Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי Associazione Italiana per la Ricerca סול Cancro (AIRC) תחת IG 2017-ID. 20172 פרויקט – P.I. קורסי פאביו. SM מכירה במרכז המחקר הקליני לילדים "רומיאו ואנריקה אינברניצי" התומך בעמדתה. AB מודה AIRC (ID. 20172 פרויקט) ואוניברסיטת מילאנו עבור מלגת מחקר. מלגות פוסט-דוקטורט ודו-דוקטורט של LS ותל.אס נתמכות על ידי אוניברסיטת מילאנו.

<ol>
	<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer.">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li><li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+and+their+microenvironments:+tilling+the+soil.+Commentary+re:+A.+M.+Scott+et+al.,+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer.">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li><li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+Sanctuary+of+the+devil.">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li><li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+foes+to+friends:+targeting+cancer-associated+fibroblasts.">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li><li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts:+origins,+functions+and+translational+impact.">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Li, X. -. Y., Hu, S. -. Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance.">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li><li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression.">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li><li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer.">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li><li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment.">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, 186-196 (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics.">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts:+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy.">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).</li><li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment.">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li><li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers.">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027 (2020).</li><li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors.">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li><li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;:+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies.">Fibroblast activation protein-&#945;: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;+in+fibrogenic+disorders+and+cancer:+more+than+a+prolyl-specific+peptidase.">Fibroblast activation protein-&#945; in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li><li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin.">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+nanocages:+A+biological+platform+for+drug+delivery,+imaging+and+theranostics+in+cancer.">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size.">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li><li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoferritin+applications+in+nanomedicine.">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li><li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity.">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy.">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li><li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma.">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li><li>Kov&#225;cs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts.">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).</li><li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax.">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328 (2021).</li><li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells.">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li><li>Dvo&#345;&#225;nkov&#225;, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+(CAFs)+for+biomedical+research.">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li><li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages.">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).</li><li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma.">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li><li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression.">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li><li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control.">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li><li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery.">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

CAFs מתגלים כשחקני מפתח בשיפוץ מטריצה חוץ תאית, קידום התקדמות גרורות והגבלת הגישה לתרופות לאתר הגידול34. עם זאת, בשל ההטרוגניות שלהם, תפקידיהם עדיין שנויים במחלוקת – חלק מה-CAFs הם גידוליים, בעוד שלתת-סוגים אחרים יש תפקיד מדכא גידולים. בהקשר זה, הבידוד שלהם יכול להיות עניין קיצוני לשפוך אור נוסף על תפקידם השנוי במחלוקת בהתקדמות הסרטן, אשר יהיו השלכות קליניות חשובות12,31. יתר על כן, מיצוי CAF מוצלח ממודלים אנושיים ופרה-אקליניים של גידול עכברים יקל גם על פיתוח תרופות חדשות למיקוד CAF. מאמר זה מדווח על שיטה לבודד ביעילות ותרבות CAFs ראשוני ממודל פרה-אקליני של סרטן השד. בהתבסס על ניסיון, שלושה צעדים ניסיוניים משפיעים בעיקר על הצלחת הפרוטוקול.
הראשון עובד מהר כדי למנוע צבירה של השעיות תאים הקשורים לסיכון של קרישה בעמודה והאטה של שפכים תאים: למעשה, כאשר תאים שעברו דרך העמודה היו מקובצים יחד, ההסתברות של תהליך בידוד תת אופטימלי גדל, ואת התרבויות הסופיות הכילו שיבוטים תאים "מזהמים". השני הוא איגום תאים מגידולים שונים לאחר מעבר הדלדול כדי להבטיח מספיק תאים לעבור בשלב ההעשרה הסופי. הבעיה הקריטית הסופית היא ציפוי התאים שחולצו בצפיפות תאים גבוהה, ככל הנראה החל מבאר אחת של צלחת 24-well כדי להגביר את צמיחת התאים ואת הרחבת המושבה עבור עד 4-5 מעברים. אם התאים נזרעו בצפיפות נמוכה, הם התרחבו על פני השטח החופשיים והפסיקו במהירות לשכפל.
מספר מחקרים כבר תיארו שיטות מיצוי CAF ממוצא אנושי ועכבר, כדי ללמוד את תפקידם בקידום התפתחות סרטן ו פולשניות. זה נעשה בסוגים רבים של גידולים, כולל סרטן השד, מלנומה, cholangiocarcinoma, ואדנוקרצינומההלבלב 35,36,37,38. עם זאת, בשל היעדר סמני CAF ספציפיים ועל ההטרוגניות שלהם, התוצאות של תהליכים אלה עדיין תת אופטימלי.
