterfelijke cellijnen (zoals NIH3T3, LX-2) en is vrij snel en eenvoudig, waardoor geactiveerde cellen binnen een paar uur of dagen worden opgeleverd. Een beperking is dat hoewel in vitro stimulatie de expressie induceert van sommige genen die worden toegeschreven aan geactiveerde myofibroblasten, het niet volledig alle biologische kenmerken van echte CAFs kan samenvatten, vooral hun heterogeniteit in vivo.
Een andere strategie omvat de extractie van primaire CAFs uit menselijke of muistumormonsters30,31. Dit zorgt ervoor dat CAF-activering plaatsvindt in een fysiologische context en dat de heterogeniteit van CAF-subpopulaties behouden blijft. Volgens de onderzoeksdoelstelling kunnen CAFs uit verschillende bronnen worden afgeleid, waardoor de mogelijkheid wordt aangeboden om de meest betrouwbare toestand te bestuderen. Het protocol dat hier wordt gerapporteerd, zou waardevol zijn voor wetenschappers die een voorlopige evaluatie willen uitvoeren van de functionaliteit van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om CAFs van een muizen borstkankermodel te targeten. Geïsoleerde CAFs zouden nuttig zijn voor het screenen van die nanodeeltjes die veelbelovend genoeg zijn om door te gaan voor in vivo evaluatie in diermodellen van kanker. Dit zal relevant zijn tijdens de eerste stappen van de productie van nanodeeltjes, waardoor nanotechnologen worden aangetrokken tot de verfijning van het ontwerp van nanodeeltjes door voornamelijk de strategie van ligandimmobilisatie te overwegen om optimale targetingeigenschappen te bereiken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) zijn belangrijke actoren in de context van de tumor micro-omgeving. Ondanks dat ze in aantal zijn verminderd in vergelijking met tumorcellen, reguleren CAFs de tumorprogressie en bieden ze bescherming tegen antitumorimmuniteit. Opkomende antikankerstrategieën zijn gericht op het hermodelleren van de tumormicro-omgeving door de ablatie van pro-tumorigene CAFs of herprogrammering van CAFs-functies en hun activeringsstatus. Een veelbelovende aanpak is de ontwikkeling van nanosized delivery agents die zich kunnen richten op CAFs, waardoor de specifieke afgifte van geneesmiddelen en actieve moleculen mogelijk wordt. In deze context kan een cellulair model van CAFs een nuttig hulpmiddel zijn voor in vitro screening en vooronderzoek van dergelijke nanoformulaties.
Deze studie beschrijft de isolatie en cultuur van primaire CAFs van het syngeneïsche 4T1 murinemodel van triple-negatieve borstkanker. Magnetische kralen werden gebruikt in een 2-staps scheidingsproces om CAFs uit gedissocieerde tumoren te extraheren. Immunofenotyperingscontrole werd uitgevoerd met behulp van flowcytometrie na elke passage om de procesopbrengst te verifiëren. Geïsoleerde CAFs kunnen worden gebruikt om het targetingvermogen van verschillende nanoformulaties te bestuderen die zijn ontworpen om de micro-omgeving van de tumor aan te pakken. Fluorescerend gelabelde H-ferritine nanocages werden gebruikt als kandidaat-nanodeeltjes om de methode op te zetten. Nanodeeltjes, kaal of geconjugeerd met een gericht ligand, werden geanalyseerd op hun binding aan CAFs. De resultaten suggereren dat ex vivo extractie van borst-CAFs een nuttig systeem kan zijn om nanodeeltjes te testen en te valideren voor de specifieke targeting van tumorigene CAFs.

