Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) nell'ambito del progetto IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio. SM riconosce il centro di ricerca clinica pediatrica "Romeo ed Enrica Invernizzi" che supporta la sua posizione. AB ringrazia AIRC (progetto ID. 20172) e l'Università degli Studi di Milano per l'assegno di ricerca. Le borse di studio post-dottorato e dottorato LS e MS sono sostenute dall'Università degli Studi di Milano.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I CAF stanno emergendo come attori chiave nel rimodellamento della matrice extracellulare, promuovendo la progressione delle metastasi e limitando l'accesso dei farmaci al sito tumorale34. Tuttavia, a causa della loro eterogeneità, i loro ruoli sono ancora controversi: alcuni CAF sono tumorigenici, mentre alcuni altri sottotipi sembrano avere un ruolo soppressivo del tumore. In questo contesto, il loro isolamento può essere di estremo interesse per far luce sul loro ruolo molto dibattuto nella progressione del cancro, che avrà importanti implicazioni cliniche12,31. Inoltre, l'estrazione CAF di successo da modelli tumorali murini umani e preclinici faciliterebbe anche lo sviluppo di nuovi farmaci CAF-targeting. Questo documento riporta un metodo per isolare e coltura in modo efficiente i CAF primari da un modello preclinico singeneico di cancro al seno. Sulla base dell'esperienza, tre fasi sperimentali influenzano principalmente il successo del protocollo.
Il primo è lavorare velocemente per evitare l'aggregazione di sospensioni cellulari associate al rischio di coagulazione nella colonna e al rallentamento dell'efflusso cellulare: infatti, quando le cellule che passavano attraverso la colonna venivano raggruppate insieme, aumentava la probabilità di un processo di isolamento sub-ottimale e le colture finali contenevano cloni cellulari "contaminanti". Il secondo è il pooling di cellule di diversi tumori dopo il passaggio di esaurimento per garantire un numero sufficiente di cellule da attraversare nella fase finale di arricchimento. L'ultimo problema critico è la placcatura delle cellule estratte ad alte densità cellulari, molto probabilmente partendo da un singolo pozzettino della piastra a 24 pozzetti per aumentare la crescita cellulare e l'espansione della colonia per un massimo di 4-5 passaggi. Se le cellule venivano seminate a basse densità, si espandevano sulla superficie libera e smettevano rapidamente di replicarsi.
Diversi studi hanno già descritto metodi di estrazione CAF di origine sia umana che murina, per studiare il loro ruolo nel promuovere lo sviluppo e l'invasività del cancro. Questo è stato fatto in molti tipi di tumori, tra cui il cancro al seno, il melanoma, il colangiocarcinoma e l'adenocarcinoma pancreatico35,36,37,38. Tuttavia, a causa della mancanza di marcatori CAF specifici e della loro eterogeneità, i risultati di questi processi sono ancora sub-ottimali.
Qui, le cellule isolate sono state utilizzate per convalidare la capacità di targeting CAF delle nanocaghe HFn funzionalizzate con parti di targeting anti-FAP. L'uso di colture primarie di CAF è stato un vantaggio significativo, consentendo la validazione della nanostrategia ex vivo con un esperimento di legame molto più semplice ed economico rispetto a farlo direttamente in vivo in questa fase preliminare di ottimizzazione dei nanofarmaci.
In questo senso, i test ex vivo sui CAF possono precedere gli esperimenti in vivo sugli animali consentendo lo screening e la selezione delle nanoparticelle più promettenti per il targeting ottimale della CAF. Il modello CAF qui presentato può anche essere utilizzato per studi preliminari di efficacia, quando si caricano nanoparticelle con farmaci attivi. Gli animali saranno utilizzati solo in seguito per valutare la biodistribuzione, la farmacocinetica e gli studi di efficacia.
