Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par l’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) dans le cadre du projet IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio. SM reconnaît le centre de recherche clinique pédiatrique « Romeo and Enrica Invernizzi » qui soutient sa position. AB remercie l’AIRC (projet ID. 20172) et l’Université de Milan pour leur bourse de recherche. Les bourses postdoctorales et doctorales LS et MS sont soutenues par l’Université de Milan.

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	<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer.">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li><li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+and+their+microenvironments:+tilling+the+soil.+Commentary+re:+A.+M.+Scott+et+al.,+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer.">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li><li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+Sanctuary+of+the+devil.">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li><li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+foes+to+friends:+targeting+cancer-associated+fibroblasts.">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li><li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts:+origins,+functions+and+translational+impact.">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Li, X. -. Y., Hu, S. -. Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance.">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li><li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression.">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li><li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer.">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li><li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment.">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, 186-196 (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics.">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts:+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy.">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).</li><li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment.">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li><li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers.">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027 (2020).</li><li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors.">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li><li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;:+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies.">Fibroblast activation protein-&#945;: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;+in+fibrogenic+disorders+and+cancer:+more+than+a+prolyl-specific+peptidase.">Fibroblast activation protein-&#945; in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li><li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin.">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+nanocages:+A+biological+platform+for+drug+delivery,+imaging+and+theranostics+in+cancer.">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size.">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li><li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoferritin+applications+in+nanomedicine.">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li><li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity.">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy.">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li><li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma.">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li><li>Kov&#225;cs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts.">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).</li><li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax.">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328 (2021).</li><li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells.">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li><li>Dvo&#345;&#225;nkov&#225;, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+(CAFs)+for+biomedical+research.">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li><li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages.">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).</li><li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma.">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li><li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression.">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li><li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control.">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li><li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery.">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les CAF apparaissent comme des acteurs clés dans le remodelage de la matrice extracellulaire, la promotion de la progression des métastases et la limitation de l’accès aux médicaments au site tumoral34. Cependant, en raison de leur hétérogénéité, leurs rôles sont encore controversés – certains CAF sont tumorigènes, tandis que d’autres sous-types semblent avoir un rôle suppresseur de tumeurs. Dans ce contexte, leur isolement peut être d’un intérêt extrême pour faire la lumière sur leur rôle très débattu dans la progression du cancer, qui aura d’importantes implications cliniques12,31. De plus, l’extraction réussie de CAF à partir de modèles tumoraux humains et précliniques de souris faciliterait également le développement de nouveaux médicaments ciblant les CAF. Cet article présente une méthode permettant d’isoler et de mettre en culture efficacement les CAF primaires à partir d’un modèle préclinique syngénique du cancer du sein. Sur la base de l’expérience, trois étapes expérimentales influencent principalement le succès du protocole.
La première consiste à travailler rapidement pour éviter l’agrégation des suspensions cellulaires associées au risque de coagulation dans la colonne et de ralentissement de l’efflux cellulaire: en fait, lorsque les cellules qui ont traversé la colonne ont été regroupées, la probabilité d’un processus d’isolement sous-optimal a augmenté et les cultures finales contenaient des clones de cellules « contaminantes ». La seconde consiste à mettre en commun les cellules de différentes tumeurs après le passage de l’épuisement pour garantir suffisamment de cellules à traverser dans l’étape finale d’enrichissement. Le dernier problème critique est le placage des cellules extraites à des densités cellulaires élevées, probablement à partir d’un seul puits de la plaque de 24 puits pour stimuler la croissance cellulaire et l’expansion des colonies jusqu’à 4 à 5 passages. Si les cellules étaient ensemencées à de faibles densités, elles se dilataient sur la surface libre et cessaient rapidement de se répliquer.
Plusieurs études ont déjà décrit les méthodes d’extraction des FAC d’origine humaine et souris, afin d’étudier leur rôle dans la promotion du développement du cancer et de l’invasivité. Cela a été fait dans de nombreux types de tumeurs, y compris le cancer du sein, le mélanome, le cholangiocarcinome et l’adénocarcinome pancréatique35,36,37,38. Cependant, en raison de l’absence de marqueurs CAF spécifiques et de leur hétérogénéité, les résultats de ces processus sont encore sous-optimaux.
