Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Diese Studie wurde von der Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) im Rahmen des Projekts IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio – unterstützt. SM erkennt das pädiatrische klinische Forschungszentrum "Romeo und Enrica Invernizzi" an, das ihre Position unterstützt. AB dankt AIRC (ID. 20172 Projekt) und der Universität Mailand für das Forschungsstipendium. LS- und MS-Postdoc- und Promotionsstipendien werden von der Universität Mailand unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

CAFs entwickeln sich zu Schlüsselakteuren bei der Umgestaltung der extrazellulären Matrix, der Förderung der Metastasenprogression und der Begrenzung des Arzneimittelzugangs zur Tumorstelle34. Aufgrund ihrer Heterogenität sind ihre Rollen jedoch immer noch umstritten - einige CAFs sind tumorigen, während einige andere Subtypen eine tumorunterdrückende Rolle zu spielen scheinen. In diesem Zusammenhang kann ihre Isolation von extremem Interesse sein, um mehr Licht auf ihre viel diskutierte Rolle bei der Krebsprogression zu werfen, die wichtige klinische Auswirkungen haben wird12,31. Darüber hinaus würde eine erfolgreiche CAF-Extraktion aus menschlichen und präklinischen Maustumormodellen auch die Entwicklung neuer CAF-targeting-Medikamente erleichtern. Dieser Artikel berichtet über eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultion primärer CAFs aus einem syngenen präklinischen Modell von Brustkrebs. Erfahrungsgemäß beeinflussen drei experimentelle Schritte meist den Erfolg des Protokolls.
Die erste arbeitet schnell, um die Aggregation von Zellsuspensionen zu vermeiden, die mit dem Risiko der Gerinnung in der Säule und der Verlangsamung des Zellausflusses verbunden sind: In der Tat, wenn Zellen, die durch die Säule gingen, zusammengeballt wurden, erhöhte sich die Wahrscheinlichkeit eines suboptimalen Isolationsprozesses, und die endgültigen Kulturen enthielten "kontaminierende" Zellklone. Die zweite besteht darin, Zellen aus verschiedenen Tumoren nach der Depletion-Passage zu bündeln, um zu garantieren, dass genügend Zellen im letzten Anreicherungsschritt durchlaufen werden. Das letzte kritische Problem ist die Beschichtung der extrahierten Zellen bei hohen Zelldichten, höchstwahrscheinlich ausgehend von einer einzigen Vertiefung der 24-Well-Platte, um das Zellwachstum und die Kolonieexpansion für bis zu 4-5 Passagen zu fördern. Wenn die Zellen mit geringer Dichte ausgesät wurden, dehnten sie sich auf der freien Oberfläche aus und hörten schnell auf, sich zu replizieren.
Mehrere Studien haben bereits CAF-Extraktionsmethoden sowohl menschlichen als auch mausischen Ursprungs beschrieben, um ihre Rolle bei der Förderung der Krebsentwicklung und Invasivität zu untersuchen. Dies wurde bei vielen Arten von Tumoren durchgeführt, einschließlich Brustkrebs, Melanom, Cholangiokarzinom und Pankreas-Adenokarzinom35,36,37,38. Aufgrund des Fehlens spezifischer CAF-Marker und ihrer Heterogenität sind die Ergebnisse dieser Prozesse jedoch immer noch suboptimal.
Hier wurden die isolierten Zellen verwendet, um die CAF-Targeting-Fähigkeit von HFn-Nanocages zu validieren, die mit Anti-FAP-Targeting-Anteilen funktionalisiert wurden. Die Verwendung von Primärkulturen von CAFs war ein wesentlicher Vorteil, der die Validierung der Nanostrategie ex vivo mit einem viel einfacheren und kostengünstigeren Bindungsexperiment ermöglichte, als dies direkt in vivo in dieser Vorphase der Nanodrug-Optimierung zu tun.
In diesem Sinne können Ex-vivo-Tests an CAFs In-vivo-Tierversuchen vorausgehen, indem sie das Screening und die Auswahl der vielversprechendsten Nanopartikel für das optimale Targeting von CAF ermöglichen. Das hier vorgestellte CAF-Modell kann auch für vorläufige Wirksamkeitsstudien verwendet werden, wenn Nanopartikel mit Wirkstoffen beladen werden. Tiere werden erst später verwendet, um Bioverteilung, Pharmakokinetik und Wirksamkeitsstudien zu bewerten.
