Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
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इस अध्ययन को आईजी 2017-आईडी के तहत एसोसियाज़िओन इटालियाना प्रति ला राइसर्का सुल कैन्रो (एआईआरसी) द्वारा समर्थित किया गया था। 20172 परियोजना - पी कोर्सी फैबियो। एसएम बाल चिकित्सा नैदानिक अनुसंधान केंद्र "रोमियो और एनरिका Invernizzi" है कि उसकी स्थिति का समर्थन करता है स्वीकार करते हैं । एबी धन्यवाद एआईआरसी (आईडी 20172 परियोजना) और अनुसंधान फैलोशिप के लिए मिलान विश्वविद्यालय। एलएस और एमएस पोस्टडॉक्टोरल और डॉक्टरेट फैलोशिप मिलान विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित हैं।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

CAFs एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स को फिर से तैयार करने, मेटास्टेसिस प्रगति को बढ़ावा देने, और ट्यूमर साइट34के लिए दवा का उपयोग सीमित करने में प्रमुख खिलाड़ियों के रूप में उभर रहे हैं। हालांकि, उनकी विषमता के कारण, उनकी भूमिकाएं अभी भी विवादास्पद हैं-कुछ सीएएफ ट्यूमरजेनिक हैं, जबकि कुछ अन्य उपप्रकारों में ट्यूमर-दमनकारी भूमिका है। इस संदर्भ में, कैंसर की प्रगति में उनकी बहुचर्चित भूमिका पर अधिक प्रकाश डालने के लिए उनका अलगाव अत्यधिक रुचि हो सकता है, जिसके महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थहोंगे 12,31। इसके अलावा, मानव और पूर्व नैदानिक माउस ट्यूमर मॉडल से सफल सीएएफ निष्कर्षण भी नए सीएएफ-लक्ष्यीकरण दवाओं के विकास की सुविधा होगी । यह पेपर स्तन कैंसर के सिनेजेनिक प्रीक्लीनिकल मॉडल से प्राथमिक सीएएफ को कुशलतापूर्वक अलग-थलग करने और संस्कृति देने की विधि की रिपोर्ट करता है। अनुभव के आधार पर, तीन प्रयोगात्मक कदम ज्यादातर प्रोटोकॉल की सफलता को प्रभावित करते हैं।
पहला कॉलम में थक्के के जोखिम से जुड़े सेल निलंबन के एकत्रीकरण से बचने के लिए तेजी से काम कर रहा है और कोशिका प्रभाव को धीमा कर रहा है: वास्तव में, जब कॉलम के माध्यम से पारित कोशिकाओं को एक साथ क्लस्टर किया गया था, तो उप-इष्टतम अलगाव प्रक्रिया की संभावना बढ़ गई, और अंतिम संस्कृतियों में "संदूषक" सेल क्लोन शामिल थे। दूसरा एक अंतिम संवर्धन चरण में पारित होने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं की गारंटी के लिए पर्याप्त कोशिकाओं की गारंटी के बाद विभिन्न ट्यूमर से कोशिकाओं को पूलिंग है। अंतिम महत्वपूर्ण मुद्दा उच्च कोशिका घनत्व पर निकाले गए कोशिकाओं को चढ़ाना है, सबसे अधिक संभावना 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं से शुरू करने के लिए सेल विकास और 4-5 मार्ग तक के लिए कॉलोनी विस्तार को बढ़ावा देने के लिए । यदि कोशिकाओं को कम घनत्व पर वरीयता दी गई थी, तो वे मुक्त सतह पर विस्तारित हुए और जल्दी से नकल करना बंद कर दिया।