Ici, les cellules isolées ont été utilisées pour valider la capacité de ciblage CAF des nanocages HFn fonctionnalisés avec des fractions de ciblage anti-FAP. L’utilisation de cultures primaires de CAF a été un avantage significatif, permettant la validation de la nanostratégie ex vivo avec une expérience de liaison beaucoup plus simple et rentable que de le faire directement in vivo à cette phase préliminaire de l’optimisation des nanomédicaments.
En ce sens, les essais ex vivo sur les CAF peuvent précéder les expérimentations animales in vivo en permettant le criblage et la sélection des nanoparticules les plus prometteuses pour le ciblage optimal des FAC. Le modèle CAF présenté ici peut également être utilisé pour des études préliminaires d’efficacité, lors du chargement de nanoparticules avec des médicaments actifs. Les animaux ne seront utilisés que plus tard pour évaluer la biodistribution, la pharmacocinétique et les études d’efficacité.
Plusieurs nanomédicaments ciblant les FAC sont en cours de développement, tels que des nanocages de ferritine pour la thérapie photodynamique dans le cancer du sein et des particules à base de peptides pour délivrer de la doxorubicine dans les modèles de cancer de la prostate39,40. Cependant, peu d’études se sont concentrées sur l’isolement des CAF en tant que plates-formes cellulaires pour l’optimisation des nanomédicaments.
Ce protocole présente certaines limites. Tout d’abord, il s’agit d’un protocole qui prend beaucoup de temps, nécessitant la préparation et l’achat de plusieurs réactifs et matériaux. Deuxièmement, en raison de la rareté des CAF dans la tumeur mammaire 4T1, leur rendement est faible. Les expériences sur les nanoparticules doivent être planifiées et réalisées dès que le nombre de cellules requis est atteint, car les CAF primaires subissent une sénescence et ne peuvent pas être maintenues en culture pendant une longue période. En conclusion, cette méthode d’isolement, de culture et de caractérisation des CAF peut être un outil puissant pour accélérer le développement de nouveaux nanomédicaments ciblés dans la lutte contre le cancer.

Au cours des dernières décennies, il est devenu clair que tuer les cellules tumorales n’est généralement pas suffisant pour éradiquer la malignité, car le microenvironnement tumoral peut provoquer une rechute tumorale et induire une résistance thérapeutique1,2. Un nouveau paradigme a alors émergé : cibler le stroma tumoral pour priver la tumeur de facteurs de soutien et ainsi, augmenter l’efficacité des agents chimiothérapeutiques3,4,5. En particulier, les fibroblastes associés au cancer (CAF) sont une cible stromale intéressante dans de nombreuses tumeurs solides6,7. Les CAF sont un groupe très hétérogène de cellules qui interagissent avec les cellules cancéreuses et les cellules du système immunitaire par la sécrétion de facteurs de croissance, de cytokines et de chimiokines; construire et remodeler la matrice extracellulaire; et permettre la formation de métastases8,9,10,11,12. Selon le type de tumeur, les CAF montrent des fonctions pro-tumorigènes, tandis que d’autres sous-types de CAF semblent avoir des fonctions suppressives de tumeur13,14. Pour mieux clarifier cette dichotomie, une caractérisation approfondie des CAF des tumeurs primaires et métastatiques est importante.
Dans ce contexte, un domaine de recherche émergent s’est concentré sur le développement d’agents nanométriques conçus pour cibler et/ou détruire les CAF en délivrant des molécules actives et des médicaments capables de remodeler le microenvironnement tumoral15,16,17,18. Plusieurs types de nanoparticules ont été conçus pour réaliser l’ablation CAF par des médicaments cytotoxiques, pour induire une thérapie photodynamique ciblée par CAF, ou pour reprogrammer les CAF en les ramenant à un état de repos ou en induisant l’expression de ligand induite par l’apoptose liée au TNF, qui induit l’apoptose des cellules cancéreuses voisines16,19. De plus, le potentiel de nombreuses nanoparticules à cibler activement des marqueurs biologiques spécifiques donne lieu à l’espoir de sélectionner des sous-ensembles CAF à cibler. Bien que sa spécificité absolue pour le CAF soit encore remise en question, la protéine d’activation des fibroblastes (FAP) est l’une des cibles les plus prometteuses du stroma pro-tumorigène et est exploitée pour orienter l’administration de nanomédicaments, ouvrant ainsi la voie au développement de nanothérapies ciblant les CAF20,21,22.