Mehrere CAF-targeting-Nanodrugs werden entwickelt, wie Ferritin-Nanokäfige für die photodynamische Therapie bei Brustkrebs und peptidbasierte Partikel zur Abgabe von Doxorubicin in Prostatakrebsmodellen39,40. Allerdings haben sich nicht viele Studien auf die Isolierung von CAFs als Zellplattformen zur Nanodrug-Optimierung konzentriert.
Dieses Protokoll hat einige Einschränkungen. Erstens ist es ein zeitaufwendiges Protokoll, das die Vorbereitung und den Kauf mehrerer Reagenzien und Materialien erfordert. Zweitens ist aufgrund der Knappheit von CAFs im 4T1-Brusttumor ihre Ausbeute gering. Nanopartikelexperimente sollten geplant und durchgeführt werden, sobald die erforderliche Zellzahl erreicht ist, da primäre CAFs eine Seneszenz durchlaufen und nicht lange in Kultur gehalten werden können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode der Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von CAFs ein leistungsfähiges Werkzeug sein kann, um die Entwicklung neuer zielgerichteter Nanomedikamente im Kampf gegen Krebs zu beschleunigen.

In den letzten Jahrzehnten hat sich klargestellt, dass das Abtöten von Tumorzellen in der Regel nicht ausreicht, um Malignität auszurotten, da die Tumormikroumgebung einen Tumorrückfall auslösen und therapeutische Resistenzen induzieren kann1,2. Ein neuartiges Paradigma hat sich dann herauskristallisiert: Tumorstroma anzugreifen, um dem Tumor unterstützende Faktoren zu entziehen und so die Wirksamkeit von Chemotherapeutika zu steigern3,4,5. Insbesondere krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sind ein interessantes stromales Ziel in vielen soliden Tumoren6,7. CAFs sind eine sehr heterogene Gruppe von Zellen, die mit Krebszellen und Zellen des Immunsystems durch die Sekretion von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Chemokinen interagieren; Aufbau und Umbau der extrazellulären Matrix; und ermöglichen metastasieren Bildung8,9,10,11,12. Je nach Tumortyp zeigen CAFs pro-tumorigene Funktionen, während andere Subtypen von CAFs tumorsuppressive Funktionen zu haben scheinen13,14. Um diese Dichotomie besser zu klären, ist eine gründliche Charakterisierung von CAFs aus primären und metastasierten Tumoren wichtig.
In diesem Zusammenhang hat sich ein aufstrebendes Forschungsgebiet auf die Entwicklung von nanoskaligen Wirkstoffen konzentriert, die CAFs anvisieren und / oder zerstören sollen, indem aktive Moleküle und Medikamente in der Lagesind,die Tumormikroumgebung umzugestalten15,16,17,18. Mehrere Arten von Nanopartikeln wurden entwickelt, um eine CAF-Ablation durch zytotoxische Medikamente zu erreichen, eine CAF-zielgerichtete photodynamische Therapie zu induzieren oder CAFs umzuprogrammieren, indem sie in einen Ruhezustand zurückverwiesen oder eine TNF-bedingte Apoptose-induzierte Ligandenexpression induziert, die die Apoptose benachbarter Krebszellen induziert16,19. Darüber hinaus gibt das Potenzial vieler Nanopartikel, aktiv auf bestimmte biologische Marker abzuzielen, Anlass zur Hoffnung, CAF-Untergruppen auszuwählen, auf die zielgerichtet werden soll. Obwohl seine absolute Spezifität für CAF immer noch in Frage gestellt wird, ist das Fibroblastenaktivierungsprotein (FAP) eines der vielversprechendsten Ziele des protumorigenen Stromas und wird zur Steuerung der Nanodrug-Abgabe genutzt, wodurch der Weg für die Entwicklung von CAF-targetingden Nanotherapeutika20,21,22geebnet wird.