כאן, התאים המבודדים שימשו לאימות יכולת פילוח CAF של ננו-נצ'ים HFn פונקציונליים עם moieties מיקוד נגד FAP. השימוש בתרבויות ראשוניות של CAFs היה יתרון משמעותי, המאפשר אימות של ex vivo nanostrategy עם ניסוי מחייב הרבה יותר פשוט וחסכוני מאשר לעשות את זה ישירות vivo בשלב ראשוני זה של אופטימיזציה nanodrug.
במובן זה, בדיקות ex vivo על CAFs יכול להקדים בניסויים בבעלי חיים vivo על ידי מתן אפשרות הקרנה ובחירה של חלקיקים מבטיחים ביותר עבור מיקוד אופטימלי של CAF. מודל CAF המוצג כאן עשוי לשמש גם למחקרי יעילות ראשוניים, בעת טעינת חלקיקים עם תרופות פעילות. בעלי חיים ישמשו רק מאוחר יותר להערכת ייחוס ביולוגי, פרמקוקינטיקה, ומחקרי יעילות.
מספר ננו-דראגים ממוקדי CAF מפותחים, כגון ננו-ים של פריטין לטיפול פוטודינמי בסרטן השד וחלקיקים מבוססי פפטיד כדי לספק דוקסורוביצין במודלים של סרטן הערמונית39,40. עם זאת, לא הרבה מחקרים התמקדו בבידוד של CAFs כפלטפורמות תאים עבור אופטימיזציה nanodrug.
לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות. ראשית, זהו פרוטוקול גוזל זמן, הדורש הכנה ורכישה של מספר ריאגנטים וחומרים. שנית, בשל המחסור של CAFs בגידול השד 4T1, התשואה שלהם נמוכה. ניסויי ננו-חלקיקים צריכים להיות מתוכננים ומבוצעים ברגע שמספר התא הנדרש מושג, כמו CAFs ראשוני לעבור senescence ולא ניתן לשמור על התרבות במשך זמן רב. לסיכום, שיטה זו של בידוד CAFs, culturing, ואפיון יכול להיות כלי רב עוצמה כדי להאיץ את הפיתוח של nanomedicines ממוקד חדש במאבק נגד סרטן.

במהלך העשורים האחרונים, התברר כי הריגת תאים סרטניים בדרך כלל אינה מספיקה כדי למגר ממאירות, כמו microenvironment הגידול עשוי לגרום להישנות הגידול ולעורר התנגדות טיפולית1,2. לאחר מכן הופיעה פרדיגמה חדשנית: מיקוד סטרומה הגידול כדי לשלול את הגידול של גורמים תומכים ובכך, להגביר את היעילות שלכימותרפיה 3,4,5. בפרט, פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) הם מטרה סטרומה מעניינת בגידולים מוצקים רבים6,7. CAFs הם קבוצה הטרוגנית מאוד של תאים אינטראקציה עם תאים ותאים סרטניים של המערכת החיסונית באמצעות הפרשת גורמי גדילה, ציטוקינים, וכימותרפיה; לבנות ול לשפץ את המטריצה החוץ-תאית; ואפשר היווצרות גרורות8,9,10,11,12. בהתאם לסוג הגידול, CAFs להראות פונקציות פרו-tumorigenic, בעוד תת סוגים אחרים של CAFs נראה שיש פונקציות מדכאות גידול13,14. כדי להבהיר טוב יותר את הדיכוטומיה הזו, חשוב אפיון יסודי של CAFs מגידולים ראשוניים ודרסטטיים.
בהקשר זה, תחום מחקר מתפתח התמקד בפיתוח סוכנים ננו-גדולים שנועדו למקד ו /או להרוס CAFs על ידי אספקת מולקולות ותרופות פעילות מסוגל לשפץ את microenvironment הגידול15,16,17,18. מספר סוגים של חלקיקים תוכננו כדי להשיג אבלציה CAF על ידי תרופות ציטוטוקסיות, כדי לגרום לטיפול פוטודינמי ממוקד CAF, או לתכנת מחדש CAFs על ידי החזרתם למצב של קיפאון או גרימת ביטוי ליגנד הקשורים TNF, אשר גורמת אפופטוזיס של תאים סרטניים שכנים16,19. יתר על כן, הפוטנציאל של חלקיקים רבים למקד באופן פעיל סמנים ביולוגיים ספציפיים מעורר תקווה של בחירת תת קבוצות CAF למקד. למרות הספציפיות המוחלטת שלה עבור CAF עדיין מוטל בספק, חלבון הפעלה פיברובלסט (FAP) הוא אחד היעדים המבטיחים ביותר של סטרומה פרו-tumorigenic והוא מנוצל כדי לנווט משלוח nanodrug, ובכך לסלול את הנתיב להתפתחות של ננו-תרופוטיקה ממוקדת CAF20,21,22.