In vivo modelopstelling voor optimale CAFs-isolatie De injectie van 105 4T1-luc cellen in het borstvetkussen van vrouwelijke BALB /c-muizen leidt tot de groei van een detecteerbare tumormassa 5 dagen na implantatie. Door het tumorvolume te meten met remklauwen en de levensvatbaarheid van de tumorcel door BLI, werd de tumorgroei gedurende één maand na implantatie gevolgd. Om een offervenster te vinden dat geschikt is voor CAFs-isolatie, werd een optimaal compromis gezocht tussen een hogere tumorgrootte en BLI aan de ene kant en een opkomende tumor ulceratie en necrose aan de andere kant (figuur 1). Aangezien een necrotische kern 20 dagen na implantatie verschijnt en deze na 25 en 30 dagen toetreedt (zoals gedocumenteerd door BLI-afbeeldingen in figuur 1C),werd dag 20 ingesteld als het tijdstip om het celherstel na het isolatieproces te optimaliseren. Zelfs na het zorgvuldig verwijderen van alle zichtbare necrotische gebieden tijdens de eerste stappen van tumorbehandeling ex vivo,werd een hoog percentage dode cellen gevonden aan het einde van de dissociatie in afzonderlijke cellen(tabel 1). Omdat dit percentage relevant kan zijn, vooral met de toename van de tumorgrootte, is verwijdering van dode cellen altijd noodzakelijk bij het werken met het 4T1-model.
Optimalisatie van de isolatieprocedure, cultuur en karakterisering van CAFs Er zijn nog twee passages nodig om de populatie van CAFs (CD90.2+ CD45-) te isoleren uit het panel van verzamelde levensvatbare cellen: de uitputting van niet-tumor-geassocieerde fibroblasten en de verrijking van tumor-geassocieerde fibroblasten (Figuur 2). De depletiekraalcocktail verwijdert efficiënt CD45+ -cellen (goed voor respectievelijk 67,35% en 0,69% van de totale cellen vóór en na depletie, tabel 2), en werd altijd gebruikt om één enkele tumor in elke kolom te verwerken. Zoals weergegeven in tabel 1daalde het aantal eluted cellen van gemiddeld 3 × 10 6 naar1 × 105 na de depletiestap. Vanwege deze enorme afname van het totale celaantal, is het handig om de verzamelde cellen van ten minste 2 tot maximaal 4 tumoren in een enkele buis te bundelen voordat u doorgaat met de verrijkingsstap. Door dit te doen, werd een voldoende aantal cellen verkregen voor incubatie met tumor-geassocieerde fibroblastparels en passeerde een enkele scheidingskolom om een eindgemiddelde van 93% van de CD90.2+ CD45- cellen te verkrijgen (tabel 2).
Eenmaal gezaaid op weefselkweekplaten, herstelden deze cellen zich aan het plastic en onthulden een grote spilvormige morfologie die typerend is voor fibroblasten (figuur 3A,B) en verschilt van 4T1-tumorcellen (figuur 3D). Het niet poolen van tumoren na uitputting zorgt ervoor dat de cellulaire opbrengst met tumor-geassocieerde fibroblast microbeads te laag is om een cultuur vast te stellen. In andere gevallen, wanneer de duur en temperatuur van de incubaties met microbeads niet zorgvuldig worden gehandhaafd, kan er een niet-specifieke binding optreden. In dergelijke gevallen waren de verrijkingsstappen minder efficiënt en werden hogere percentages CD90.2- CD45+ en CD90.2- CD45- cellen teruggevonden samen met de CD90.2+ CAFs (respectievelijk 5,97 ± 1.5 en 16,75 ± 1.1) (figuur 4 en tabel 3). Deze verontreinigingscellen waren waarschijnlijk verantwoordelijk voor de aanwezigheid in cultuur van kleine klonen met een andere morfologie(figuur 4B,zwarte pijlpunten) die sneller groeiden dan CAFs en de overhand hadden op de primaire CAF-cultuur(figuur 4C). Deze suboptimale resultaten bevestigden het belang van het altijd dubbel controleren van zowel CD90.2- als CD45-expressie, evenals celmorfologie aan het einde van het verrijkingsproces en tijdens celgroei in cultuur.