Dieser Artikel beschreibt die Isolierung primärer CAFs aus einem syngenen Modell von murinem Brustkrebs und berichtet über ihre Verwendung bei der Untersuchung der Targeting-Fähigkeit von Nanopartikeln, die zur Erkennung des CAF-Markers FAP entwickelt wurden. Ferritin-Nanokäfige werden als Kandidaten-Nanosysteme verwendet, um die Methode einzurichten, da ihre Spezifität der Abgabe durch die Oberflächenexposition der Zielseifität der Zielsegemälde23,24geformt werden kann. Darüber hinaus haben sich Ferritine erfolgreich als ausgezeichnete biokompatible Shuttles für Antitumoranwendungen erwiesen, die eine schnelle Ansammlung der Nutzlast in der Tumormasse25,26,27auslösen . Bisher haben präklinische Studien von CAF-targeting-Nanosystemen In-vitro-Tests an Fibroblasten-Zelllinien durchgeführt, die in Kultur mit transformierendem Wachstumsfaktor-Beta stimuliert wurden, um die Zellaktivierung und die Expression einiger immunphänotypischer Merkmale von CAFs zu induzieren28,29. Diese Methode wird normalerweise auf immortalisierte Zelllinien (wie NIH3T3, LX-2) angewendet und ist ziemlich schnell und einfach und liefert aktivierte Zellen in wenigen Stunden oder Tagen. Eine Einschränkung besteht darin, dass die In-vitro-Stimulation zwar die Expression einiger Gene induziert, die aktivierten Myofibroblasten zugeschrieben werden, aber nicht alle biologischen Merkmale realer CAFs vollständig rekapitulieren kann, insbesondere ihre Heterogenität in vivo.
Eine weitere Strategie beinhaltet die Extraktion von primären CAFs aus tumorproben von Menschen oder Mäusen30,31. Dadurch wird sichergestellt, dass die CAF-Aktivierung in einem physiologischen Kontext erfolgt und die Heterogenität der CAF-Subpopulationen erhalten bleibt. Entsprechend dem Forschungsziel können CAFs aus verschiedenen Quellen abgeleitet werden und bieten so die Möglichkeit, die zuverlässigste Bedingung zu untersuchen. Das hier berichtete Protokoll wäre wertvoll für Wissenschaftler, die eine vorläufige Bewertung der Funktionalität neuartiger Nanopartikel durchführen möchten, die auf CAFs aus einem murinen Brustkrebsmodell abzielen. Isolierte CAFs wären nützlich, um nanopartikel zu untersuchen, die vielversprechend genug sind, um für die In-vivo-Bewertung in Tiermodellen von Krebs fortzufahren. Dies wird während der ersten Schritte der Nanopartikelproduktion relevant sein und Nanotechnologen zur Verfeinerung des Nanopartikeldesigns antreiben, indem sie hauptsächlich die Strategie der Ligandenimmobilisierung berücksichtigen, um optimale Zieleigenschaften zu erzielen.

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		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sind Schlüsselakteure im Kontext der Tumormikroumgebung. Obwohl sie im Vergleich zu Tumorzellen in der Anzahl reduziert sind, regulieren CAFs die Tumorprogression und bieten Schutz vor Antitumorimmunität. Neue Antikrebsstrategien zielen darauf ab, die Tumormikroumgebung durch die Ablation protumorigener CAFs oder die Reprogrammierung von CAFs-Funktionen und deren Aktivierungsstatus umzugestalten. Ein vielversprechender Ansatz ist die Entwicklung von nanoskaligen Abgabemitteln, die in der Lage sind, CAFs anzusprechen und so die spezifische Abgabe von Medikamenten und aktiven Molekülen zu ermöglichen. In diesem Zusammenhang kann ein zelluläres Modell von CAFs ein nützliches Werkzeug für das In-vitro-Screening und die Voruntersuchung solcher Nanoformulierungen sein.
Diese Studie beschreibt die Isolierung und Kultur primärer CAFs aus dem syngenen 4T1-Murinmodell von dreifach negativem Brustkrebs. Magnetische Perlen wurden in einem 2-stufigen Trennprozess verwendet, um CAFs aus dissoziierten Tumoren zu extrahieren. Die Immunphänotypisierungskontrolle wurde nach jeder Passage mittels Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Prozessausbeute zu überprüfen. Isolierte CAFs können verwendet werden, um die Targeting-Fähigkeit verschiedener Nanoformulationen zu untersuchen, die zur Bekämpfung der Tumormikroumgebung entwickelt wurden. Fluoreszierend markierte H-Ferritin-Nanocages wurden als Kandidaten-Nanopartikel verwendet, um die Methode einzurichten. Nanopartikel, entweder blank oder konjugiert mit einem Zielliganden, wurden auf ihre Bindung an CAFs analysiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ex-vivo-Extraktion von Brust-CAFs ein nützliches System sein könnte, um Nanopartikel für das spezifische Targeting von tumorigenen CAFs zu testen und zu validieren.