Sono in fase di sviluppo diversi nanofarmaci CAF-targeting, come nanocages di ferritina per la terapia fotodinamica nel cancro al seno e particelle a base di peptidi per fornire doxorubicina nei modelli di cancro alla prostata39,40. Tuttavia, non molti studi si sono concentrati sull'isolamento dei CAF come piattaforme cellulari per l'ottimizzazione dei nanofarmaci.
Questo protocollo presenta alcune limitazioni. In primo luogo, è un protocollo che richiede tempo, che richiede la preparazione e l'acquisto di diversi reagenti e materiali. In secondo luogo, a causa della scarsità di CAF nel tumore al seno 4T1, la loro resa è bassa. Gli esperimenti sulle nanoparticelle dovrebbero essere pianificati ed eseguiti non appena viene raggiunto il numero di cellule richiesto, poiché i CAF primari subiscono la senescenza e non possono essere mantenuti in coltura per lungo tempo. In conclusione, questo metodo di isolamento, coltivazione e caratterizzazione dei CAF può essere un potente strumento per accelerare lo sviluppo di nuovi nanofarmaci mirati nella lotta contro il cancro.

Negli ultimi decenni, è diventato chiaro che uccidere le cellule tumorali di solito non è sufficiente per sradicare la malignità, poiché il microambiente tumorale può provocare una ricaduta del tumore e indurre resistenza terapeutica1,2. È quindi emerso un nuovo paradigma: prendere di mira lo stroma tumorale per privare il tumore di fattori di supporto e, quindi, aumentare l'efficacia dei chemioterapici3,4,5. In particolare, i fibroblasti associati al cancro (CAF) sono un interessante bersaglio stromale in molti tumori solidi6,7. I CAF sono un gruppo molto eterogeneo di cellule che interagiscono con le cellule tumorali e le cellule del sistema immunitario attraverso la secrezione di fattori di crescita, citochine e chemochine; costruire e rimodellare la matrice extracellulare; e abilitare la formazione di metastasi8,9,10,11,12. A seconda del tipo di tumore, i CAF mostrano funzioni pro-tumorigeniche, mentre altri sottotipi di CAF sembrano avere funzioni oncosoppressori13,14. Per chiarire meglio questa dicotomia, è importante una caratterizzazione approfondita dei CAF da tumori primari e metastatici.
In questo contesto, un campo di ricerca emergente si è concentrato sullo sviluppo di agenti di dimensioni nanometriche progettati per colpire e/o distruggere i CAF fornendo molecole attive e farmaci in grado di rimodellare il microambiente tumorale15,16,17,18. Diversi tipi di nanoparticelle sono stati progettati per ottenere l'ablazione CAF con farmaci citotossici, per indurre una terapia fotodinamica mirata al CAF o per riprogrammare i CAF ripristinandoli in uno stato quiescente o inducendo l'espressione del ligando indotta dall'apoptosi correlata al TNF, che induce l'apoptosi delle cellule tumorali vicine16,19. Inoltre, il potenziale di molte nanoparticelle di colpire attivamente marcatori biologici specifici dà origine alla speranza di selezionare sottoinsiemi CAF da indirizzare. Sebbene la sua assoluta specificità per la CAF sia ancora messa in discussione, la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) è uno degli obiettivi più promettenti dello stroma pro-tumorigenico e viene sfruttata per guidare la somministrazione di nanofarmaci, aprendo così la strada allo sviluppo di nanoterapie mirate al CAF20,21,22.