कई अध्ययनों से पहले से ही दोनों मानव और माउस मूल के सीएएफ निष्कर्षण तरीकों का वर्णन किया है, कैंसर के विकास और आक्रामकता को बढ़ावा देने में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए । यह स्तन कैंसर, मेलानोमा, कोलंगियोकार्सिनोमा, और अग्नाशय एडेनोकार्सिनोमा35, 36,37,38सहित कई प्रकार के ट्यूमर में किया गया है। हालांकि, विशिष्ट सीएएफ मार्कर की कमी और उनकी विषमता के कारण, इन प्रक्रियाओं के परिणाम अभी भी उप-इष्टतम हैं।
यहां, अलग-थलग कोशिकाओं का उपयोग एचएफएन नैनोकेज की सीएएफ-टार्गेटिंग क्षमता को मान्य करने के लिए किया जाता था, जो एंटी-एफएपी लक्षित मोइयटीज के साथ कार्यात्मक होता था। सीएएफ की प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग एक महत्वपूर्ण लाभ था, जिससे नैनोड्रग अनुकूलन के इस प्रारंभिक चरण में वीवो में सीधे करने की तुलना में बहुत सरल और लागत प्रभावी बाध्यकारी प्रयोग के साथ नैनोस्ट्रैटर्जी एक्स वीवो के सत्यापन की अनुमति मिली।
इस अर्थ में, सीएएफ पर पूर्व वीवो परीक्षण सीएएफ के इष्टतम लक्ष्यीकरण के लिए सबसे होनहार नैनोकणों की स्क्रीनिंग और चयन की अनुमति देकर वीवो पशु प्रयोगों में पहले हो सकता है। यहां प्रस्तुत सीएएफ मॉडल का उपयोग प्रारंभिक प्रभावकारिता अध्ययनों के लिए भी किया जा सकता है, जब सक्रिय दवाओं के साथ नैनोकणों को लोड किया जाता है। जानवरों का उपयोग केवल बाद में बायोडिलिएब्यूशन, फार्माकोकाइनेटिक्स और प्रभावकारिता अध्ययनों का मूल्यांकन करने के लिए किया जाएगा।
कई सीएएफ-लक्षित नैनोड्रग विकसित किए जा रहे हैं, जैसे स्तन कैंसर में फोटोडायनामिक थेरेपी के लिए फेरिटिन नैनोकेज और प्रोस्टेट कैंसर मॉडल39,40में डॉक्सोरुबिसिन देने के लिए पेप्टाइड आधारित कण। हालांकि, नैनोड्रग अनुकूलन के लिए सेल प्लेटफॉर्म के रूप में सीएएफ के अलगाव पर कई अध्ययनों ने ध्यान केंद्रित नहीं किया है।
इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह एक समय लेने वाला प्रोटोकॉल है, जिसमें कई अभिकर् ती और सामग्रियों की तैयारी और खरीद की आवश्यकता होती है। दूसरा, 4T1 ब्रेस्ट ट्यूमर में सीएएफ की कमी के कारण उनकी पैदावार कम होती है । नैनोपार्टिकल प्रयोगों की योजना बनाई जानी चाहिए और जैसे ही आवश्यक सेल नंबर प्राप्त किया जाता है, जैसे ही प्राथमिक CAFs सेनेसेंस से गुजरते हैं और लंबे समय तक संस्कृति में बनाए नहीं रखा जा सकता है। अंत में, सीएएफ अलगाव, खेती और लक्षण वर्णन की यह विधि कैंसर के खिलाफ लड़ाई में नए लक्षित नैनोमेडिसिनों के विकास में तेजी लाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकती है।