In-vivo-Modell-Setup für optimale CAFs-Isolierung Die Injektion von 105 4T1-luc-Zellen in das Brustfettpolster weiblicher BALB/c-Mäuse führt 5 Tage nach der Implantation zum Wachstum einer nachweisbaren Tumormasse. Durch die Messung des Tumorvolumens durch Messschieber und der Tumorzelllebensfähigkeit durch BLI wurde das Tumorwachstum einen Monat nach der Implantation überwacht. Um ein Opferfenster zu finden, das für die CAFs-Isolierung ausreichend ist, wurde ein optimaler Kompromiss zwischen höherer Tumorgröße und BLI auf der einen Seite und einer auftretenden Tumorulzeration und Nekrose auf der anderen Seite gesucht (Abbildung 1). Da ein nekrotischer Kern 20 Tage nach der Implantation erscheint und sich nach 25 und 30 Tagen vergrößert (wie durch BLI-Bilder in Abbildung 1Cdokumentiert), wurde Tag 20 als Zeitpunkt für die Optimierung der Zellerholung nach dem Isolationsprozess festgelegt. Auch nach sorgfältiger Entfernung aller sichtbaren nekrotischen Bereiche während der ersten Schritte der Tumorbehandlung ex vivowurde am Ende der Dissoziation in einzelne Zellen ein hoher Prozentsatz toter Zellen gefunden (Tabelle 1). Da dieser Prozentsatz relevant sein kann, insbesondere bei der Zunahme der Tumorgröße, ist bei der Arbeit mit dem 4T1-Modell immer eine Entfernung abgestorbener Zellen erforderlich.
Optimierung des Isolationsverfahrens, der Kultur und der Charakterisierung von CAFs Zwei weitere Passagen werden benötigt, um die Population von CAFs (CD90.2+ CD45-) aus dem Panel der gesammelten lebensfähigen Zellen zu isolieren: die Erschöpfung von nicht-tumorassoziierten Fibroblasten und die Anreicherung von tumorassoziierten Fibroblasten (Abbildung 2). Der Depletion Bead Cocktail entfernt effizient CD45+ Zellen (67,35% bzw. 0,69% der Gesamtzellen vor und nach der Depletion, Tabelle 2)und wurde immer verwendet, um einen einzigen Tumor in jeder Säule zu verarbeiten. Wie in Tabelle 1gezeigt, sank die Anzahl der eluierten Zellen nach dem Erschöpfungsschritt von durchschnittlich 3 ×10 6 auf 1 ×10 5. Aufgrund dieser massiven Abnahme der Gesamtzellzahl ist es praktisch, die gesammelten Zellen von mindestens 2 bis maximal 4 Tumoren in einem einzigen Röhrchen zu bündeln, bevor mit dem Anreicherungsschritt fortgefahren wird. Auf diese Weise wurde eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Inkubation mit tumorassoziierten Fibroblastenperlen erhalten und durch eine einzige Trennsäule geleitet, um einen endgültigen Durchschnitt von 93% der CD90.2+ CD45-Zellen zu erhalten (Tabelle 2).
Einmal auf Gewebekulturplatten ausgesät, befestigten sich diese zellen wieder am Kunststoff und zeigten eine große spindelförmige Morphologie, die typisch für Fibroblasten ist (Abbildung 3A, B) und sich von 4T1-Tumorzellen unterscheidet ( Abbildung3D). Das Nichtpoolen von Tumoren nach der Erschöpfung führt dazu, dass die zelluläre Ausbeute mit tumorassoziierten Fibroblasten-Mikroperlen zu niedrig ist, um eine Kultur aufzubauen. In anderen Fällen, wenn die Dauer und Temperatur der Inkubationen mit Mikroperlen nicht sorgfältig eingehalten werden, kann eine unspezifische Bindung auftreten. In solchen Fällen waren die Anreicherungsschritte weniger effizient und es wurden höhere Prozentsätze von CD90.2- CD45+ und CD90.2- CD45- Zellen zusammen mit den CD90.2+ CAFs (5,97 ± 1,5 bzw. 16,75 ± 1,1) wiederhergestellt (Abbildung 4 und Tabelle 3). Diese Kontaminantenzellen waren wahrscheinlich für das Vorhandensein kleiner Klone mit unterschiedlicher Morphologie in Kultur verantwortlich (Abbildung 4B, schwarze Pfeilspitzen), die schneller wuchsen als CAFs und sich gegenüber der primären CAF-Kultur durchsetzten (Abbildung 4C). Diese suboptimalen Ergebnisse bestätigten, wie wichtig es ist, sowohl die CD90.2- und CD45-Expression als auch die Zellmorphologie am Ende des Anreicherungsprozesses und während des Zellwachstums in Kultur immer zu überprüfen.