Questo documento descrive l'isolamento dei CAF primari da un modello singeneico di carcinoma mammario murino e riporta il loro uso nello studio della capacità di targeting delle nanoparticelle progettate per riconoscere il marcatore CAF, FAP. Le nanocaghe di ferritina sono utilizzate come nanosistemi candidati per impostare il metodo, poiché la loro specificità di consegna può essere modellata dall'esposizione superficiale delle partitargeting 23,24. Inoltre, le ferritine hanno dimostrato con successo di essere eccellenti navette biocompatibili per applicazioni antitumorali, innescando un rapido accumulo del carico utile nella massa tumorale25,26,27. Ad oggi, studi preclinici di nanosistemi CAF-targeting hanno coinvolto test in vitro su linee cellulari di fibroblasti stimolate in coltura con fattore di crescita trasformante-beta per indurre l'attivazione cellulare e l'espressione di alcune caratteristiche immunofenotipiche dei CAF28,29. Questo metodo viene solitamente applicato a linee cellulari immortalizzate (come NIH3T3, LX-2) ed è abbastanza rapido e semplice, producendo cellule attivate in poche ore o giorni. Un limite è che sebbene la stimolazione in vitro induca l'espressione di alcuni geni attribuiti a miofibroblasti attivati, non può ricapitolare interamente tutte le caratteristiche biologiche dei CAF reali, in particolare la loro eterogeneità in vivo.
Un'altra strategia prevede l'estrazione di CAF primari da campioni di tumore umano o murino30,31. Ciò garantisce che l'attivazione della CAF avvenga in un contesto fisiologico e che l'eterogeneità delle sottopopolazioni CAF sia mantenuta. Secondo l'obiettivo di ricerca, i CAF possono essere derivati da fonti diverse, offrendo così la possibilità di studiare la condizione più affidabile. Il protocollo qui riportato sarebbe prezioso per gli scienziati che cercano di eseguire una valutazione preliminare della funzionalità di nuove nanoparticelle progettate per colpire i CAF da un modello di cancro al seno murino. I CAF isolati sarebbero utili per lo screening di quelle nanoparticelle che sono abbastanza promettenti da procedere per la valutazione in vivo in modelli animali di cancro. Ciò sarà rilevante durante le prime fasi della produzione di nanoparticelle, guidando i nanotecnologi verso il perfezionamento della progettazione di nanoparticelle considerando principalmente la strategia di immobilizzazione del ligando per ottenere proprietà di targeting ottimali.

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			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono attori chiave nel contesto del microambiente tumorale. Nonostante siano ridotti in numero rispetto alle cellule tumorali, i CAL regolano la progressione del tumore e forniscono protezione dall'immunità antitumorale. Le strategie antitumorali emergenti mirano a rimodellare il microambiente tumorale attraverso l'ablazione di CAF pro-tumorigenici o la riprogrammazione delle funzioni dei CAF e del loro stato di attivazione. Un approccio promettente è lo sviluppo di agenti di consegna di dimensioni nanometriche in grado di colpire i CAF, consentendo così la consegna specifica di farmaci e molecole attive. In questo contesto, un modello cellulare di CAF può fornire uno strumento utile per lo screening in vitro e l'indagine preliminare di tali nanoformulazioni.
Questo studio descrive l'isolamento e la coltura dei CAF primari dal modello murino singeneico 4T1 del carcinoma mammario triplo negativo. Le perle magnetiche sono state utilizzate in un processo di separazione in 2 fasi per estrarre i CAF dai tumori dissociati. Il controllo dell'immunofenotipizzazione è stato eseguito utilizzando la citometria a flusso dopo ogni passaggio per verificare la resa del processo. I CAF isolati possono essere impiegati per studiare la capacità di targeting di diverse nanoformulazioni progettate per affrontare il microambiente tumorale. Le nanogaggi di H-ferritina etichettate fluorescentemente sono state utilizzate come nanoparticelle candidate per impostare il metodo. Le nanoparticelle, nude o coniugate con un ligando bersaglio, sono state analizzate per il loro legame ai CAF. I risultati suggeriscono che l'estrazione ex vivo dei CAF mammari può essere un sistema utile per testare e convalidare le nanoparticelle per il targeting specifico dei CAF tumorigenici.