पिछले दशकों के दौरान, यह स्पष्ट हो गया है कि ट्यूमर कोशिकाओं को मारना आमतौर पर द्रोह को समाप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं होता है, क्योंकि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट ट्यूमर को पतन और चिकित्सीय प्रतिरोध1,2को प्रेरित कर सकता है। एक उपन्यास प्रतिमान तो उभरा है: ट्यूमर स्ट्रोमा को लक्षित करने के लिए सहायक कारकों के ट्यूमर से वंचित है और इस तरह,कीमोथैरेपी3,4,5की प्रभावकारिता को बढ़ावा देने । विशेष रूप से, कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) कई ठोस ट्यूमर6, 7में एक दिलचस्पस्ट्रोमललक्ष्य हैं। सीएसीएफ कोशिकाओं का एक बहुत ही विषम समूह है जो विकास कारकों, साइटोकिन्स और केमोकिन्स के स्राव के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रणाली की कैंसर कोशिकाओं और कोशिकाओं के साथ बातचीत करता है; निर्माण और बाहेल मैट्रिक्स को फिर से तैयार करें; और मेटास्टेसिस फॉर्मेशन8, 9,10,11,12 ट्यूमर प्रकार के आधार पर, सीएएफ प्रो-ट्यूमरजेनिक कार्य दिखाते हैं, जबकि सीएएफ के अन्य उपप्रकारों में ट्यूमर-दमनकारी कार्य13,14लगते हैं। इस विरोधाभास को बेहतर ी से स्पष्ट करने के लिए, प्राथमिक और मेटास्टैटिक ट्यूमर से सीएएफ का पूरी तरह से लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण है।
इस संदर्भ में, अनुसंधान के एक उभरते क्षेत्र ने ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट 15 , 16 ,17,18,18को फिर से तैयार करने में सक्षम सक्रिय अणुओं और दवाओं को वितरित करके सीएएफ को लक्षित करने और/या नष्ट करने के लिए डिज़ाइन किए गए नैनोसाइज्ड एजेंटों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है । साइटोटॉक्सिक दवाओं द्वारा सीएएफ एब्लेशन प्राप्त करने, सीएएफ-लक्षित फोटोडायनामिक थेरेपी को प्रेरित करने, या सीएएफ को एक क्विसेंट राज्य में वापस लाने या टीएनएफ से संबंधित एपोप्टोसिस प्रेरित लिगांड अभिव्यक्ति को प्रेरित करके सीएएफ एब्लेशन प्राप्त करने के लिए कई प्रकार के नैनोकणों को डिजाइन किया गया है, जो पड़ोसी कैंसर कोशिकाओं16, 19के एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है। इसके अलावा, सक्रिय रूप से विशिष्ट जैविक मार्कर को लक्षित करने के लिए कई नैनोकणों की क्षमता सीएएफ सबसेट का चयन करने के लिए लक्ष्य की आशा को जंम देता है । हालांकि सीएएफ के लिए इसकी पूर्ण विशिष्टता पर अभी भी सवाल उठाया जाता है, फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन प्रोटीन (एफएपी) प्रो-ट्यूमरजेनिक स्ट्रोमा के सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक है और नैनोड्रग डिलीवरी चलाने के लिए शोषण किया जाता है, इस प्रकार सीएएफ-लक्षित नैनोथेरेप्यूटिक्स20,21,22के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त होता है।
यह पेपर मुरीन स्तन कैंसर के एक सिनेजेनिक मॉडल से प्राथमिक सीएएफ के अलगाव का वर्णन करता है और सीएएफ मार्कर, एफएपी को पहचानने के लिए इंजीनियर नैनोकणों की लक्षित क्षमता के अध्ययन में उनके उपयोग की रिपोर्ट करता है। फेरिटिन नैनोकेज का उपयोग विधि स्थापित करने के लिए उम्मीदवार नैनोसिस्टम के रूप में किया जाता है, क्योंकि वितरण की उनकी विशिष्टताको 23, 24को लक्षित करने के सतह जोखिम से आकार दिया जा सकता है। इसके अलावा, फेरिटिन को एंटीट्यूमर अनुप्रयोगों के लिए उत्कृष्ट जैव संगत शटल के रूप में सफलतापूर्वक साबित किया गया है, जिससे ट्यूमरद्रव्यमान25, 26,27में पेलोड के तेजी से संचय को ट्रिगर कियागयाहै। आज तक, सीएएफ-टार्गेटिंग नैनोसिस्टम्स के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों पर विट्रो परीक्षण में शामिल किया है, जो कोशिका सक्रियण को प्रेरित करने के लिए विकास कारक-बीटा को बदलने के साथ संस्कृति में उत्तेजित है और सीएएफ28,29की कुछ इम्यूनोफेनोटिक विशेषताओं की अभिव्यक्ति है। यह विधि आमतौर पर अमर कोशिका लाइनों (जैसे NIH3T3, LX-2) पर लागू होती है और यह काफी तेजी से और सरल होती है, जो कुछ घंटों या दिनों में सक्रिय कोशिकाओं को उत्पीड करती है। एक सीमा यह है कि हालांकि इन विट्रो उत्तेजना कुछ जीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय myofibroblasts के लिए जिम्मेदार ठहराया प्रेरित करती है, यह पूरी तरह से वास्तविक CAFs की सभी जैविक विशेषताओं, विशेष रूप से वीवो मेंउनकी विषमता को फिर से नहीं बदल सकता है।