מאמר זה מתאר את הבידוד של CAFs ראשוני ממודל סינגני של סרטן השד מורין ומדווח על השימוש שלהם בחקר יכולת הפילוח של חלקיקים מהונדס לזהות את סמן CAF, FAP. ננו-שניות של פריטין משמשות כננו-מערכות מועמדות כדי להגדיר את השיטה, שכן הספציפיות שלהם של המסירה עשויה להיות מעוצבת על ידי החשיפה פני השטח של moieties מיקוד23,24. יתר על כן, פריטינים הוכחו בהצלחה להיות מעבורות ביו תואמות מעולה עבור יישומי antitumor, מפעיל הצטברות מהירה של המטען במסת הגידול25,26,27. עד כה, מחקרים פרה-קליניים של מערכות ננו-מיקוד CAF מעורבים בבדיקות במבחנה על קווי תאים פיברובלסט מגורה בתרבות עם שינוי גורם גדילה-בטא כדי לגרום להפעלת התא ואת הביטוי של כמה תכונות אימונופנוטיפיקיות של CAFs28,29. שיטה זו מוחלת בדרך כלל על קווי תאים מונצחים (כגון NIH3T3, LX-2) והיא מהירה ופשוטה למדי, מניבה תאים מופעלים תוך מספר שעות או ימים. מגבלה היא כי למרות גירוי במבחנה גורמת לביטוי של כמה גנים המיוחסים myofibroblasts מופעל, זה לא יכול לגמרי לשחזר את כל התכונות הביולוגיות של CAFs אמיתי, במיוחד ההטרוגניות שלהם ויוו.
אסטרטגיה נוספת כוללת מיצוי CAFs ראשוני מדגימות גידול אנושי או עכבר30,31. זה מבטיח כי הפעלת CAF מתרחשת בהקשר פיזיולוגי, וכי ההטרוגניות של אוכלוסיות CAF נשמרת. על פי מטרת המחקר, CAFs עשוי להיגזר ממקורות שונים, ובכך להציע את האפשרות ללמוד את המצב האמין ביותר. הפרוטוקול שדווח כאן יהיה בעל ערך עבור מדענים המבקשים לבצע הערכה ראשונית של הפונקציונליות של חלקיקים חדשניים שנועדו למקד CAFs ממודל סרטן השד מורין. CAFs מבודד יהיה שימושי עבור הקרנת חלקיקים אלה כי הם מבטיחים מספיק כדי להמשיך להערכת vivo במודלים בעלי חיים של סרטן. זה יהיה רלוונטי בשלבים הראשונים של ייצור ננו-חלקיקים, נהיגה ננוטכנולוגיה לקראת עידון של עיצוב ננו-חלקיקים על ידי התחשבות בעיקר באסטרטגיה של immobilization ליגנד כדי להשיג תכונות מיקוד אופטימליות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) הם שחקני מפתח בהקשר של מיקרו-סביבה של הגידול. למרות ירידה במספר בהשוואה לתאי הגידול, CAFs לווסת את התקדמות הגידול ולספק הגנה מפני חסינות antitumor. אסטרטגיות נגד נגדים מתפתחות שואפות לשפץ את המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אבלציה של CAFs פרו-גידוליגני או תכנות מחדש של פונקציות CAFs ומצב ההפעלה שלהם. גישה מבטיחה היא פיתוח של סוכני משלוח nanosized מסוגל למקד CAFs, ובכך לאפשר משלוח ספציפי של תרופות ומולקולות פעילות. בהקשר זה, מודל הסלולר של CAFs עשוי לספק כלי שימושי עבור הקרנת במבחנה וחקירה ראשונית של nanoformulations כאלה.