Einsatz isolierter Zellen zur Bewertung des CAF-Targeting-Potenzials von technisch hergestellten Nanorugs Die frisch isolierten CAFs können für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, die von der Grundlagenforschung bis hin zu pharmakologischen Studien reichen. Ziel dieser Gruppe ist es, HFn-Nanocages zu entwickeln, die speziell auf CAFs abzielen können. HFn wurde mit einem spezifischen Anti-FAP-Antikörperfragment (HFn-FAP) bei zwei verschiedenen Protein:Antikörper-Verhältnissen (ein niedrigeres 1:1 und ein höheres 1:5) funktionalisiert und ihre Bindung mit CAFs getestet. Da FAP als Oberflächenbiomarker protumorigener CAFs verwendet wurde, war es von grundlegender Bedeutung, die FAP-Expression auf isolierten CAFs zu überprüfen (Abbildung 3C). Der FAP-Ausdruck wurde über 5 Passagen in der Kultur befolgt, um zu bestätigen, dass die primäre CAF-Kultur ihre ursprünglichen Eigenschaften beibehielt.
Es wurde festgestellt, dass die FAP-Funktionalisierung auf HFn zu einer signifikanten Verschiebung in Richtung CAF-Targeting im Vergleich zu nacktem HFn beiträgt, und die geringere Menge an Antikörpern (1:1) reichte aus, um diesen Effekt zu beobachten (Abbildung 5A). Dies wurde jedoch nicht bei den Tumor-4T1-Zellen beobachtet, die zum Aufbau des In-vivo-Tumormodells verwendet wurden, wobei nacktes HFn eine höhere Bindung aufwies als funktionalisiertes HFn (Abbildung 5B). Dies war höchstwahrscheinlich auf das Fehlen einer FAP-Überexpression in 4T1-Zellen und die bevorzugte Interaktion von HFn mit TfR1 zurückzuführen, die die HFn-Aufnahme in Zellen reguliert, wie von dieser Gruppe27,33weithin berichtet . Diese Ergebnisse bestätigen die Nützlichkeit der Verwendung von Primärkulturen von Brust-CAFs, um die Targeting-Fähigkeit von Nanopartikeln, die zur Bekämpfung der Tumormikroumgebung entwickelt wurden, vorläufig zu screenen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Abbildung 1: Etablierung des 4T1-Tumormodells. Zellen (105 Zellen/Maus) wurden in das Brustfettpolster injiziert. Das Tumorwachstum wurde an den Tagen 5, 10, 15, 20, 25 und 30 nach der Implantation (A) durch Messung des Tumorvolumens mit Messschiebern und (B) durch Biolumineszenzbildgebung verfolgt. Tumorvolumina und BLI werden alsmm3 bzw. Anzahl ausgedrückt. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche ± SEM (n=6) angegeben. (C) BLI repräsentative Bilder, die 5, 10, 15, 20, 25 und 30 Tage nach der Zellimplantation erhalten wurden, bestätigen das Tumorwachstum bis zum 25. Tag, wenn es ein Plateau zu erreichen scheint. Zum letzten Zeitpunkt der Analyse (30 Tage) steigt der BLI im Vergleich zu Tag 25 nicht an. Ab Tag 20 werden Bereiche der Nekrose und Ulzeration im zentralen Teil des Tumors sichtbar. Farbskala: Min = 1.194, Max = 20.462. Abkürzungen: BLI = bioluminescence imaging; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Abbildung 2: Tumorprobenvorbereitung und Durchflusszytometrie charakterisierung isolierter CAFs. Tumore wurden herausgeschnitten und mit Hilfe eines Skalpells in(A)kleine Stücke von etwa 1–2 mm reduziert; (B) Einzelzellsuspension nach Gewebeverdauung und mechanischer Dissoziation eines herausgeschnittenen Tumors; (C) Zellpellet, das nach Lyse der roten Blutkörperchen gewonnen wird; (D) Durchflusszytometrie-Analyse der CD45- und CD90.2-Expression in Zellen, die nach Entfernung von roten Blutkörperchen und toten Zellen erhalten wurden, (E) nach Erschöpfung von nicht krebs-assoziierten Fibroblasten und (F) nach Anreicherung von krebs-assoziierten Fibroblasten, wobei die Mehrheit der Zellen CD90.2+ CD45- (blaues Rechteck) sind. Abkürzungen: CAFs= krebsintezidierte Fibroblasten; CD = Cluster der Differenzierung; PE-A = Fläche von Phycoerythrin; FITC-A = Bereiche von Fluoresceinisothiocyanat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Abbildung 3: Morphologische Analyse der CAF-s- und FAP-Expression. (A, B) Die Morphologie der CAFs wurde in allen Passagen der Kultur durch optische Mikroskopie (unterschiedliche Konfluenzniveaus an Passage 2 und Passage 5) überprüft und mit (D) 4T1-Tumorzellen verglichen; Skala Riegel = 10 μm. (C) Die Expression des Fibroblastenaktivierungsproteins (FAP) wurde am Ende des Isolationsprozesses an den gesammelten CD90.2+ CD45-Zellen mittels