Gebruik van geïsoleerde cellen om CAF-targeting potentieel van gemanipuleerde nanodrugs te evalueren De vers geïsoleerde CAFs kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, variërend van fundamenteel onderzoek tot farmacologische studies. Het doel van deze groep is om HFn-nanocages te ontwikkelen die zich specifiek op CAFs kunnen richten. HFn werd gefunctionaliseerd met een specifiek anti-FAP-antilichaamfragment (HFn-FAP) bij twee verschillende eiwit:antilichaamverhoudingen (een lagere 1:1 en een hogere 1:5), en hun binding met CAFs werd getest. Aangezien FAP werd gebruikt als oppervlaktebiomarker van pro-tumorigene CAFs, was het van fundamenteel belang om FAP-expressie op geïsoleerde CAFs te controleren(Figuur 3C). FAP-expressie werd gevolgd over 5 passages in de cultuur om te bevestigen dat de primaire CAF-cultuur zijn oorspronkelijke kenmerken behield.
FAP-functionalisatie op HFn bleek bij te dragen aan een significante verschuiving naar CAF-targeting in vergelijking met kale HFn, en de lagere hoeveelheid antilichaam (1:1) was voldoende om dit effect waar te nemen(Figuur 5A). Dit werd echter niet waargenomen met de tumor 4T1-cellen die werden gebruikt om het in vivo tumormodel op te zetten, waarbij kale HFn een hogere binding vertoonde dan gefunctionaliseerde HFn (figuur 5B). Dit was hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de afwezigheid van FAP-overexpressie in 4T1-cellen en de preferentiële interactie van HFn met TfR1, die de HFn-opname in cellen reguleert, zoals algemeen gerapporteerd door deze groep27,33. Deze resultaten bevestigen het nut van het gebruik van primaire culturen van borst-CAFs om voorlopig het doelgericht vermogen van nanodeeltjes te screenen die zijn ontworpen om de micro-omgeving van de tumor aan te pakken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Figuur 1: Vaststelling van het 4T1 tumormodel. Cellen (105 cellen/muis) werden geïnjecteerd in het borstvetkussen. Tumorgroei werd gevolgd op dag 5, 10, 15, 20, 25 en 30 na implantatie (A) door het meten van tumorvolume met remklauwen en (B) door bioluminescentie beeldvorming. Tumorvolumes en BLI worden uitgedrukt als respectievelijk mm3 en tellingen. De resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± SEM (n=6). (C)BLI representatieve beelden verkregen 5, 10, 15, 20, 25 en 30 dagen na celimplantatie bevestigen tumorgroei tot dag 25, wanneer het een plateau lijkt te bereiken. Op het laatste analysepunt (30 dagen) neemt de BLI niet toe ten opzichte van dag 25. Vanaf dag 20 beginnen gebieden met necrose en ulceratie zichtbaar te worden in het centrale deel van de tumor. Kleurenschaal: Min = 1.194, Max = 20.462. Afkortingen: BLI = bioluminescentie beeldvorming; SEM = standaardfout van het gemiddelde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Figuur 2: Tumormonstervoorbereiding en flowcytometriekarakterisering van geïsoleerde CAFs. Tumoren werden weggesneden en gereduceerd tot (A) kleine stukjes van ongeveer 1-2 mm met behulp van een scalpel; B)eencellige suspensie na weefselvertering en mechanische dissociatie van een weggesneden tumor; C) celkorrel verkregen na lysis van rode bloedcellen; (D) flowcytometrie analyse van CD45 en CD90.2 expressie in cellen verkregen na verwijdering van rode bloedcellen en dode cellen, (E) na uitputting van niet-kanker-geassocieerde fibroblasten, en (F) na verrijking van kanker-geassocieerde fibroblasten, waarbij de meerderheid van de cellen CD90.2+ CD45- (blauwe rechthoek) zijn. Afkortingen: CAFs = kanker-geassocieerde fibroblasten; CD = cluster van differentiatie; PE-A = oppervlakte van phycoerythrin; FITC-A = gebieden van fluoresceïne-isothiocyanaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Figuur 3: Morfologische analyse van CAF's en FAP-expressie. (A, B) DE MORF-morfologie werd in alle passages van de cultuur gecontroleerd door optische microscopie (verschillende niveaus van samenvloeiing bij passage 2 en passage 5) en vergeleken met (D) 4T1 tumorcellen; schaalstaven = 10 μm. (C) Fibroblastactivatie-eiwit (FAP) expressie werd geëvalueerd door flowcytometrie aan het einde van het isolatieproces op de verzamelde CD90.2+ CD45- cellen om hun moleculaire kenmerken te bevestigen. Een fluorescentiedrempel werd ingesteld op niet-gekleurde controlecellen (rode grafiek) om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en