מחקר זה מתאר את הבידוד והתרבות של CAFs ראשוני מן המודל מורין 4T1 סינרגטי של סרטן שד טריפל שלילי. חרוזים מגנטיים שימשו בתהליך הפרדה דו-שלבי כדי לחלץ CAFs מגידולים מנותקים. בקרת אימונופנוטיפינג בוצעה באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר כל מעבר כדי לאמת את תשואת התהליך. CAFs מבודדים ניתן להשתמש כדי ללמוד את יכולת הפילוח של nanoformulations שונים שנועדו להתמודד עם microenvironment הגידול. ננו-חלקיקי H-פריטין שכותרתם פלואורסצנטית שימשו כננו-חלקיקים מועמדים כדי להקים את השיטה. חלקיקים, חשופים או מצומדים עם ליגנד מיקוד, נותחו עבור הכריכה שלהם CAFs. התוצאות מצביעות על כך ex vivo מיצוי של CAFs השד עשוי להיות מערכת שימושית כדי לבדוק ולאמת חלקיקים עבור מיקוד ספציפי של CAFs tumorigenic.

הגדרת מודל In vivo לבידוד CAFs אופטימלי הזרקת 105 תאי 4T1-luc לתוך כרית השומן המאמרי של עכברי BALB/c הנשי מוביל לצמיחה של מסת גידול לגילוי ב 5 ימים לאחר ההשתלה. על ידי מדידת נפח הגידול על ידי calipers ואת הכדאיות של תא הגידול על ידי BLI, גידול היה במעקב במשך חודש לאחר ההשתלה. כדי למצוא חלון הקרבה המתאים לבידוד CAFs, נדרשה פשרה אופטימלית בין גודל גידול גבוה יותר לבין BLI מצד אחד וכיב גידול מתפתח ונמק מצד שני (איור 1). כאשר ליבה נמקית מופיעה 20 יום לאחר ההשתלה, והיא גדלה ב-25 ו-30 יום (כפי שתועד בתמונות BLI באיור 1C),היום ה-20 הוגדר כנקודת הזמן לייעול החלמת התא לאחר תהליך הבידוד. גם לאחר הסרת כל האזורים הנמקיים הנראים לעין במהלך השלבים הראשונים של טיפול בגידול ex vivo, אחוז גבוה של תאים מתים נמצא בסוף הניתוק לתאים בודדים (טבלה 1). כמו אחוז זה עשוי להיות רלוונטי, במיוחד עם הגידול בגודל הגידול, הסרת תאים מתים הוא תמיד הכרחי בעת עבודה עם מודל 4T1.
אופטימיזציה של הליך בידוד CAFs, תרבות ואפיון נדרשים שני קטעים נוספים כדי לבודד את אוכלוסיית ה- CAFs (CD90.2+ CD45-) מלוח התאים הנאספים: דלדול הפיברובלסטים שאינם קשורים לגידול והעשרת פיברובלסטים הקשורים לגידול (איור 2). קוקטייל חרוזי הדלדול מסיר ביעילות CD45+ תאים (המהווה 67.35% ו-0.69% מכלל התאים לפני ואחרי הדלדול, בהתאמה, טבלה 2), ותמיד שימש לעיבוד גידול אחד בכל עמודה. כפי שמוצג בטבלה 1, מספר התאים האלוטים ירד מממוצע של 3 × 106 ל 1 × 105 לאחר שלב הדלדול. בשל ירידה מסיבית זו במספר התא הכולל, נוח לאגד את התאים שנאספו מלפחות 2 למקסימום של 4 גידולים בצינור אחד לפני שתמשיך בשלב העשרה. בכך, מספר מספיק של תאים הושג עבור דגירה עם חרוזים פיברובלסט הקשורים לגידול ועבר דרך עמודת הפרדה אחת כדי להשיג ממוצע סופי של 93% של CD90.2+ CD45- תאים(טבלה 2).
לאחר שנזרעו על לוחות תרבית הרקמות, תאים אלה התאוששו מחוברים לפלסטיק וחשפו מורפולוגיה גדולה בצורת ציר האופיינית לפיברובלסטים(איור 3A,B)ושונה מתאי הגידול 4T1(איור 3D). אי איגום גידולים לאחר דלדול גורם לתפוקה התאית עם חיידקי פיברובלסט הקשורים לגידול להיות נמוכה מדי כדי ליצור תרבות. במקרים אחרים, כאשר משך והטמפרטורה של הדגירה עם microbeads אינם נשמרים בקפידה, כמה כריכה לא ספציפית עלולה להתרחש. במקרים כאלה, שלבי ההעשרה היו פחות יעילים וגבוהים באחוזים של CD90.2- CD45+ ו- CD90.2- CD45- תאים נמצאו יחד עם CD90.2+ CAFs (5.97 ± 1.5 ו- 16.75 ± 1.1, בהתאמה) (איור 4 ולטבלה 3). תאים מזהמים אלה היו אחראים ככל הנראה לנוכחות בתרבות של שיבוטים קטנים עם מורפולוגיה שונה(איור 4B,ראשי חץ שחורים) שגדלו מהר יותר מ- CAFs וניצחו על תרבות CAF העיקרית(איור 4C). תוצאות תת-אופטימליות אלה אישרו את החשיבות של בדיקה כפולה תמיד הן של ביטוי CD90.2 והן CD45, כמו גם מורפולוגיה של תאים בסוף תהליך ההעשרה ובמהלך צמיחת התאים בתרבות.