Durchflusszytometrie bewertet, um ihre molekularen Eigenschaften zu bestätigen. Für nicht gefärbte Kontrollzellen wurde eine Fluoreszenzschwelle festgelegt (rote Grafik), um die mittlere Fluoreszenzintensität und den Prozentsatz positiver Zellen (FAP+)unter antikörpergefärbten Zellen zu quantifizieren (blaue Grafik). Abkürzungen: CAFs= krebsintezidierte Fibroblasten; FAP = Fibroblasten-Aktivierungsprotein; CD = Cluster der Differenzierung; MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; Ab = Antikörper; FITC-A = Fläche von Fluoresceinisothiocyanat; FAP+ = FAP-positive Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Abbildung 4: Beispiel für einen suboptimalen CAFs-Isolationsprozess. (A) Die Auswertung der Durchflusszytometrie nach dem letzten Isolationsschritt ergab das Vorhandensein von cd90.2- CD45+ und CD90.2- CD45- Zellen. (B) Diese Zellen können als Klone mit kleiner runder Morphologie bei der Aussaat (schwarze Pfeilspitzen und Einschub in der unteren linken Ecke des Panels) gesehen werden, die (C) nach der dritten Passage in Kultur gegenüber CAFs vorherrschten. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: CAF = krebs-assoziierter Fibroblast; CD = Cluster der Differenzierung; PE-A = Fläche von Phycoerythrin; FITC-A = Bereiche von Fluoresceinisothiocyanat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Abbildung 5: Bindung von HFn-Nanocages an CAFs und 4T1. HFn-Nanocages wurden fluoreszierend mit FITC markiert, mit einem Anti-FAP-Antikörperfragment (HFn-FAP) bei zwei verschiedenen Protein-Antikörper-Verhältnissen (1:1 und 1:5) funktionalisiert und mit (A) Ziel-CAFs und (B) 4T1-Zellen bei 4 °C für 2 h inkubiert. Die Bindung wurde mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. (A) Die HFn-FAP-Bindung mit CAFs ist bei beiden Antikörperfragmentkonzentrationen im Vergleich zu nacktem HFn signifikant um das Dreifache erhöht. (B) Im Gegensatz dazu wurde eine signifikant höhere Bindung von nacktem HFn in 4T1-Zellen beobachtet, wo die Bindung nicht durch FAP-Erkennung verstärkt wird. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten angegeben. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Abkürzungen: CAFs= krebsintezidierte Fibroblasten; FAP = Fibroblasten-Aktivierungsprotein; HFn = rekombinante Variante der schweren Ferritinkette des Menschen, die als blankes Nanopartikel oder konjugiert verwendet wird; HFN-FAP = HFn-Nanopartikel, funktionalisiert mit dem variablen Anteil eines Anti-FAP-Antikörpers, der bei zwei HFn:Fab@FAP Molarenverhältnissen, 1:1 und 1:5, hergestellt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Zellennummer (durchschnittliche ± SD)</td>
			<td>Extraktionsertrag Gesamt (pro Durchgang)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herausgeschnittener Tumor (Entfernung roter Blutkörperchen)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herausgeschnittener Tumor (Entfernung nach toter Zelle)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail nach der Erschöpfung</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nachanreicherung</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Gesamtzellzahl nach jedem Schritt der Isolierung von krebsinseziierten Fibroblasten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zellverteilung (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herausgeschnittener Tumor (Entfernung nach toter Zelle)</td>
			<td>1,81 ± 0,98</td>
			<td>10,78 ± 4,51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57 Uhr</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail nach der Erschöpfung</td>
			<td>69,33 ± 16,75</td>
			<td>0,14 ± 0,13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nachanreicherung</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Zellverteilung nach Expression von CD90.2 und CD45 nach jeder Passage der Isolierung von krebsinteziierten Fibroblasten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zellverteilung (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post Enrichment (kein Pooling)</td>
			<td>75,80 ± 2,9</td>
			<td>1,49 ± 0,4</td>
			<td>5,97 ± 1,5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: CD90.2- und CD45-Expression von Zellen, die nach einem suboptimalen krebsinteziierten Fibroblasten-Isolationsexperiment gesammelt wurden.