het percentage positieve cellen (FAP+) tussen antilichaam-gekleurde cellen (blauwe grafiek) te kwantificeren. Afkortingen: CAFs = kanker-geassocieerde fibroblasten; FAP = fibroblastactivatie-eiwit; CD = cluster van differentiatie; MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; Ab = antilichaam; FITC-A = oppervlakte fluoresceïne-isothiocyanaat; FAP+ = FAP-positieve cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Figuur 4: Voorbeeld van een suboptimaal CAFs isolatieproces. (A) Flowcytometrie-evaluatie na de laatste isolatiestap onthulde de aanwezigheid van verontreiniging CD90.2- CD45+ en CD90.2- CD45- cellen. (B) Deze cellen kunnen worden gezien als klonen met kleine ronde morfologie bij het zaaien (zwarte pijlpunten en inzet in de linkerbenedenhoek van het paneel) die (C) de overhand hadden op CAFs na de derde passage in de cultuur. Schaalbalken = 10 μm. Afkortingen: CAF = kanker-geassocieerde fibroblast; CD = cluster van differentiatie; PE-A = oppervlakte van phycoerythrin; FITC-A = gebieden van fluoresceïne-isothiocyanaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Figuur 5: Binding van HFn nanocages op CAFs en 4T1. HFn-nanocages werden fluorescerend gelabeld met FITC, gefunctionaliseerd met een anti-FAP-antilichaamfragment (HFn-FAP) bij twee verschillende eiwit-antilichaamverhoudingen (1:1 en 1:5) en geïncubeerd met (A) doel-CAFs en (B) 4T1-cellen bij 4 °C gedurende 2 uur. De binding werd geëvalueerd door middel van flowcytometrie. (A)HFn-FAP-binding met CAFs is significant verhoogd bij beide antilichaamfragmentconcentraties met een drievoudige in vergelijking met kale HFn. (B) daarentegen werd een significant hogere binding van kale HFn waargenomen in 4T1-cellen, waar de binding niet wordt versterkt door FAP-herkenning. De resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Afkortingen: CAFs = kanker-geassocieerde fibroblasten; FAP = fibroblastactivatie-eiwit; HFn = recombinante variant van menselijke ferritine zware keten gebruikt als kaal nanodeeltje of geconjugeerd; HFN-FAP = HFn nanodeeltjes gefunctionaliseerd met het variabele deel van een anti-FAP antilichaam bereid op twee HFn:Fab@FAP molaire verhoudingen, 1:1 en 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Celnummer (gemiddelde ± SD)</td>
			<td>Extractieopbrengst Totaal (per passage)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weggesneden tumor (Verwijdering van rode bloedcellen)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weggesneden tumor (Verwijdering na verwijdering van dode cellen)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail na uitputting</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Naverrijking</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Totaal celgetal na elke stap van isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Celverdeling (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weggesneden tumor (Verwijdering na verwijdering van dode cellen)</td>
			<td>1,81 ± 0,98</td>
			<td>10,78 ± 4,51</td>
			<td>56,57 ± 14,05</td>
			<td>28,20 ± 17,57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail na uitputting</td>
			<td>69,33 ± 16,75</td>
			<td>0,14 ± 0,13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39,89 ± 30,31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Naverrijking</td>
			<td>93,14 ± 3,3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6,69 ± 3,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Celverdeling volgens expressie van CD90.2 en CD45 na elke passage van isolatie van kankergeactiveerde fibroblasten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Celverdeling (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post Enrichment (geen pooling)</td>
			<td>75,80 ± 2,9</td>
			<td>1,49 ± 0,4</td>
			<td>5,97 ± 1,5</td>
			<td>16,75 ± 1,1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: CD90.2- en CD45-expressie van cellen verzameld na een suboptimaal kankergeactiveerd fibroblastisolatie-experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Dit artikel heeft tot doel een protocol te bieden voor de isolatie en kweek van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van triple-negatieve borstkanker en hun toepassing voor de preklinische studie van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om zich te richten op de tumormicro-omgeving.