שימוש בתאים מבודדים להערכת פוטנציאל פילוח CAF של ננו-דראגים מהונדסים CAFs מבודד טרי יכול לשמש עבור מספר יישומים החל מחקר בסיסי מחקרים פרמקולוגיים. המטרה של קבוצה זו היא לפתח ננו-ים HFn שיכולים למקד במיוחד CAFs. HFn תפקד עם שבר נוגדן ספציפי נגד FAP (HFn-FAP) בשני חלבונים שונים: יחסי נוגדנים (נמוך יותר 1:1 וגבוה יותר 1:5), והקשירה שלהם עם CAFs נבדקה. מכיוון ש-FAP שימש כסמן ביולוגי על פני השטח של CAFs פרו-גידוליים, היה בעל חשיבות בסיסית לבדוק את ביטוי ה-FAP על CAFs מבודדים (איור 3C). ביטוי FAP היה אחריו מעל 5 קטעים בתרבות כדי לאשר כי תרבות CAF העיקרית שמרה על המאפיינים המקוריים שלה.
פונקציונליזציה FAP על HFn נמצא לתרום לשינוי משמעותי לקראת פילוח CAF בהשוואה HFn חשוף, ואת הכמות הנמוכה יותר של נוגדן (1:1) היה מספיק כדי לצפות בהשפעה זו (איור 5A). עם זאת, זה לא נצפתה עם הגידול 4T1 תאים המשמשים כדי להגדיר את מודל הגידול in vivo, שבו HFn חשוף הראה כריכה גבוהה יותר מאשר HFn פונקציונלי (איור 5B). זה היה ככל הנראה בשל היעדר ביטוי יתר FAP בתאי 4T1 ואת האינטראקציה המועדפת של HFn עם TfR1, אשר מסדיר את ספיגת HFn בתאים, כפי שדווח בהרחבה על ידי קבוצה זו27,33. תוצאות אלה מאשרות את התועלת של שימוש בתרבויות ראשוניות של CAFs השד כדי לסנן מראש את יכולת הפילוח של חלקיקים שנועדו להתמודד עם microenvironment הגידול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> איור 1: הקמת מודל הגידול 4T1. תאים (105 תאים/עכבר) הוזרקו למשטח השומן של המאריים. גידול היה לאחר ימים 5, 10, 15, 20, 25, ו 30 לאחר ההשתלה (A) על ידי מדידת נפח הגידול עם calipers ו (B) על ידי הדמיה ביולומינציה. נפחי הגידול ו- BLI באים לידי ביטוי כמ"מ3 וסופר, בהתאמה. התוצאות מדווחות כממוצע ± SEM (n = 6). (C)תמונות מייצגות BLI התקבלו 5, 10, 15, 20, 25, ו 30 ימים לאחר השתלת התא לאשר צמיחת הגידול עד היום 25, כאשר נראה להגיע לרמה. בנקודת הניתוח האחרונה (30 יום), ה- BLI אינו גדל בהשוואה ליום 25. החל מיום 20, אזורים של נמק וכיב מתחילים להפוך גלויים בחלק המרכזי של הגידול. סולם צבעים: מינימום = 1,194, מקסימום = 20,462. קיצורים: BLI = הדמיית ביולומינציה; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> איור 2: הכנת דגימת גידול ואפיון ציטומטריית זרימה של CAFs מבודדים. גידולים נקטעו והופחתולחתיכותקטנות של כ 1-2 מ"מ בעזרת אזמל; (B)השעיית תא בודד לאחר עיכול רקמות וניתוק מכני של גידול מובא; (C)גלולה התא המתקבל לאחר תמותה של תאי דם אדומים; (D)ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי CD45 ו- CD90.2 בתאים שהושגו לאחר הסרת תאי דם אדומים ותאים מתים, (E) לאחר דלדול של פיברובלסטים שאינם קשורים לסרטן, ו -( F) לאחר העשרה של פיברובלסטים הקשורים לסרטן, שם רוב התאים הם CD90.2+ CD45- (מלבן כחול). קיצורים: CAFs = פיברובלסטים הקשורים לסרטן; CD = אשכול של בידול; PE-A = אזור של פיקוריתרין; FITC-A = אזורים של פלואורסין איזוטיווציאאנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> איור 3: ניתוח מורפולוגי של CAFs וביטוי FAP. (A, B)מורפולוגיה של CAFs נבדקה בכל מעברי התרבות על ידי מיקרוסקופיה אופטית (רמות שונות של מפגש במעבר 2 ומעבר 5) ובהשוואה לתאי גידול 4T1 (D) 4T1; סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C)ביטוי חלבון הפעלה פיברובלסט (FAP) הוערך על ידי ציטומטריית זרימה בסוף תהליך הבידוד על CD90.2+ CD45 שנאסףכדי לאשר את המאפיינים המולקולריים שלהם. סף פלואורסצנטיות נקבע בתאי בקרה לא מזוהמים (גרף אדום) כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת ואת אחוז התאים החיוביים (FAP+) בקרב תאים מוכתמים בנוגדנים (גרף כחול). קיצורים: CAFs = פיברובלסטים הקשורים לסרטן; FAP = חלבון הפעלה פיברובלסט; CD = אשכול של בידול; MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת; Ab = נוגדן; FITC-A = אזור פלואורסצין איזוטיווציאאנט; FAP+ = תאים חיוביים ל- FAP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> איור 4: דוגמה לתהליך בידוד CAFs תת-אופטימלי. (A)הערכת ציטומטריית זרימה לאחר שלב הבידוד הסופי חשפה את נוכחותם של CD90.2 מזהמים- CD45+ ו- CD90.2- CD45- תאים. (B)תאים אלה יכולים להיראות כשיבוטים עם מורפולוגיה עגולה קטנה עם זריעה (ראשי חץ שחורים וחדירה בפינה השמאלית התחתונה של הלוח) כי (C) גבר על CAFs לאחר הקטע השלישי בתרבות. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: CAF = פיברובלסט הקשור לסרטן; CD = אשכול של בידול; PE-A = אזור של פיקוריתרין; FITC-A = אזורים של פלואורסין איזוטיווציאאנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> איור 5: כריכת ננו-ים של HFN על CAFs ו-4T1. ננו-גנים של HFN סומנו באופן פלואורסצנטי עם FITC, פונקציונליו עם שבר נוגדן נגד FAP (HFn-FAP) בשני יחסי חלבון-נוגדנים שונים (1:1 ו-1:5), ודגרו עם(A)CAFs יעד ו (B) 4T1 תאים ב 4 °C (2 שעות). כריכה הוערכה על ידי ציטומטריית זרימה. (A)כריכת HFn-FAP עם CAFs גדלה באופן משמעותי בשני ריכוזי שברי הנוגדנים פי שלושה בהשוואה ל- HFn החשוף. (B) לעומת זאת, כריכה גבוהה משמעותית של HFn חשוף נצפתה בתאי 4T1, שם הכריכה אינה משופרת על ידי זיהוי FAP. התוצאות מדווחות כסטיית תקן ממוצעת ± של שלושה ניסויים עצמאיים. p = 0.0003; °° p = 0.0021 ; °°° p = 0.0008. קיצורים: CAFs = פיברובלסטים הקשורים לסרטן; FAP = חלבון הפעלה פיברובלסט; HFn = גרסה רקומביננטית של שרשרת כבדה פריטין אנושי המשמש ננו-חלקיק חשוף או מצומד; HFN-FAP = חלקיקי HFN פונקציונליים עם החלק המשתנה של נוגדן נגד FAP שהוכן בשני יחסי HFn:Fab@FAP טוחנת, 1:1 ו- 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>מספר תא (ממוצע ± SD)</td>
			<td>סה"כ תפוקת מיצוי (לכל מעבר)</td>
		</tr>
<tr>
<td>גידול מובא (לאחר הסרת תאי דם אדומים)</td>
			<td>1.27 x 108 ± 9.81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>גידול מובא (לאחר הסרת תאים מתים)</td>
			<td>3.01 x 106 ± 9.61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>קוקטייל לאחר דלדול</td>
			<td>1.15 x 105 ± 4.95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>לאחר העשרה</td>
			<td>3.00 x 104 ± 1.2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ספירת תאים כוללת לאחר כל שלב של בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>התפלגות תאים (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>גידול מובא (לאחר הסרת תאים מתים)</td>
			<td>1.81 ± 0.98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>קוקטייל לאחר דלדול</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0.14 ± 0.13</td>
			<td>0.55 ± 0.63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>לאחר העשרה</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0.09 ± 0.1</td>
			<td>0.09 ± 0.08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: הפצת תאים על פי ביטוי של CD90.2 ו- CD45 לאחר כל מעבר של בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>התפלגות תאים (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>לאחר העשרה (ללא איגום)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1.49 ± 0.4</td>
			<td>5.97 ± 1.5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: CD90.2 ו- CD45 ביטוי של תאים שנאספו לאחר ניסוי בידוד פיברובלסט הקשור לסרטן תת-אופטימלי.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

מאמר זה נועד לספק פרוטוקול לבידוד ותרבות של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן שד טריפל שלילי ויישומה למחקר פרה-אקליני של חלקיקים חדשניים שנועדו למקד את המיקרו-סביבה של הגידול.

בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן השד לחקר חלקיקים ממוקדים

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

פרוטוקול זה מאפשר לבודד בהצלחה ותרבות סרטן ראשוני הקשורים פיברובלסטים מסרטן השד מורין, כדי לסנן חלקיקים חדשניים שנועדו למקד את הסביבה מיקרו הגידול. CAF ראשוני מייצג את המודל האמין והפיזיולוגי ביותר למחקרי במבחנה של סטרומה הגידול. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד להשיג תשואה אופטימלית.כדי להתחיל, להכין תערובת עיכול עבור ניתוק הגידול, ולהשרות את רסיסי הגידול שלושה עד חמישה מילימטר בתמיסה לאחר סגירת הצינור בחוזקה. הפוך את הצינור, בודק שכל חתיכות הגידול נמצאות בתחתית הצינור לכיוון הכובע. לאחר מכן חברו את הצינור לדיסוציאר מכני בדיור הנכון, והפעילו תוכנית דיסוציאציה שתוכננה במיוחד לגידולים קשים.לאחר הריצה, לנתק את הצינור, ומניחים אותו הפוך כדי לדגור על המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות עם רועד עדין. לאחר מכן לחבר מחדש את הצינור לדיסוציאר בדיור הנכון, ולהפעיל את תוכנית הניתוק עבור גידולים קשים פעמיים, להבטיח לא חתיכות רקמות גדולות להישאר בסוף ההליך. סנן את הדגימה באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרון בצינור 50 מיליליטר.לאחר מכן לשטוף את המסנן עם 10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, resuspened הכדור במאגר PBE, המורכב PBS, 0.5% BSA, ושני EDTA מילימטרי, ולספור את התאים עם טריפאן כחול. תקן את מאגר כריכת הסרת התא המת על-ידי דילול תמיסה של מאגר חיץ מחייב 20X במים סטריליים מזוקקים כפולים.לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של חוצץ מחייב 1X וצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה התא עם 0.1 מיליליטר של חיידקים להסרת תאים מתים עבור עד 10 עד התאים השביעי, ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. במהלך הדגירה, הכינו מעמד מגנטי מתחת למכסה המנוע, ותלו עליו עמודי הפרדה פרומגנטיים, כשהקצוות מצביעים כלפי מטה.ישילב את העמודים עם 0.5 מיליליטר של חוצץ כריכה קרה, ולחכות עד הפתרון זרם דרך. לאחר הדגירה, להוסיף 400 microliters של חוצץ כריכה קר חרוזים השעיית התא. לטעון את כל הנפח על העמוד ולאסוף את השפכים בצינור 15 מיליליטר.לשטוף את העמודה ארבע פעמים עם 0.5 מיליליטר של חוצץ כריכה קרה, ולאסוף את השפכים הכולל באותו צינור. עבור דלדול של פיברובלסטים שאינם קשורים לסרטן, לסנן את השעיית התא באמצעות מסננת תאים 70 מיקרון לח עם PBS, וצנטריפוגה התאים. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 80 microliters של חוצץ PBE קר.הוסיפו 20 מיקרוליטרים של קוקטייל דלדול פיברובלסט שאינו קשור לגידול. מערבבים היטב, ודגרים את המדגם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בחושך. במהלך הדגירה עם חרוזים, להכין עמודי דלדול פרומגנטיים על מעמד מגנטי.ישיאב את העמודים עם שני מיליליטר של חוצץ PBE קר ולחכות עד הפתרון זרם דרך. לאחר הדגירה, להוסיף 400 microliters של חוצץ חרוזים השעיית התא. לטעון את כל הנפח על העמוד ולאסוף את השפכים בצינור 15 מיליליטר.לשטוף את הטור פעמיים עם שני מיליליטר של PBE. אסוף את השפכים הכוללים לאותה שפופרת, וצנטריפוגה של השפכים. עבור הבחירה החיובית של פיברובלסטים הקשורים לסרטן, resuspend הכדור ב 80 microliters של חוצץ PBE קר.