एक अन्य रणनीति में मानव या माउस ट्यूमर के नमूनों से प्राथमिक सीयूएफ निकालना शामिल है30,31. यह सुनिश्चित करता है कि सीएएफ सक्रियण एक शारीरिक संदर्भ में होता है, और सीएएफ उपजनसंख्या की विषमता को बनाए रखा जाता है। अनुसंधान उद्देश्य के अनुसार, CAFs विभिन्न स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार सबसे विश्वसनीय स्थिति का अध्ययन करने की संभावना की पेशकश की । प्रोटोकॉल यहां रिपोर्ट वैज्ञानिकों जो एक murine स्तन कैंसर मॉडल से CAFs लक्ष्य डिजाइन उपन्यास नैनोकणों की कार्यक्षमता का प्रारंभिक मूल्यांकन करने की तलाश के लिए मूल्यवान होगा । अलग CAFs उन नैनोकणों कि काफी वादा कर रहे है कैंसर के पशु मॉडल में वीवो मूल्यांकन में आगे बढ़ने की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी होगा । यह नैनोपार्टिकल उत्पादन के पहले चरणों के दौरान प्रासंगिक होगा, मुख्य रूप से इष्टतम लक्ष्यीकरण गुणों को प्राप्त करने के लिए लिगांड स्थिरीकरण की रणनीति पर विचार करके नैनोकणों को नैनोपार्टिकल डिजाइन के शोधन की ओर चलाना।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के संदर्भ में प्रमुख अभिनेता हैं। ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में संख्या में कम होने के बावजूद, CAFs ट्यूमर प्रगति को विनियमित और एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा से सुरक्षा प्रदान करते हैं । उभरती कैंसर रोधी रणनीतियों का उद्देश्य ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को प्रो-ट्यूमरजेनिक सीएएफ या सीएएफ कार्यों के पुनर्प्रोग्रामिंग और उनकी सक्रियण स्थिति के एब्लेशन के माध्यम से फिर से तैयार करना है। एक आशाजनक दृष्टिकोण नैनोसाइज्ड डिलीवरी एजेंटों का विकास है जो सीएएफ को लक्षित करने में सक्षम हैं, इस प्रकार दवाओं और सक्रिय अणुओं के विशिष्ट वितरण की अनुमति देते हैं। इस संदर्भ में, सीएएफ का एक सेलुलर मॉडल इन विट्रो स्क्रीनिंग और ऐसे नैनोफॉर्मेशन की प्रारंभिक जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है।
इस अध्ययन में ट्रिपल-निगेटिव ब्रेस्ट कैंसर के सिनेजेनिक 4T1 मुरीन मॉडल से प्राइमरी सीएएफ के अलगाव और संस्कृति का वर्णन किया गया है । चुंबकीय मोतियों का उपयोग 2-चरण की पृथक्करण प्रक्रिया में अलग ट्यूमर से सीएएफ निकालने के लिए किया गया था। प्रक्रिया उपज को सत्यापित करने के लिए प्रत्येक मार्ग के बाद प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके इम्यूनोफेनोटाइपिंग नियंत्रण किया गया था। ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट से निपटने के लिए डिज़ाइन किए गए विभिन्न नैनोफॉर्मुलेशन की लक्षित क्षमता का अध्ययन करने के लिए अलग-थलग सीएएफ को नियोजित किया जा सकता है। फ्लोरोसेंटली लेबल एच-फेरिटिन नैनोकेज को विधि स्थापित करने के लिए उम्मीदवार नैनोकणों के रूप में इस्तेमाल किया गया था। नैनोकणों, या तो नंगे या एक लक्ष्यीकरण ligand के साथ संयुग्मित, CAFs के लिए उनके बाध्यकारी के लिए विश्लेषण किया गया । परिणाम बताते हैं कि स्तन सीएएफ का पूर्व वीवो निष्कर्षण ट्यूमरजेनिक सीएएफ के विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए नैनोकणों का परीक्षण और सत्यापन करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली हो सकती है।