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Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Diese Arbeit zielt darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung und Kultur von primären krebsassoziierten Fibroblasten aus einem syngenen murinen Modell von dreifach negativem Brustkrebs und deren Anwendung für die präklinische Untersuchung neuartiger Nanopartikel bereitzustellen, die auf die Tumormikroumgebung abzielen.

Isolierung primärer krebsseziensässiger Fibroblasten aus einem syngenen murinen Modell von Brustkrebs zur Untersuchung gezielter Nanopartikel

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, primäre krebsassoziierte Fibroblasten aus Murin-Brustkrebs erfolgreich zu isolieren und zu kulturieren, um neuartige Nanopartikel zu screenen, die auf die Tumormikroumgebung abzielen. Primäre CAF stellen das zuverlässigste und physiologischste Modell für In-vitro-Studien von Tumorstroma dar. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man einen optimalen Ertrag erzielt.Bereiten Sie zunächst eine Verdauungsmischung für die Tumordissoziation vor und tränken Sie die drei bis fünf Millimeter großen Tumorfragmente nach dem festen Schließen des Röhrchens in der Lösung. Drehen Sie die Röhre auf den Kopf und überprüfen Sie, ob sich alle Tumorstücke am Boden der Röhre in Richtung der Kappe befinden. Befestigen Sie dann die Röhre an einem mechanischen Dissoziter im richtigen Gehäuse und führen Sie ein Dissoziationsprogramm durch, das speziell für zähe Tumore entwickelt wurde.Nach dem Lauf das Röhrchen abnehmen und auf den Kopf stellen, um die Probe bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten mit sanftem Schütteln zu inkubieren. Befestigen Sie dann den Schlauch wieder am Dissoziter im richtigen Gehäuse und führen Sie das Dissoziationsprogramm für zähe Tumore zweimal durch, um sicherzustellen, dass am Ende des Verfahrens keine großen Gewebestücke zurückbleiben. Filtern Sie die Probe durch ein 40 Mikron Zellsieb in einem 50 Milliliter Röhrchen.Anschließend den Filter mit 10 Millilitern RPMI 1640 Medium und Zentrifuge waschen. Nach der Zentrifugation wird das Pellet in PBE-Puffer, bestehend aus PBS, 0,5% BSA und zwei Millimolar-EDTA, wieder aufgewendet und die Zellen mit Trypan Blue gezählt. Reparieren Sie den Bindungspuffer zur Entfernung toter Zellen, indem Sie die 20-fache Bindungspufferlösung mit sterilem doppelt destilliertem Wasser verdünnen.Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 1X Bindungspuffer und Zentrifuge. Nach der Zentrifugation das Zellpellet mit 0,1 Milliliter mikroperlen zur Entfernung abgestorbener Zellen für bis zu 10 bis zu den siebten Zellen wieder aufsetzen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation einen magnetischen Ständer unter der Haube vor und hängen Sie ferromagnetische Trennsäulen daran, wobei die Spitzen nach unten zeigen.Gleichen Sie die Säulen mit 0,5 Milliliter Kaltbindungspuffer aus und warten Sie, bis die Lösung durchgeflossen ist. Nach der Inkubation 400 Mikroliter Kaltbindungspuffer zur Perle und Zellsuspension geben. Laden Sie das gesamte Volumen auf die Säule und sammeln Sie das Abwasser in einem 15-Milliliter-Rohr.Waschen Sie die Säule viermal mit 0,5 Millilitern Kaltbindungspuffer und sammeln Sie das gesamte Abwasser im selben Röhrchen. Für die Erschöpfung von nicht krebsbedingten Fibroblasten filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70-Mikron-Zellsieb, das mit PBS befeuchtet ist, und zentrifugieren Sie die Zellen. Entfernen Sie den Überstand und reißen Sie das Pellet in 80 Mikroliter kaltem PBE-Puffer wieder auf.Fügen Sie 20 Mikroliter nicht tumorassoziierten Fibroblasten-Depletion-Cocktail hinzu. Gut mischen und die Probe bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation mit Perlen ferromagnetische Erschöpfungssäulen auf einem magnetischen Ständer vor.Gleichen Sie die Säulen mit zwei Millilitern kaltem PBE-Puffer aus und warten Sie, bis die Lösung durchgeflossen ist. Nach der Inkubation 400 Mikroliter Puffer zur Perle und Zellsuspension hinzufügen. Laden