ואז ב-20 מיקרוליטרים של חיידקי פיברובלסטים הקשורים לגידול, ודגרת הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך. במהלך הדגירה, להכין עמודות הפרדה פרומגנטית על מעמד מגנטי ולתוות אותם עם 0.5 מיליליטר של חוצץ PBE קר. לאחר הדגירה, להוסיף 400 microliters של PBE חרוזים השעיית התא.טען את כל הנפח על העמוד, ותן לתאים ללא תווית לזרום לתוך צינור 15 מיליליטר. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של חוצץ PBE, ולאסוף את השפכים הכוללים באותה שפופרת. הסר את העמודה מהמגנט והצב אותו בצינור 1.5 מיליליטר.הוסף מיליליטר אחד של PBE על העמודה, ומיד לדחוף את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים החוצה. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה התא בנפח מתאים של DMEM, ולזרוע את התאים בצלחת תרבית רקמות. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ, והניח את הלוח על 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לתאים לדבוק ולגדול.הזרקת תאי לוציפראז 4T1 לתוך כרית השומן המאמרי של עכברים נקבות הובילה לצמיחה של מסת גידול לגילוי חמישה ימים לאחר ההשתלה. כדי למצוא חלון הקרבה המתאים לבידוד CAF, נדרשה פשרה אופטימלית בין גודל גידול גבוה יותר לבין הדמיית ביו-לומינציה מצד אחד, לבין כיב גידולים ונמקים מחד. היום ה-20 הוגדר כנקודת הזמן לייעל את התאוששות התאים, לאחר תהליך הבידוד.נדרשו שני מעברים נוספים כדי לבודד את אוכלוסיית ה- CAFs, מלוח התאים המעשיים שנאספו, דלדול הפיברובלסטים הקשורים לגידול, והעשרת הפיברובלסטים הקשורים לגידול. תאי CAF חשפו מורפולוגיה גדולה בצורת ציר, אופייני לפיברובלסטים, והיו שונים מתאי גידול 4T1. ביטוי FAP בעקבות חמישה קטעים מאשרים כי תרבות CAF העיקרית שמרה על המאפיינים המקוריים שלה.כאשר משך והטמפרטורה של הדגירה עם חיידקים לא נשמרו, שיבוטים עם מורפולוגיה שונה נמצאו בין התרבות המבודדת. תאים מזהמים אלה גדלו מהר יותר וניצחו על תרבות CAF העיקרית. CAFs מחייב עם אדם פריטין Hfn-FAP פונקציונלית ננו תרופה גדל באחד לאחד, וריכוזי שבר נוגדנים אחד עד חמש על ידי פי שלושה, לעומת HFN חשוף.להיפך, עבור גידול 4T1 תאים, HFN חשוף הראה כריכה גבוהה יותר מאשר HFN פונקציונלי. כדי להגדיל את טומאת התשואה של CAF מבודד, לשמור על חוצצים קרים, לכבד את זמן הדגירה עם חרוזים, ולמשוך עד ארבעה גידולים לכל עמודה לפני שלב העשרה הסופי. CAFs מבודד יכול לשמש כדי לסנן מספר תרופות ננו מועמד במונחים של כריכה, ספיגה, ויעילות פרמקולוגית לפני שתמשיך עם ניסויים פרה-קליניים ב vivo.בידוד CAF אפשר לנו לבדוק אם חלקיקים יכולים לשמש כדי למקד את microenvironment הגידול. ובכך לסלול את הדרך לטיפולים ממוקדים חדשים העובדים בסינרגיה עם כימותרפיה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

יעילות אנטי סרטנית של טיפול פוטודינמי עם ריאות חלקיקים סרטן ממוקד

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

קרצינומה תא syngeneic עכבר הדגם של גרורתי כליות עבור הערכה כמותית אורך ורוחב של טיפולים פרה-קליניים

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

דגם העכבר סרטן הלבלב Syngeneic ללמוד את השפעות בלתי הפיכות אלקטרופורציה

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic השתלת ריאות Syngeneic תאים אדנוקרצינומה ללמוד ביטוי PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...