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Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

इस पत्र का उद्देश्य ट्रिपल-निगेटिव स्तन कैंसर के सिंजेनिक मुरीन मॉडल से प्राथमिक कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास नैनोकणों के प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए उनके आवेदन का उद्देश्य है।

लक्षित नैनोकणों के अध्ययन के लिए स्तन कैंसर के सिंजेनिक मुरीन मॉडल से प्राथमिक कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

यह प्रोटोकॉल ट्यूमर माइक्रो पर्यावरण को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास नैनोकणों को स्क्रीन करने के लिए, मुरिन स्तन कैंसर से प्राथमिक कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट को सफलतापूर्वक अलग और संस्कृति देना संभव बनाता है। प्राथमिक सीएएफ ट्यूमर स्ट्रोमा के इन विट्रो अध्ययनों के लिए सबसे विश्वसनीय और शारीरिक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक इष्टतम उपज को प्राप्त करने का वर्णन करते हैं।शुरू करने के लिए, ट्यूमर वियोजन के लिए एक पाचन मिश्रण तैयार करें, और ट्यूब को कसकर बंद करने के बाद समाधान में तीन से पांच मिलीमीटर ट्यूमर के टुकड़ों को सोख लें। ट्यूब को उल्टा करें, यह जांचें कि ट्यूमर के सभी टुकड़े ट्यूब के नीचे टोपी की ओर हैं। फिर उचित आवास में एक यांत्रिक विघटन करने के लिए ट्यूब देते हैं, और विशेष रूप से कठिन ट्यूमर के लिए डिज़ाइन किए गए एक वियोजन कार्यक्रम चलाते हैं।चलाने के बाद, ट्यूब को अलग करें, और कोमल मिलाते हुए 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना को इनक्यूबेट करने के लिए इसे उल्टा रखें। फिर उचित आवास में डिसोलिएटर के लिए ट्यूब को फिर से संलग्न करें, और दो बार कठिन ट्यूमर के लिए वियोजन कार्यक्रम चलाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई बड़े ऊतक टुकड़े प्रक्रिया के अंत में बने रहें। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से नमूना फ़िल्टर करें।इसके बाद 10 मिलीलीटर आरपीएमआई 1640 मीडियम और सेंट्रलाइज से फिल्टर धोएं। अपकेंद्रित्र के बाद, पीबीएस, 0.5% बीएसए, और दो मिलीमोलर ईडीटीए से बना पीबीई बफर में गोली को फिर से खर्च करें, और ट्राइपैन ब्लू के साथ कोशिकाओं की गणना करें। बाँझ डबल आसुत पानी के साथ 20X बाध्यकारी बफर स्टॉक समाधान को कमजोर करके मृत सेल हटाने बाध्यकारी बफर की मरम्मत करें।कोशिकाओं को 1X बाध्यकारी बफर और अपकेंद्रित्र के पांच मिलीलीटर से धोएं। अपकेंद्रित्रीकरण के बाद, कोशिका गोली को मृत कोशिका हटाने के माइक्रोमोतियों के 0.1 मिलीलीटर के साथ सातवीं कोशिकाओं तक 10 तक पुनर्सीमित करें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, हुड के नीचे एक चुंबकीय स्टैंड तैयार करें, और इसमें फेरोमैग्नेटिक पृथक्करण स्तंभों को लटकाएं, सुझावों के साथ नीचे की ओर इशारा करते हुए।ठंडे बाध्यकारी बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ स्तंभों को बराबर करें, और समाधान के माध्यम से बहने तक प्रतीक्षा करें। इनक्यूबेशन के बाद, मनका और सेल निलंबन के लिए कोल्ड बाइंडिंग बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। कॉलम पर पूरी मात्रा लोड और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह इकट्ठा।कॉलम को 0.5 मिलीलीटर कोल्ड बाइंडिंग बफर के साथ चार बार धोएं, और एक ही ट्यूब में कुल प्रवाह एकत्र करें। गैर-कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की कमी के लिए, पीबीएस के साथ गीले 70 माइक्रोन सेल छन्नी का उपयोग करके सेल निलंबन को फ़िल्टर करें, और कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट निकालें और कोल्ड पीबीई बफर के 80 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।गैर ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट कमी कॉकटेल के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं, और अंधेरे में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें। मोतियों के साथ इनक्यूबेशन के दौरान, एक चुंबकीय स्टैंड पर फेरोमैग्नेटिक घट स्तंभ तैयार करें।ठंडे PBE बफर के दो मिलीलीटर के साथ स्तंभों को इक्विलिब्रेट करें और समाधान के माध्यम से बहने तक प्रतीक्षा करें। इनक्यूबेशन के बाद, मनका और सेल निलंबन में बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। कॉलम पर पूरी मात्रा लोड और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह इकट्ठा।