Configurazione del modello in vivo per un isolamento CAF ottimale L'iniezione di10 5 cellule 4T1-luc nel cuscinetto di grasso mammario di topi femmina BALB/c porta alla crescita di una massa tumorale rilevabile a 5 giorni dopo l'impianto. Misurando il volume del tumore con pinze e la vitalità delle cellule tumorali con BLI, la crescita del tumore è stata monitorata per un mese dopo l'impianto. Per trovare una finestra di sacrificio adeguata per l'isolamento delle CAF, è stato cercato un compromesso ottimale tra dimensioni tumorali più elevate e BLI da un lato e un'ulcerazione e necrosi tumorale emergente dall'altro (Figura 1). Poiché un nucleo necrotico appare 20 giorni dopo l'impianto e si ingrandisce a 25 e 30 giorni (come documentato dalle immagini BLI nella Figura 1C),il giorno 20 è stato impostato come punto temporale per ottimizzare il recupero cellulare dopo il processo di isolamento. Anche dopo aver accuratamente rimosso tutte le aree necrotiche visibili durante le prime fasi di manipolazione del tumore ex vivo,un'alta percentuale di cellule morte è stata trovata al termine della dissociazione in singole cellule(Tabella 1). Poiché questa percentuale può essere rilevante, specialmente con l'aumento delle dimensioni del tumore, la rimozione delle cellule morte è sempre necessaria quando si lavora con il modello 4T1.
Ottimizzazione della procedura di isolamento, della coltura e della caratterizzazione dei CAF Sono necessari altri due passaggi per isolare la popolazione di CAF (CD90.2+ CD45-) dal pannello delle cellule vitali raccolte: l'esaurimento dei fibroblasti non associati al tumore e l'arricchimento dei fibroblasti associati al tumore (Figura 2). Il cocktail di perle di deplezione rimuove in modo efficiente le cellule CD45+ (che rappresentano il 67,35% e lo 0,69% delle cellule totali pre e post-esaurimento, rispettivamente, Tabella 2), ed è sempre stato utilizzato per elaborare un singolo tumore in ogni colonna. Come mostrato nella Tabella 1,il numero di cellule eluite è sceso da una media di 3 × 106 a 1 × 105 dopo la fase di esaurimento. A causa di questa massiccia diminuzione del numero totale di cellule, è conveniente mettere in comune le cellule raccolte da almeno 2 a un massimo di 4 tumori in un singolo tubo prima di procedere con la fase di arricchimento. In questo modo, è stato ottenuto un numero adeguato di cellule per l'incubazione con perle di fibroblasti associate al tumore e sono passate attraverso una singola colonna di separazione per ottenere una media finale del 93% delle cellule CD90.2+ CD45( Tabella 2).
Una volta seminate su piastre di coltura tissutale, queste hanno recuperato cellule attaccate alla plastica e hanno rivelato una grande morfologia a forma di fuso tipica dei fibroblasti(Figura 3A,B)e diversa dalle cellule tumorali 4T1(Figura 3D). Non mettere in comune i tumori dopo l'esaurimento fa sì che la resa cellulare con le microsfere dei fibroblasti associate al tumore sia troppo bassa per stabilire una coltura. In altri casi, quando la durata e la temperatura delle incubazioni con microsfere non vengono mantenute con cura, possono verificarsi alcuni legami non specifici. In questi casi, le fasi di arricchimento sono state meno efficienti e percentuali più elevate di cellule CD90.2- CD45+ e CD90.2- CD45 - sono state recuperate insieme alle cellule CD90.2+ (5.97 ± 1.5 e 16.75 ± 1.1, rispettivamente) (Figura 4 e Tabella 3). Queste cellule contaminanti erano probabilmente responsabili della presenza in coltura di piccoli cloni con morfologia diversa(Figura 4B,punte di freccia nere) che crescevano più velocemente dei CAF e prevalevano sulla coltura CAF primaria(Figura 4C). Questi risultati non ottimali hanno confermato l'importanza di ricontrollare sempre sia l'espressione di CD90.2 che CD45, così come la morfologia cellulare alla fine del processo di arricchimento e durante la crescita cellulare in coltura.