Cet article décrit l’isolement des CAF primaires à partir d’un modèle syngénique du cancer du sein murin et rapporte leur utilisation dans l’étude de la capacité de ciblage des nanoparticules conçues pour reconnaître le marqueur CAF, FAP. Les nanocages de ferritine sont utilisés comme nanosystèmes candidats pour mettre en place la méthode, car leur spécificité d’administration peut être façonnée par l’exposition de surface des fractions de ciblage23,24. De plus, les ferritines se sont avérées être d’excellentes navettes biocompatibles pour les applications antitumorales, déclenchant une accumulation rapide de la charge utile dans la masse tumorale25,26,27. À ce jour, des études précliniques de nanosystèmes ciblant les FAC ont impliqué des tests in vitro sur des lignées cellulaires de fibroblastes stimulées en culture avec un facteur de croissance transformant bêta pour induire l’activation cellulaire et l’expression de certaines caractéristiques immunophénotypes des CAF28,29. Cette méthode est généralement appliquée aux lignées cellulaires immortalisées (telles que NIH3T3, LX-2) et est assez rapide et simple, produisant des cellules activées en quelques heures ou quelques jours. Une limitation est que bien que la stimulation in vitro induise l’expression de certains gènes attribués aux myofibroblastes activés, elle ne peut pas récapituler entièrement toutes les caractéristiques biologiques des CAF réels, en particulier leur hétérogénéité in vivo.
Une autre stratégie consiste à extraire des CAF primaires à partir d’échantillons de tumeurs humaines ou de souris30,31. Cela garantit que l’activation des FAC se produit dans un contexte physiologique et que l’hétérogénéité des sous-populations des FAC est maintenue. Selon l’objectif de recherche, les CAF peuvent provenir de différentes sources, offrant ainsi la possibilité d’étudier la condition la plus fiable. Le protocole présenté ici serait précieux pour les scientifiques qui cherchent à effectuer une évaluation préliminaire de la fonctionnalité de nouvelles nanoparticules conçues pour cibler les CAF à partir d’un modèle murin de cancer du sein. Les CAF isolés seraient utiles pour le dépistage des nanoparticules suffisamment prometteuses pour procéder à une évaluation in vivo dans des modèles animaux de cancer. Cela sera pertinent lors des premières étapes de la production de nanoparticules, conduisant les nanotechnologues vers le raffinement de la conception des nanoparticules en considérant principalement la stratégie d’immobilisation des ligands pour atteindre des propriétés de ciblage optimales.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Les fibroblastes associés au cancer (CAF) sont des acteurs clés dans le contexte du microenvironnement tumoral. Bien qu’ils soient réduits en nombre par rapport aux cellules tumorales, les CAF régulent la progression tumorale et offrent une protection contre l’immunité antitumorale. Les stratégies anticancéreux émergentes visent à remodeler le microenvironnement tumoral par l’ablation des CAF pro-tumorigènes ou la reprogrammation des fonctions des CAF et de leur statut d’activation. Une approche prometteuse est le développement d’agents d’administration nanométriques capables de cibler les CAF, permettant ainsi l’administration spécifique de médicaments et de molécules actives. Dans ce contexte, un modèle cellulaire de CAF peut fournir un outil utile pour le dépistage in vitro et l’étude préliminaire de ces nanoformulations.
Cette étude décrit l’isolement et la culture des CAF primaires à partir du modèle murin syngénique 4T1 du cancer du sein triple négatif. Les billes magnétiques ont été utilisées dans un processus de séparation en 2 étapes pour extraire les CAF des tumeurs dissociées. Le contrôle de l’immunophénotypage a été effectué à l’aide de la cytométrie en flux après chaque passage pour vérifier le rendement du processus. Des CAF isolés peuvent être utilisés pour étudier la capacité de ciblage de différentes nanoformulations conçues pour s’attaquer au microenvironnement tumoral. Des nanocages de H-ferritine marqués par fluorescence ont été utilisés comme nanoparticules candidates pour mettre en place la méthode. Les nanoparticules, nues ou conjuguées avec un ligand de ciblage, ont été analysées pour leur liaison aux CAF. Les résultats suggèrent que l’extraction ex vivo des CAF du sein peut être un système utile pour tester et valider les nanoparticules pour le ciblage spécifique des CAF tumorigènes.