पीबीई के दो मिलीलीटर के साथ कॉलम को दो बार धोएं। एक ही ट्यूब में कुल प्रवाह ले लीजिए, और प्रवाह अपकेंद्रित्र । कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के सकारात्मक चयन के लिए, कोल्ड पीबीई बफर के 80 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।फिर ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट माइक्रोमोतियों के 20 माइक्रोलीटर पर, और अंधेरे में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के दौरान, एक चुंबकीय स्टैंड पर फेरोमैग्नेटिक पृथक्करण स्तंभ तैयार करें और उन्हें 0.5 मिलीलीटर ठंडे पीबीई बफर के साथ बराबर करें। इनक्यूबेशन बाद, पीबीई के 400 माइक्रोलीटर को मनका और सेल निलंबन में जोड़ें।कॉलम पर पूरी मात्रा लोड करें, और अवेलेबल कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाहित होने दें। स्तंभ को 0.5 मिलीलीटर पीबीई बफर के साथ तीन बार धोएं, और एक ही ट्यूब में कुल प्रवाह एकत्र करें। चुंबक से कॉलम निकालें और इसे 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें।कॉलम पर PBE के एक मिलीलीटर जोड़ें, और तुरंत कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए स्तंभ में प्लंजर धक्का । अपकेंद्रित्र के बाद, डीएमईएम की उचित मात्रा में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें, और कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति प्लेट में बीज करें। एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल घनत्व की जांच करें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली जगह है, और 5% कार्बन डाइऑक्साइड कोशिकाओं का पालन करने और बढ़ने की अनुमति देने के लिए ।महिला चूहों के स्तन वसा पैड में 4T1 लूसिफ़ेरेस कोशिकाओं के इंजेक्शन प्रत्यारोपण के पांच दिन बाद एक पता लगाने योग्य ट्यूमर द्रव्यमान के विकास के लिए नेतृत्व किया । सीएएफ अलगाव के लिए पर्याप्त एक बलिदान खिड़की खोजने के लिए, एक तरफ उच्च ट्यूमर आकार और बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के बीच एक इष्टतम समझौता की मांग की गई थी, और दूसरी ओर एक उभरते ट्यूमर अल्सर और परिगलन। दिन 20 अलगाव की प्रक्रिया के बाद सेल वसूली का अनुकूलन करने के लिए समय बिंदु के रूप में निर्धारित किया गया था ।एकत्र व्यवहार्य कोशिकाओं के पैनल से, गैर ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की कमी, और ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के संवर्धन के लिए सीएएफ की आबादी को अलग करने के लिए दो और मार्ग की आवश्यकता थी। सीएएफ कोशिकाओं ने बड़े धुरी के आकार की आकृति विज्ञान का खुलासा किया, जो फाइब्रोब्लास्ट के विशिष्ट थे, और 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं से अलग थे। पांच मार्गों पर पीछा किया FAP अभिव्यक्ति की पुष्टि करते है कि प्राथमिक सीएएफ संस्कृति अपनी मूल विशेषताओं को बनाए रखा ।जब माइक्रोमोतियों के साथ ऊष्मायनों की अवधि और तापमान को बनाए नहीं रखा गया था, तो अलग-अलग संस्कृति के बीच विभिन्न आकृति विज्ञान के साथ क्लोन पाए गए थे। ये संदूषक कोशिकाएं तेजी से बढ़ी और प्राथमिक सीएएफ संस्कृति पर हावी हो गईं। मानव फेरिटिन एचएफएन-एफएपी के साथ बाध्यकारी CAFs कार्यात्मक नैनो दवा एक-से-एक में वृद्धि हुई है, और नंगे एचएफएन की तुलना में एक से पांच एंटीबॉडी टुकड़े तीन गुना तक सांद्रता ।इसके विपरीत, ट्यूमर 4T1 कोशिकाओं के लिए, नंगे एचएफएन कार्यात्मक एचएफएन की तुलना में उच्च बाध्यकारी दिखाया । अलग सीएएफ की उपज अशुद्धता बढ़ाने के लिए, बफ़र्स ठंडा रखने के लिए, मोतियों के साथ समय इनक्यूबेशन संमान, और अंतिम संवर्धन कदम से पहले कॉलम प्रति चार ट्यूमर तक खींचो । वीवो प्रयोगों में प्रीक्लिनिकिकल के साथ आगे बढ़ने से पहले बाध्यकारी, तेज और औषधीय प्रभावकारिता के कार्यकाल में कई उम्मीदवार नैनो दवाओं को स्क्रीन करने के लिए अलग सीएएफ का उपयोग किया जा सकता है।सीएएफ अलगाव ने हमें यह परीक्षण करने की अनुमति दी कि क्या नैनोकणों का उपयोग ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार कीमोथेरेपी के साथ तालमेल में काम कर रहे नए लक्षित चिकित्सा के लिए मार्ग प्रशस्त ।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