Uso di cellule isolate per valutare il potenziale di targeting CAF di nanofarmaci ingegnerizzati I CAL appena isolati possono essere utilizzati per diverse applicazioni che vanno dalla ricerca di base agli studi farmacologici. L'obiettivo di questo gruppo è quello di sviluppare nanocavaggi HFn che possano colpire specificamente i CAL. HFn è stato funzionalizzato con uno specifico frammento di anticorpo anti-FAP (HFn-FAP) a due diversi rapporti proteina/anticorpo (un inferiore 1:1 e un superiore 1:5), ed è stato testato il loro legame con i CAF. Poiché il FAP è stato utilizzato come biomarcatore di superficie dei CAF pro-tumorigenici, è stato di fondamentale importanza controllare l'espressione di FAP su CAF isolati (Figura 3C). L'espressione FAP è stata seguita in 5 passaggi in cultura per confermare che la cultura CAF primaria ha mantenuto le sue caratteristiche originali.
Si è scoperto che la funzionalizzazione FAP su HFn contribuisce a uno spostamento significativo verso il targeting CAF rispetto all'HFn nudo, e la minore quantità di anticorpi (1:1) è stata sufficiente per osservare questo effetto (Figura 5A). Tuttavia, questo non è stato osservato con le cellule tumorali 4T1 utilizzate per impostare il modello tumorale in vivo, in cui l'HFn nudo ha mostrato un legame più elevato rispetto all'HFn funzionalizzato (Figura 5B). Ciò è stato molto probabilmente dovuto all'assenza di sovraespressione di FAP nelle cellule 4T1 e all'interazione preferenziale di HFn con TfR1, che regola l'assorbimento di HFn nelle cellule, come ampiamente riportato da questo gruppo27,33. Questi risultati confermano l'utilità dell'utilizzo di colture primarie di CAF mammarie per lo screening preliminare della capacità di targeting delle nanoparticelle progettate per affrontare il microambiente tumorale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Figura 1: Istituzione del modello tumorale 4T1. Le cellule (105 cellule/ topo) sono state iniettate nel cuscinetto di grasso mammario. La crescita tumorale è stata seguita ai giorni 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dopo l'impianto(A)misurando il volume del tumore con pinze e(B)mediante imaging a bioluminescenza. I volumi tumorali e blI sono espressi rispettivamente in mm3 e conteggi. I risultati sono riportati come media ± SEM (n = 6). (C)Le immagini rappresentative BLI ottenute 5, 10, 15, 20, 25 e 30 giorni dopo l'impianto cellulare confermano la crescita del tumore fino al giorno 25, quando sembra raggiungere un plateau. All'ultimo punto di analisi (30 giorni), il BLI non aumenta rispetto al giorno 25. A partire dal giorno 20, le aree di necrosi e ulcerazione iniziano a diventare visibili nella parte centrale del tumore. Scala dei colori: Min = 1.194, Max = 20.462. Abbreviazioni: BLI = imaging a bioluminescenza; SEM = errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione di campioni tumorali e caratterizzazione citometrica a flusso di CAF isolati. I tumori sono stati asportati e ridotti in (A) piccoli pezzi di circa 1-2 mm con l'aiuto di un bisturi; (B)sospensione unicellulare dopo digestione tissutale e dissociazione meccanica di un tumore asportato; (C) pellet cellulare ottenuto dopo lisi dei globuli rossi; (D) analisi citometrica a flusso dell'espressione di CD45 e CD90.2 in cellule ottenute dopo rimozione di globuli rossi e cellule morte, (E) dopo esaurimento di fibroblasti non associati al cancro e (F) dopo arricchimento di fibroblasti associati al cancro, dove la maggior parte delle cellule sono CD90,2+ CD45- (rettangolo blu). Abbreviazioni: CAFs = fibroblasti associati al cancro; CD = cluster di differenziazione; PE-A = area di ficoeritrina; FITC-A = aree di isotiocianato di fluoresceina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Figura 3: Analisi morfologica dell'espressione di CAFe FAP. (A, B) La morfologia dei CAF è stata verificata in tutti i passaggi di coltura mediante microscopia ottica (diversi livelli di confluenza al passaggio 2 e al passaggio 5) e confrontata con le cellule tumorali (D) 4T1; (C) L'espressione della proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) è stata valutata mediante citometria a flusso alla fine del processo di isolamento sullecellule CD90.2+ CD45 raccolte per confermare le loro caratteristiche molecolari. Una soglia di fluorescenza è stata