Sie das gesamte Volumen auf die Säule und sammeln Sie das Abwasser in einem 15-Milliliter-Rohr.Waschen Sie die Säule zweimal mit zwei Millilitern PBE. Sammeln Sie das gesamte Abwasser in dasselbe Rohr und zentrifugiert das Abwasser. Für die positive Selektion krebsbedingter Fibroblasten wird das Pellet in 80 Mikrolitern kalter PBE-Puffer resuspendiert.Dann bei 20 Mikrolitern tumorassoziierten Fibroblasten Mikroperlen und die Proben bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation ferromagnetische Trennsäulen auf einem magnetischen Ständer vor und gleichen Sie sie mit 0,5 Milliliter kaltem PBE-Puffer aus. Nach der Inkubation 400 Mikroliter PBE zur Perle und Zellsuspension geben.Laden Sie das gesamte Volumen auf die Säule und lassen Sie die unbeschrifteten Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr fließen. Waschen Sie die Säule dreimal mit 0,5 Millilitern PBE-Puffer und sammeln Sie das gesamte Abwasser im selben Röhrchen. Entfernen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Rohr.Fügen Sie einen Milliliter PBE auf die Säule hinzu und drücken Sie den Kolben sofort in die Säule, um die Zellen auszuspülen. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in einem geeigneten DMEM-Volumen wieder aufsetzen und die Zellen in einer Gewebekulturplatte aussäen. Überprüfen Sie die Zelldichte unter einem Mikroskop und legen Sie die Platte auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, damit die Zellen anhaften und wachsen können.Die Injektion von 4T1-Luciferase-Zellen in das Brustfettpolster weiblicher Mäuse führte fünf Tage nach der Implantation zum Wachstum einer nachweisbaren Tumormasse. Um ein Opferfenster zu finden, das für die CAF-Isolierung ausreicht, wurde ein optimaler Kompromiss zwischen höherer Tumorgröße und Biolumineszenzbildgebung auf der einen Seite und einer auftretenden Tumorulzeration und Nekrose auf der anderen Seite gesucht. Tag 20 wurde als Zeitpunkt für die Optimierung der Zellerholung nach dem Isolationsprozess festgelegt.Zwei weitere Passagen wurden benötigt, um die Population von CAFs aus dem Panel der gesammelten lebensfähigen Zellen, der Erschöpfung von nicht tumorassoziierten Fibroblasten und der Anreicherung von tumorassoziierten Fibroblasten zu isolieren. CAF-Zellen zeigten eine große spindelförmige Morphologie, die typisch für Fibroblasten ist und sich von 4T1-Tumorzellen unterscheidet. Der FAP-Ausdruck, der über fünf Passagen folgte, bestätigt, dass die primäre CAF-Kultur ihre ursprünglichen Eigenschaften beibehalten hat.Wenn Dauer und Temperatur der Inkubationen mit Mikroperlen nicht eingehalten wurden, wurden Klone mit unterschiedlicher Morphologie in der isolierten Kultur gefunden. Diese Kontaminantenzellen wuchsen schneller und setzten sich gegen die primäre CAF-Kultur durch. CAFs, die mit humanem Ferritin Hfn-FAP-funktionalisiertem Nanomedikament binden, erhöhten sich bei eins zu eins und ein bis fünf Antikörperfragmentkonzentrationen um das Dreifache im Vergleich zu blankem HFN.Im Gegenteil, für Tumor-4T1-Zellen zeigte nacktes HFN eine höhere Bindung als funktionalisiertes HFN. Um die Ausbeute der Verunreinigung von isoliertem CAF zu erhöhen, halten Sie die Puffer kalt, respektieren Sie die Inkubationszeit mit Perlen und ziehen Sie bis zu vier Tumore pro Säule vor dem letzten Anreicherungsschritt. Die isolierten CAFs können verwendet werden, um mehrere Kandidaten-Nano-Medikamente in Bezug auf Bindung, Aufnahme und pharmakologische Wirksamkeit zu screenen, bevor mit präklinischen In-vivo-Experimenten fortgefahren wird.Mit der CAF-Isolierung konnten wir testen, ob Nanopartikel verwendet werden können, um die Mikroumgebung des Tumors anzusprechen. Damit wird der Weg zu neuen zielgerichteten Therapien geebnet, die in Synergie mit der Chemotherapie arbeiten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Forschung

Krebsforschung

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopen Transplantation von Phänomen Lungenzellen Adenokarzinom, PD-L1 Ausdruck zu studieren

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...