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Dit protocol maakt het mogelijk om met succes primaire kanker geassocieerde fibroblasten te isoleren en te cultureren van murine borstkanker, om nieuwe nanodeeltjes te screenen die zijn ontworpen om zich te richten op de tumormicro-omgeving. Primaire CAF vertegenwoordigen het meest betrouwbare en fysiologische model voor in vitro studies van tumor stroma. In dit protocol beschrijven we hoe we een optimale opbrengst kunnen behalen.Bereid om te beginnen een spijsverteringsmix voor tumordissociatie en week de tumorfragmenten van drie tot vijf millimeter in de oplossing na het goed sluiten van de buis. Draai de buis ondersteboven en controleer of alle stukjes tumor zich aan de onderkant van de buis in de richting van de dop bevinden. Bevestig vervolgens de buis aan een mechanische dissociëter in de juiste behuizing en voer een dissociatieprogramma uit dat speciaal is ontworpen voor taaie tumoren.Maak na de run de buis los en plaats deze ondersteboven om het monster gedurende 40 minuten met zacht schudden op 37 graden Celsius te incuberen. Bevestig vervolgens de buis opnieuw aan de dissociater in de juiste behuizing en voer het dissociatieprogramma voor taaie tumoren twee keer uit, zodat er aan het einde van de procedure geen grote weefselstukken overblijven. Filtreer het monster door een celzeef van 40 micron in een buis van 50 milliliter.Was vervolgens het filter met 10 milliliter RPMI 1640 medium en centrifuge. Na centrifugeren, resuspend de pellet in PBE-buffer, samengesteld uit PBS, 0,5% BSA en twee millimolar EDTA, en tel de cellen met Trypan Blue. Herstel de bindingsbuffer voor het verwijderen van dode cellen door de 20X bindende buffervoorraadoplossing te verdunn met steriel dubbel gedestilleerd water.Was de cellen met vijf milliliter 1X bindingsbuffer en centrifuge. Na centrifugeren, resuspend de celkorrel met 0,1 milliliter dode celverwijdering microbeads voor maximaal 10 tot de zevende cellen, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Bereid tijdens de incubatie een magnetische standaard onder de motorkap voor en hang er ferromagnetische scheidingskolommen aan, met de uiteinden naar beneden.Balanceer de kolommen met 0,5 milliliter koude bindingsbuffer en wacht tot de oplossing is doorgestroomd. Voeg na incubatie 400 microliter koude bindingsbuffer toe aan de kraal en celsuspensie. Laad het volledige volume op de kolom en verzamel het effluent in een buis van 15 milliliter.Was de kolom vier keer met 0,5 milliliter koude bindingsbuffer en verzamel het totale effluent in dezelfde buis. Voor de uitputting van niet-kanker geassocieerde fibroblasten, filter de celsuspensie met behulp van een 70 micron celzeef bevochtigd met PBS, en centrifugeer de cellen. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 80 microliter koude PBE-buffer.Voeg 20 microliter niet-tumor-geassocieerde fibroblast depletie cocktail toe. Meng goed en incubeer het monster bij 4 graden Celsius gedurende 15 minuten in het donker. Bereid tijdens de incubatie met kralen ferromagnetische depletiekolommen voor op een magnetische standaard.Balanceer de kolommen met twee milliliter koude PBE-buffer en wacht tot de oplossing is doorgestroomd. Voeg na incubatie 400 microliter buffer toe aan de kraal en celsuspensie. Laad het volledige volume op de kolom en verzamel het effluent in een buis van 15 milliliter.Was de kolom tweemaal met twee milliliter PBE. Verzamel het totale effluent in dezelfde buis en centrifueer het effluent. Voor de positieve selectie van kanker-geassocieerde fibroblasten, resuspend de pellet in 80 microliter koude PBE-buffer.Vervolgens op 20 microliter tumor-geassocieerde fibroblasten microbeads, en incubateer de monsters bij 4 graden Celsius gedurende 15 minuten in het donker. Bereid tijdens de incubatie ferromagnetische scheidingskolommen voor op een magnetische standaard en balanceer ze met 0,5 milliliter koude PBE-buffer. Voeg na incubatie 400 microliter PBE toe aan de kraal en celsuspensie.Laad het volledige volume op de kolom en laat de ongelabelde cellen doorstromen in een buis van 15 milliliter. Was de kolom driemaal met 0,5 milliliter PBE-buffer en verzamel het totale effluent in dezelfde buis. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats deze in een buis van 1,5 milliliter.Voeg een milliliter PBE toe aan de kolom en duw de zuiger onmiddellijk in de kolom om de cellen eruit te spoelen. Na centrifugeren, resuspend de celkorrel in een geschikt volume DMEM en zaai de cellen in een weefselkweekplaat. Controleer de celdichtheid onder een microscoop en plaats de plaat op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de cellen te laten hechten en groeien.De injectie van 4T1 luciferasecellen in het borstvetkussen van vrouwelijke muizen leidde tot de groei van een detecteerbare tumormassa vijf dagen na implantatie. Om een offervenster te vinden dat geschikt is voor CAF-isolatie, werd een optimaal compromis gezocht tussen hogere tumorgrootte en bioluminescentiebeeldvorming aan de ene kant en een opkomende tumor ulceratie en necrose aan de andere kant. Dag 20 werd ingesteld als het tijdstip om het celherstel te optimaliseren, na het isolatieproces.Er waren nog twee passages nodig om de populatie van CAFs te isoleren, uit het panel van verzamelde levensvatbare cellen, de uitputting van niet-tumor geassocieerde fibroblasten en de verrijking van tumor geassocieerde fibroblasten. CAF-cellen onthulden een grote spindelvormige morfologie, typisch voor fibroblasten, en verschilden van 4T1-tumorcellen. FAP-expressie gevolgd door vijf passages bevestigen dat de primaire CAF-cultuur zijn oorspronkelijke kenmerken heeft behouden.Wanneer de duur en temperatuur van de incubaties met microbeads niet werden gehandhaafd, werden klonen met verschillende morfologie gevonden onder de geïsoleerde cultuur. Deze verontreinigingscellen groeiden sneller en hadden de overhand op de primaire CAF-cultuur. CAFs binding met Human Ferritin Hfn-FAP gefunctionaliseerd nanogeneesmiddel verhoogden bij één-op-één, en één-tot-vijf antilichaam fragmentconcentraties door drievoudig, vergeleken met kale HFN.Integendeel, voor tumor 4T1-cellen vertoonde kale HFN een hogere binding dan gefunctionaliseerd HFN. Om de opbrengstonzuiverheid van geïsoleerde CAF te verhogen, houdt u buffers koud, respecteert u de incubatietijd met kralen en trekt u maximaal vier tumoren per kolom voor de laatste verrijkingsstap. De geïsoleerde CAFs kunnen worden gebruikt om verschillende kandidaat-nanogeneesmiddelen te screenen op het gebied van binding, opname en farmacologische werkzaamheid voordat wordt overgegaan tot preklinische in vivo experimenten.CAF-isolatie stelde ons in staat om te testen of nanodeeltjes kunnen worden gebruikt om de micro-omgeving van de tumor aan te vallen. Zo wordt de weg vrijgemaakt voor nieuwe gerichte therapieën die in synergie werken met chemotherapie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Antikanker werkzaamheid van Photo Dynamische Therapie met longkanker-Gerichte Nanodeeltjes

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Een muismodel van Syngeneic Pancreatic kanker te bestuderen van de gevolgen van onomkeerbaar Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Een bioluminescente en fluorescerende Orthotopic Syngeneic lymfkliertest Model van androgeen-afhankelijke en castratie-resistente prostaatkanker

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping van Orthotopic Homograft (Syngeneic) van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom lymfkliertest primaire KPC door Stroom Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...