Configuration de modèles in vivo pour une isolation optimale des CAF L’injection de 105 cellules 4T1-luc dans le coussinet adipeux mammaire de souris FEMELLEs BALB/c conduit à la croissance d’une masse tumorale détectable 5 jours après l’implantation. En mesurant le volume tumoral par étriers et la viabilité des cellules tumorales par BLI, la croissance tumorale a été surveillée pendant un mois après l’implantation. Pour trouver une fenêtre de sacrifice adéquate pour l’isolement des CAF, un compromis optimal a été recherché entre une taille tumorale plus élevée et une BLI d’une part et une ulcération tumorale émergente et une nécrose d’autre part (Figure 1). Comme un noyau nécrotique apparaît 20 jours après l’implantation et qu’il s’agrandit à 25 et 30 jours (comme le documentent les images BLI de la figure 1C),le jour 20 a été défini comme point temporel pour optimiser la récupération cellulaire après le processus d’isolement. Même après avoir soigneusement enlevé toutes les zones nécrotiques visibles au cours des premières étapes de la manipulation de la tumeur ex vivo,un pourcentage élevé de cellules mortes a été trouvé à la fin de la dissociation en cellules uniques (Tableau 1). Comme ce pourcentage peut être pertinent, en particulier avec l’augmentation de la taille de la tumeur, l’élimination des cellules mortes est toujours nécessaire lorsque vous travaillez avec le modèle 4T1.
Optimisation de la procédure d’isolement, de la culture et de la caractérisation des CAF Deux autres passages sont nécessaires pour isoler la population de CAF (CD90.2+ CD45-) du panel de cellules viables collectées: l’épuisement des fibroblastes non associés à la tumeur et l’enrichissement des fibroblastes associés à la tumeur (Figure 2). Le cocktail de billes d’épuisement élimine efficacement les cellules CD45+ (représentant respectivement 67,35% et 0,69% du total des cellules avant et après l’épuisement, respectivement, tableau 2),et a toujours été utilisé pour traiter une seule tumeur dans chaque colonne. Comme le montre le tableau 1,le nombre de cellules éluées est passé d’une moyenne de 3 × 106 à 1 × 105 après l’étape d’épuisement. En raison de cette diminution massive du nombre total de cellules, il est pratique de regrouper les cellules collectées d’au moins 2 à un maximum de 4 tumeurs dans un seul tube avant de procéder à l’étape d’enrichissement. Ce faisant, un nombre adéquat de cellules a été obtenu pour l’incubation avec des billes de fibroblastes associées à la tumeur et passé à travers une seule colonne de séparation pour obtenir une moyenne finale de 93% de cellules CD90.2+ CD45( Tableau 2).
Une fois ensemencées sur des plaques de culture tissulaire, ces cellules récupérées attachées au plastique et ont révélé une grande morphologie en forme de fuseau typique des fibroblastes(Figure 3A,B)et différente des cellules tumorales 4T1(Figure 3D). Ne pas mettre en commun les tumeurs après l’épuisement entraîne un rendement cellulaire avec des microbilles de fibroblastes associées à la tumeur trop faible pour établir une culture. Dans d’autres cas, lorsque la durée et la température des incubations avec des microbilles ne sont pas soigneusement maintenues, une certaine liaison non spécifique peut se produire. Dans de tels cas, les étapes d’enrichissement étaient moins efficaces et des pourcentages plus élevés de cellules CD90,2- CD45+ et CD90,2- CD45 - ont été récupérés avec les CELLULES CD90,2+ CAF (5,97 ± 1,5 et 16,75 ± 1,1, respectivement)(figure 4 et tableau 3). Ces cellules contaminantes étaient susceptibles d’être responsables de la présence en culture de petits clones de morphologie différente(Figure 4B,pointes de flèches noires) qui ont grandi plus vite que les CAF et ont prévalu sur la culture primaire de CAF (Figure 4C). Ces résultats sous-optimaux ont confirmé l’importance de toujours revérifier l’expression de CD90.2 et de CD45, ainsi que la morphologie cellulaire à la fin du processus d’enrichissement et pendant la croissance cellulaire en culture.