impostata sulle cellule di controllo non macchiate (grafico rosso) per quantificare l'intensità media della fluorescenza e la percentuale di cellule positive (FAP+)tra le cellule macchiate di anticorpi (grafico blu). Abbreviazioni: CAFs = fibroblasti associati al cancro; FAP = proteina di attivazione dei fibroblasti; CD = cluster di differenziazione; IFM = intensità media di fluorescenza; Ab = anticorpo; FITC-A = area di isotiocianato di fluoresceina; FAP+ = cellule FAP-positive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Figura 4: Esempio di un processo di isolamento CAF sub-ottimale. ( A )Lavalutazione della citometria a flusso dopo la fase finale di isolamento ha rivelato la presenza di cellule contaminanti CD90.2- CD45+ e CD90.2- CD45. (B) Queste cellule possono essere viste come cloni con una piccola morfologia rotonda al momento della semina (punte di freccia nere e inserto nell'angolo in basso a sinistra del pannello) che (C) ha prevalso sui CAF dopo il terzo passaggio in coltura. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: CAF = fibroblasto associato al cancro; CD = cluster di differenziazione; PE-A = area di ficoeritrina; FITC-A = aree di isotiocianato di fluoresceina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Figura 5: Legame di nanocavi HFn su CAF e 4T1. Le nanocaghe HFn sono state etichettate fluorescentemente con FITC, funzionalizzate con un frammento di anticorpo anti-FAP (HFn-FAP) a due diversi rapporti proteina-anticorpo (1:1 e 1:5) e incubate con (A) cellule bersaglio e (B) 4T1 a 4 °C per 2 ore. Il legame è stato valutato mediante citometria a flusso. ( A )Illegame HFn-FAP con i CAF è significativamente aumentato di tre volte a entrambe le concentrazioni di frammenti di anticorpi rispetto all'HFn nudo. (B) Al contrario, è stato osservato un legame significativamente più elevato di HFn nudo nelle cellule 4T1, dove il legame non è migliorato dal riconoscimento FAP. I risultati sono riportati come deviazione media ± standard di tre esperimenti indipendenti. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Abbreviazioni: CAFs = fibroblasti associati al cancro; FAP = proteina di attivazione dei fibroblasti; HFn = variante ricombinante della catena pesante di ferritina umana usata come nanoparticella nuda o coniugata; HFN-FAP = nanoparticelle HFn funzionalizzate con la porzione variabile di un anticorpo anti-FAP preparato a due rapporti molari HFn:Fab@FAP, 1:1 e 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Numero di cella (SD ± media)</td>
			<td>Resa di estrazione Totale (per passaggio)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumore asportato (post rimozione dei globuli rossi)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumore asportato (rimozione delle cellule morte post)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail post esaurimento</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post arricchimento</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Conta cellulare totale dopo ogni fase di isolamento dei fibroblasti associati al cancro.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Distribuzione cellulare (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90,2+ CD45+
</td>
			<td>CD90,2- CD45+
</td>
			<td>CD90,2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumore asportato (rimozione delle cellule morte post)</td>
			<td>1,81 ± 0,98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail post esaurimento</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0,14 ± 0,13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post arricchimento</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Distribuzione cellulare in base all'espressione di CD90.2 e CD45 dopo ogni passaggio di isolamento dei fibroblasti associati al cancro.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Distribuzione cellulare (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90,2+ CD45+
</td>
			<td>CD90,2- CD45+
</td>
			<td>CD90,2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post arricchimento (senza pooling)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1,49 ± 0,4</td>
			<td>5,97 ± 1,5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Espressione CD90.2 e CD45 di cellule raccolte dopo un esperimento di isolamento dei fibroblasti associato al cancro sub-ottimale.