फेफड़ों के कैंसर-लक्षित नैनोकणों के साथ Photodynamic थेरेपी के कैंसर विरोधी प्रभावकारिता

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

एक पोर्टल नस इंजेक्शन मॉडल का अध्ययन करने के लिए स्तन कैंसर का लिवर मेटास्टेसिस

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

पूर्व नैदानिक ​​चिकित्सा के मात्रात्मक और अनुदैर्ध्य मूल्यांकन के लिए एक syngeneic माउस प्रक्षेपि के मॉडल गुर्दे सेल कार्सिनोमा

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

थकान के एक माउस मॉडल परिधीय विकिरण से प्रेरित

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

एक Syngeneic अग्नाशय के कैंसर माउस मॉडल अपरिवर्तनीय Electroporation के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

एक Bioluminescent और फ्लोरोसेंट Orthotopic Syngeneic Murine मॉडल एण्ड्रोजन के आश्रित और बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping के Orthotopic Homograft (Syngeneic) के Murine प्राथमिक KPC अग्नाशय वाहिनीई ग्रंथिकर्कटता द्वारा प्रवाह Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

पीडी-L1 एक्सप्रेशन का अध्ययन करने के लिए Syngeneic लंग ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं का Orthotopic ट्रांसप्लांटेशन

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

कैंसर के लिए एक अधिक शारीरिक प्रणाली के रूप में एक 3 डी Spheroid मॉडल-एसोसिएटेड Fibroblasts भेदभाव और विट्रो अध्ययन में आक्रमण

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...