Utilisation de cellules isolées pour évaluer le potentiel de ciblage CAF des nanomédicaments modifiés Les CAF fraîchement isolés peuvent être utilisés pour plusieurs applications allant de la recherche fondamentale aux études pharmacologiques. L’objectif de ce groupe est de développer des nanocages HFn capables de cibler spécifiquement les CAF. HFn a été fonctionnalisé avec un fragment d’anticorps anti-FAP spécifique (HFn-FAP) à deux rapports protéines/anticorps différents (un 1:1 inférieur et un 1:5 supérieur), et leur liaison avec les CAF a été testée. Comme le FAP était utilisé comme biomarqueur de surface des CAF pro-tumorigènes, il était d’une importance fondamentale de vérifier l’expression du FAP sur des CAF isolés (Figure 3C). L’expression du FAP a été suivie sur 5 passages dans la culture pour confirmer que la culture primaire des FAC a conservé ses caractéristiques d’origine.
La fonctionnalisation de la PAF sur HFn s’est avérée contribuer à un changement significatif vers le ciblage CAF par rapport au HFn nu, et la quantité plus faible d’anticorps (1:1) était suffisante pour observer cet effet(Figure 5A). Cependant, cela n’a pas été observé avec les cellules tumorales 4T1 utilisées pour mettre en place le modèle tumoral in vivo, dans lequel HFn nu a montré une liaison plus élevée que HFn fonctionnalisé (Figure 5B). Cela était probablement dû à l’absence de surexpression de FAP dans les cellules 4T1 et à l’interaction préférentielle de HFn avec TfR1, qui régule l’absorption de HFn dans les cellules, comme largement rapporté par ce groupe27,33. Ces résultats confirment l’utilité d’utiliser des cultures primaires de CAF du sein pour dépister de manière préliminaire la capacité de ciblage des nanoparticules conçues pour s’attaquer au microenvironnement tumoral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Figure 1: Mise en place du modèle tumoral 4T1. Des cellules (10à 5 cellules/souris) ont été injectées dans le coussinet adipeux mammaire. La croissance tumorale a été suivie aux jours 5, 10, 15, 20, 25 et 30 après l’implantation (A) en mesurant le volume tumoral avec des étriers et (B) par imagerie par bioluminescence. Les volumes tumoraux et les BLI sont exprimés en mm3 et en nombre, respectivement. Les résultats sont présentés comme moyens ± SEM (n = 6). (C) Les images représentatives de BLI obtenues 5, 10, 15, 20, 25 et 30 jours après l’implantation cellulaire confirment la croissance tumorale jusqu’au jour 25, quand elle semble atteindre un plateau. Au dernier point d’analyse (30 jours), le BLI n’augmente pas par rapport au jour 25. À partir du jour 20, les zones de nécrose et d’ulcération commencent à devenir visibles dans la partie centrale de la tumeur. Échelle de couleur: Min = 1 194, Max = 20 462. Abréviations : BLI = imagerie par bioluminescence; SEM = erreur-type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Figure 2: Préparation d’échantillons tumoraux et caractérisation par cytométrie en flux de CAF isolés. Les tumeurs ont été excisées et réduites en(A)petits morceaux d’environ 1–2 mm à l’aide d’un scalpel; (B) suspension unicellulaire après digestion tissulaire et dissociation mécanique d’une tumeur excisée; C)pastille de cellules obtenue après lyse des globules rouges; (D) analyse par cytométrie en flux de l’expression de CD45 et CD90.2 dans les cellules obtenues après élimination des globules rouges et des cellules mortes, (E) après épuisement des fibroblastes non associés au cancer, et (F) après enrichissement des fibroblastes associés au cancer, où la majorité des cellules sont CD90.2+ CD45- (rectangle bleu). Abréviations : CAF= fibroblastes associés au cancer; CD = groupe de différenciation; PE-A = aire de phycoérythrine; FITC-A = zones d’isothiocyanate de fluorescéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Figure 3: Analyse morphologique de l’expression des FACS et des FAP. (A, B) La morphologie des CAF a été vérifiée dans tous les passages de culture par microscopie optique (différents niveaux de confluence au passage 2 et au passage 5) et comparée à(D)les cellules tumorales 4T1; barres d’échelle = 10 μm. (C) L’expression de la protéine d’activation des fibroblastes (FAP) a été évaluée par cytométrie en flux à la fin du processus d’isolement sur les cellules CD90.2+ CD45collectées pour confirmer leurs caractéristiques moléculaires. Un seuil de fluorescence a été fixé sur les cellules témoins non colorées (graphique rouge) pour quantifier l’intensité moyenne de fluorescence et le pourcentage de cellules positives (FAP+)parmi les cellules colorées par anticorps (graphique bleu). Abréviations : CAF= fibroblastes associés au cancer; FAP = protéine d’activation des fibroblastes; CD = groupe de différenciation; IFD = intensité moyenne de fluorescence; Ab = anticorps; FITC-A = aire d’isothiocyanate de fluorescéine; FAP+ = cellules FAP positives. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Figure 4: Exemple d’un procédé d’isolement sous-optimal des CAF. (A) L’évaluation de la cytométrie en flux après l’étape finale d’isolement a révélé la présence de cellules CD90.2- CD45+ et CD90.2- CD45. (B) Ces cellules peuvent être vues comme des clones avec une petite morphologie ronde lors de l’ensemencement (pointes de flèches noires et encart dans le coin inférieur gauche du panneau) qui (C) ont prévalu sur les CAF après le troisième passage en culture. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : CAF = fibroblaste associé au cancer; CD = groupe de différenciation; PE-A = aire de phycoérythrine; FITC-A = zones d’isothiocyanate de fluorescéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Figure 5: Liaison des nanocages HFn sur les CAF et 4T1. Les nanocages HFn ont été marqués par fluorescence avec fitC, fonctionnalisés avec un fragment d’anticorps anti-FAP (HFn-FAP) à deux rapports protéine-anticorps différents (1:1 et 1:5), et incubés avec des CAF cibles(A)et(B)des cellules 4T1 à 4 °C pendant 2 h. La liaison a été évaluée par cytométrie en flux. (A) La liaison HFn-FAP avec les CAF est significativement augmentée à la concentration des deux fragments d’anticorps par trois fois par rapport au HFn nu. (B) en revanche, une liaison significativement plus élevée de HFn nu a été observée dans les cellules 4T1, où la liaison n’est pas améliorée par la reconnaissance FAP. Les résultats sont présentés comme moyens ±'écart-type de trois expériences indépendantes. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Abréviations : CAF= fibroblastes associés au cancer; FAP = protéine d’activation des fibroblastes; HFn = variante recombinante de la chaîne lourde de ferritine humaine utilisée comme nanoparticule nue ou conjuguée; HFN-FAP = nanoparticules HFn fonctionnalisées avec la portion variable d’un anticorps anti-FAP préparé à deux rapports molaires HFn:Fab@FAP, 1:1 et 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Numéro de cellule (moyenne ± SD)</td>
			<td>Rendement d’extraction total (par passage)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumeur excisée (post-élimination des globules rouges)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumeur excisée (post-élimination des cellules mortes)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail post-épuisement</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-enrichissement</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Nombre total de cellules après chaque étape d’isolement des fibroblastes associés au cancer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Distribution cellulaire (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumeur excisée (post-élimination des cellules mortes)</td>
			<td>1,81 ± 0,98</td>
			<td>10,78 ± 4,51</td>
			<td>56,57 ± 14,05</td>
			<td>28 h 20 ± 17 h 57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail post-épuisement</td>
			<td>69,33 ± 16,75</td>
			<td>0,14 ± 0,13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39,89 ± 30,31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-enrichissement</td>
			<td>93,14 ± 3,3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6,69 ± 3,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Distribution cellulaire selon l’expression de CD90.2 et CD45 après chaque passage d’isolement des fibroblastes associés au cancer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Distribution cellulaire (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-enrichissement (pas de mise en commun)</td>
			<td>75,80 ± 2,9</td>
			<td>1,49 ± 0,4</td>
			<td>5,97 ± 1,5</td>
			<td>16,75 ± 1,1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Expression cd90.2 et CD45 des cellules prélevées après une expérience d’isolement des fibroblastes sous-optimale associée au cancer.