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Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Questo documento mira a fornire un protocollo per l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari associati al cancro da un modello murino singeneico di carcinoma mammario triplo negativo e la loro applicazione per lo studio preclinico di nuove nanoparticelle progettate per colpire il microambiente tumorale.

Isolamento di fibroblasti primari associati al cancro da un modello murino singeneico di cancro al seno per lo studio di nanoparticelle mirate

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Questo protocollo consente di isolare e coltivare con successo fibroblasti associati al cancro primario dal cancro al seno murin, per lo screening di nuove nanoparticelle progettate per colpire il microambiente tumorale. I CAF primari rappresentano il modello più affidabile e fisiologico per gli studi in vitro dello stroma tumorale. In questo protocollo, descriviamo come ottenere una resa ottimale.Per iniziare, preparare un mix di digestione per la dissociazione del tumore e immergere i frammenti tumorali da tre a cinque millimetri nella soluzione dopo aver chiuso ermeticamente il tubo. Capovolgere il tubo, controllando che tutti i pezzi di tumore siano nella parte inferiore del tubo verso il cappuccio. Quindi collegare il tubo a un dissociaro meccanico nell'alloggiamento appropriato ed eseguire un programma di dissociazione specificamente progettato per i tumori duri.Dopo la corsa, staccare il tubo e posizionarlo a testa in giù per incubare il campione a 37 gradi Celsius per 40 minuti con un leggero scuotimento. Quindi ricollegare il tubo al dissociatere nell'alloggiamento appropriato ed eseguire il programma di dissociazione per i tumori duri due volte, assicurandosi che non rimangano pezzi di tessuto di grandi dimensioni alla fine della procedura. Filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un tubo da 50 millilitro.Quindi lavare il filtro con 10 millilitri di mezzo RPMI 1640 e centrifuga. Dopo la centrifugazione, risuscidere il pellet in tampone PBE, composto da PBS, 0,5% BSA e due EDTA millimolari, e contare le celle con Trypan Blue. Riparare il tampone legante per la rimozione delle cellule morte diluendo la soluzione tampone legante 20X con acqua sterile a doppia distillazione.Lavare le celle con cinque millilitri di tampone legante 1X e centrifuga. Dopo la centrifugazione, risospendare il pellet cellulare con 0,1 millilitro di microsfere di rimozione delle cellule morte per un massimo di 10-10 celle e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Durante l'incubazione, preparare un supporto magnetico sotto il cofano e appendere colonne di separazione ferromagnetica ad esso, con le punte che puntano verso il basso.Equilibrare le colonne con 0,5 millilitri di tampone legante a freddo e attendere che la soluzione sia passata. Dopo l'incubazione, aggiungere 400 microlitri di tampone legante a freddo al perla e alla sospensione cellulare. Caricare l'intero volume sulla colonna e raccogliere l'effluente in un tubo da 15 millilitro.Lavare la colonna quattro volte con 0,5 millilitri di tampone legante a freddo e raccogliere l'effluente totale nello stesso tubo. Per l'esaurimento dei fibroblasti non associati al cancro, filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 70 micron inumidito con PBS e centrifugare le cellule. Rimuovere il surnatante e risuscidere il pellet in 80 microlitri di tampone PBE freddo.Aggiungere 20 microlitri di cocktail di esaurimento dei fibroblasti non associati al tumore. Mescolare bene e incubare il campione a 4 gradi Celsius per 15 minuti al buio. Durante l'incubazione con perle, preparare colonne di esaurimento ferromagnetico su un supporto magnetico.Equilibrare le colonne con due millilitri di tampone PBE freddo e attendere che la soluzione sia passata. Dopo l'incubazione, aggiungere 400 microlitri di tampone al perla e alla sospensione cellulare. Caricare l'intero volume sulla colonna e raccogliere l'effluente in un tubo da 15 millilitro.Lavare la colonna due volte con due millilitri di PBE. Raccogliere l'effluente totale nello stesso tubo e centrifugare l'effluente. Per la selezione positiva dei fibroblasti associati al cancro, riconsedere il pellet in 80 microlitri di tampone PBE freddo.Quindi a 20 microlitri di fibroblasti associati al tumore microsfere e incubare i campioni a 4 gradi Celsius per 15 minuti al buio. Durante l'incubazione, preparare le colonne di separazione ferromagnetica su un supporto magnetico ed equilibrarle con 0,5 millilitri di tampone PBE freddo. Dopo l'incubazione, aggiungere 400 microlitri di PBE alla sospensione di pere e cellule.Caricare l'intero volume sulla colonna e lasciare che le celle senza etichetta fluiscano in un tubo da 15 millilitro. Lavare la colonna tre volte con 0,5 millilitri di tampone PBE e raccogliere l'effluente totale nello stesso tubo. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in un tubo da 1,5 millilitro.Aggiungere un millilitro di PBE sulla colonna e spingere immediatamente lo stantuffo nella colonna per svuotare le celle. Dopo la centrifugazione, risuscibare il pellet cellulare in un volume appropriato di DMEM e seminare le cellule in una piastra di coltura tissutale. Controllare la densità cellulare al microscopio e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per consentire alle cellule di aderire e crescere.L'iniezione di cellule di 4T1 luciferasi nel cuscinetto di grasso mammario dei topi femmina ha portato alla crescita di una massa tumorale rilevabile cinque giorni dopo l'impianto. Per trovare una finestra di sacrificio adeguata per l'isolamento CAF, è stato cercato un compromesso ottimale tra dimensioni tumorali più elevate e imaging a bioluminescenza da un lato e un'ulcerazione e necrosi tumorale emergente dall'altro. Il giorno 20 è stato impostato come punto temporale per ottimizzare il recupero cellulare, dopo il processo di isolamento.Sono stati necessari altri due passaggi per isolare la popolazione di CAF, dal pannello di cellule vitali raccolte, dall'esaurimento dei fibroblasti non associati al tumore e dall'arricchimento dei fibroblasti associati al tumore. Le cellule CAF hanno rivelato una grande morfologia a forma di fuso, tipica dei fibroblasti, ed erano diverse dalle cellule tumorali 4T1. L'espressione fap seguita in cinque passaggi conferma che la cultura CAF primaria ha mantenuto le sue caratteristiche originali.Quando la durata e la temperatura delle incubazioni con microsfere non sono state mantenute, sono stati trovati cloni con morfologia diversa tra le culture isolate. Queste cellule contaminanti sono cresciute più velocemente e hanno prevalso sulla coltura CAF primaria. Il legame dei CAF con il nano farmaco funzionalizzato Hfn-FAP della ferritina umana è aumentato di tre volte a una e le concentrazioni di frammenti di anticorpi da uno a cinque.Al contrario, per le cellule tumorali 4T1, l'HFN nudo ha mostrato un legame più elevato rispetto all'HFN funzionalizzato. Per aumentare la resa impurità del CAF isolato, mantenere freddi i tamponi, rispettare il tempo di incubazione con le perle e tirare fino a quattro tumori per colonna prima della fase finale di arricchimento. I CAF isolati possono essere utilizzati per lo screening di diversi nano farmaci candidati in termini di legame, assorbimento ed efficacia farmacologica prima di procedere con esperimenti preclinici in vivo.L'isolamento CAF ci ha permesso di verificare se le nanoparticelle possono essere utilizzate per colpire il microambiente tumorale. Aprendo così la strada a nuove terapie mirate che lavorano in sinergia con la chemioterapia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancro Efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

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Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

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Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

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Un modello murino di fatica indotta da irradiazione Peripheral

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A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

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Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

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Trapianto orthotopic delle cellule dell'Adenocarcinoma del polmone Syngeneic studiare espressione PD-L1

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A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

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