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Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cet article vise à fournir un protocole pour l’isolement et la culture de fibroblastes primaires associés au cancer à partir d’un modèle murin syngénique du cancer du sein triple négatif et leur application pour l’étude préclinique de nouvelles nanoparticules conçues pour cibler le microenvironnement tumoral.

Isolement de fibroblastes primaires associés au cancer à partir d’un modèle murin syngénique du cancer du sein pour l’étude de nanoparticules ciblées

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Ce protocole permet d’isoler et de mettre en culture avec succès des fibroblastes associés au cancer primaire du cancer du sein murin, afin de dépister de nouvelles nanoparticules conçues pour cibler le micro-environnement tumoral. Les FAC primaires représentent le modèle physiologique le plus fiable pour les études in vitro du stroma tumoral. Dans ce protocole, nous décrivons comment obtenir un rendement optimal.Pour commencer, préparez un mélange de digestion pour la dissociation tumorale et faites tremper les fragments de tumeur de trois à cinq millimètres dans la solution après avoir fermé hermétiquement le tube. Tournez le tube à l’envers, en vérifiant que tous les morceaux de tumeur sont au bas du tube vers le capuchon. Ensuite, fixez le tube à un dissociater mécanique dans le boîtier approprié et exécutez un programme de dissociation spécialement conçu pour les tumeurs dures.Après la course, détachez le tube et placez-le à l’envers pour incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes en le secouant doucement. Ensuite, reconnectez le tube au dissociater dans le boîtier approprié et exécutez le programme de dissociation pour les tumeurs dures deux fois, en vous assurant qu’il ne reste pas de gros morceaux de tissu à la fin de la procédure. Filtrer l’échantillon à travers une passoire cellulaire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres.Lavez ensuite le filtre avec 10 millilitres de milieu RPMI 1640 et centrifugeuse. Après centrifugation, ressuspendez la pastille dans un tampon PBE, composé de PBS, de 0,5% de BSA et de deux millimolaires EDTA, et comptez les cellules avec trypan blue. Réparez le tampon de liaison d’élimination des cellules mortes en diluant la solution tampon de liaison 20X avec de l’eau distillée double stérile.Lavez les cellules avec cinq millilitres de tampon de liaison 1X et de centrifugeuse. Après centrifugation, resuspendez la pastille cellulaire avec 0,1 millilitre de microbilles d’élimination des cellules mortes jusqu’à 10 à la septième cellule et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant l’incubation, préparez un support magnétique sous le capot et y accrochez des colonnes de séparation ferromagnétique, les pointes pointant vers le bas.Équilibrez les colonnes avec 0,5 millilitre de tampon de liaison à froid et attendez que la solution ait coulé. Après l’incubation, ajouter 400 microlitres de tampon de liaison à froid à la suspension de la perle et de la cellule. Chargez tout le volume sur la colonne et collectez l’effluent dans un tube de 15 millilitres.Lavez la colonne quatre fois avec 0,5 millilitre de tampon de liaison à froid et collectez l’effluent total dans le même tube. Pour l’épuisement des fibroblastes non associés au cancer, filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de 70 microns humidifiée avec du PBS et centrifugez les cellules. Retirez le surnageant et ressuspendez la pastille dans 80 microlitres de tampon PBE froid.Ajouter 20 microlitres de cocktail d’épuisement des fibroblastes non associés à la tumeur. Bien mélanger et incuber l’échantillon à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’obscurité. Pendant l’incubation avec des perles, préparez des colonnes d’épuisement ferromagnétiques sur un support magnétique.Équilibrez les colonnes avec deux millilitres de tampon PBE froid et attendez que la solution ait coulé. Après l’incubation, ajouter 400 microlitres de tampon à la suspension de la perle et de la cellule. Chargez tout le volume sur la colonne et collectez l’effluent dans un tube de 15 millilitres.Lavez la colonne deux fois avec deux millilitres de PBE. Recueillir l’effluent total dans le même tube et centrifuger l’effluent. Pour la sélection positive des fibroblastes associés au cancer, resuspendez la pastille dans 80 microlitres de tampon PBE froid.Ensuite, à 20 microlitres de microbilles de fibroblastes associées à la tumeur, et incubez les échantillons à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’obscurité. Pendant l’incubation, préparez des colonnes de séparation ferromagnétique sur un support magnétique et équilibrez-les avec 0,5 millilitre de tampon PBE froid. Après l’incubation, ajouter 400 microlitres de PBE à la suspension de la perle et de la cellule.Chargez tout le volume sur la colonne et laissez les cellules non étiquetées s’écouler dans un tube de 15 millilitres. Lavez la colonne trois fois avec 0,5 millilitre de tampon PBE et collectez l’effluent total dans le même tube. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de 1,5 millilitre.Ajoutez un millilitre de PBE sur la colonne et poussez immédiatement le piston dans la colonne pour vider les cellules. Après centrifugation, ressuspendez la pastille cellulaire dans un volume approprié de DMEM et ensemencez les cellules dans une plaque de culture tissulaire. Vérifiez la densité cellulaire au microscope et placez la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour permettre aux cellules d’adhérer et de se développer.L’injection de cellules luciférases 4T1 dans le coussinet adipeux mammaire de souris femelles a conduit à la croissance d’une masse tumorale détectable cinq jours après l’implantation. Pour trouver une fenêtre de sacrifice adéquate pour l’isolement des FAC, un compromis optimal a été recherché entre une taille tumorale plus élevée et l’imagerie par bioluminescence d’une part, et une ulcération tumorale émergente et une nécrose d’autre part. Le jour 20 a été défini comme point de temps pour optimiser la récupération cellulaire, après le processus d’isolement.Deux autres passages ont été nécessaires pour isoler la population de CAF, à partir du panel de cellules viables collectées, l’épuisement des fibroblastes non associés à la tumeur et l’enrichissement des fibroblastes associés à la tumeur. Les cellules CAF ont révélé une grande morphologie en forme de fuseau, typique des fibroblastes, et étaient différentes des cellules tumorales 4T1. L’expression du PAF suivie sur cinq passages confirme que la culture primaire des FAC a conservé ses caractéristiques d’origine.Lorsque la durée et la température des incubations avec des microbilles n’ont pas été maintenues, des clones de morphologie différente ont été trouvés parmi la culture isolée. Ces cellules contaminantes se sont développées plus rapidement et ont prévalu sur la culture primaire de CAF. La liaison des CAF avec le nanomédisant fonctionnalisé Hfn-FAP de ferritine humaine a augmenté de trois fois à une à une et de fragment d’anticorps de un à cinq, par rapport au HFN nu.Au contraire, pour les cellules tumorales 4T1, le HFN nu a montré une liaison plus élevée que le HFN fonctionnalisé. Pour augmenter le rendement en impuretés des CAF isolés, gardez les tampons au froid, respectez le temps d’incubation avec des billes et tirez jusqu’à quatre tumeurs par colonne avant l’étape finale d’enrichissement. Les CAF isolés peuvent être utilisés pour dépister plusieurs nanomédérapeutiques candidats en termes de liaison, d’absorption et d’efficacité pharmacologique avant de procéder à des expériences précliniques in vivo.L’isolement CAF nous a permis de tester si des nanoparticules peuvent être utilisées pour cibler le microenvironnement tumoral. Ouvrant ainsi la voie à de nouvelles thérapies ciblées travaillant en synergie avec la chimiothérapie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancer efficacité de la thérapie photodynamique avec Lung Cancer-ciblée Nanoparticules

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Une injection Modèle Portal Vein pour étudier le foie Métastases du cancer du sein

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Un modèle de souris syngénique rénal métastatique Carcinome cellulaire pour l&#39;évaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

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Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Un modèle de souris syngénique Cancer du pancréas pour étudier les effets de l’électroporation irréversible

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

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Un modèle murin syngénique bioluminescentes et Fluorescent orthotopique du Cancer de la Prostate androgéno-dépendants et résistant à la Castration

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

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Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic Transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’Expression des PD-L1

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Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...