Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
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この研究は、IG 2017-ID. 20172 プロジェクト – P.I. コルシ ファビオの下でラ・リセルカ・スル・カンクロあたりアソシアツィオーネイタリアーナによってサポートされました。SMは、彼女の地位を支える小児臨床研究センター「ロミオとエンリカ・インヴェルニッツィ」を認めています。ABは、研究フェローシップのためのAIRC(ID. 20172プロジェクト)とミラノ大学に感謝します。LSとMSのポスドクと博士のフェローシップは、ミラノ大学によってサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

CAFは、細胞外マトリックスのリモデリング、転移進行の促進、および腫瘍部位34への薬物アクセスの制限における主要なプレーヤーとして浮上している。しかし、その異質性のために、その役割は依然として議論の余地があり、一部のCAFは腫瘍性であるのに対し、他のサブタイプは腫瘍抑制的な役割を持っているようだ。この文脈では、彼らの孤立は、重要な臨床的意味を持つ癌進行における彼らの多くの議論の役割にもっと光を当てることに極度の関心を持つことができます。さらに、ヒトおよび前臨床マウス腫瘍モデルからのCAF抽出が成功すれば、新しいCAF標的薬の開発も容易になるだろう。本論文は、乳がんの同系前臨床モデルから原発CAFを効率的に分離し培養する方法を報告する。経験に基づいて、3つの実験的なステップは、主にプロトコルの成功に影響を与えます。
1つ目は、カラム内で凝固し、細胞流出を遅らせるリスクに関連する細胞懸濁液の凝集を避けるために速く働いている:実際、カラムを通過した細胞が一緒に集まったとき、最適な分離プロセスの確率が増加し、最終的な培養物には「汚染物質」細胞クローンが含まれていた。2つ目は、最終的な濃縮ステップで十分な細胞を通過させるために、枯渇通過後に異なる腫瘍から細胞をプールすることです。最終的な重要な問題は、抽出された細胞を高い細胞密度でめっきすることですが、おそらく24ウェルプレートの単一のウェルから始まり、細胞の成長とコロニーの拡張を最大4〜5回の通路にまで高めます。細胞が低密度で播種された場合、彼らは自由表面に膨張し、すぐに複製を停止しました。
いくつかの研究は、すでにヒトとマウスの両方の由来のCAF抽出方法を説明しています, 癌の発達と侵襲性を促進する上でのそれらの役割を研究します..これは、乳癌、黒色腫、胆管癌、および膵腺癌35、36、37、38を含む多くのタイプの腫瘍において行われてきた。しかし、特定のCAFマーカーの欠如とその不均一性のために、これらのプロセスの結果は依然として最適ではありません。
ここで、単離された細胞を用いて、抗FAP標的部分で機能化したHFnナノケージのCAF標的化能力を検証した。CADfの一次培養物の使用は、ナノ医薬品最適化のこの予備段階で直接in vivoで行うよりもはるかに簡単で費用対効果の高い結合実験でナノストラテジー ex vivoの検証を可能にする、重要な利点でした。
この意味で、CAFの ex vivo 試験は、CAFの最適な標的化のための最も有望なナノ粒子のスクリーニングおよび選択を可能にすることによって 、生体内 動物実験に先行することができる。ここで提示されるCAFモデルは、活性薬物を用いたナノ粒子をロードする際の予備的有効性研究にも使用することができる。動物は、バイオディストリビューション、薬物動態、および有効性の研究を評価するために後で使用されます。
乳癌における光力学療法のためのフェリチンナノケージや、前立腺癌モデル39,40でドキソルビシンを送達するペプチド系粒子など、いくつかのCAFターゲティングナノ医薬品が開発されている。しかし、ナノドラッグ最適化のための細胞プラットフォームとしてのCAFの分離に焦点を当てた研究はあまりありません。
このプロトコルには、いくつかの制限があります。第一に、それはいくつかの試薬および材料の準備および購入を要求する時間のかかる議定書である。第二に、4T1乳房腫瘍におけるCAFの不足のために、その収率は低い。一次CAFは老化を受け、培養中に長期間維持できないため、必要な細胞数が達成されるとすぐにナノ粒子実験を計画し、実行する必要があります。結論として、このCAの分離、培養、および特徴付けの方法は、がんとの闘いにおける新しい標的ナノ医薬品の開発を加速するための強力なツールとなり得る。

過去数十年の間に、腫瘍の微小環境が腫瘍の再発を促し、治療抵抗1,2を誘導する可能性があるため、腫瘍細胞の死滅は悪性腫瘍を根絶するのに十分でないことが明らかになりました。新しいパラダイムが出現しました: 腫瘍の間質を標的にして腫瘍を支持因子から奪い、化学療法の有効性を高める3,4,5.特に、癌関連線維芽細胞(CAF)は、多くの固形腫瘍6,7において興味深い間質標的である。WFは、増殖因子、サイトカイン、ケモカインの分泌を通じて免疫系の癌細胞および細胞と相互作用する細胞の非常に不均一なグループである。細胞外マトリックスを構築し、改造する;転移形成8、9、10、11、12を有効にします。腫瘍の種類に応じて、CAFは腫瘍形成機能を示し、他のサブタイプのCAFは腫瘍抑制機能13,14を有するようだ。この二分法をより明確にするためには、原発性腫瘍および転移性腫瘍からのCAFの完全な特徴付けが重要である。
この文脈において、新たな研究分野は、腫瘍微小環境15、16、17、18を改造することができる活性分子および薬物を送達することによって、CAFを標的および/または破壊するように設計されたナノサイズの薬剤の開発に焦点を当てている。ナノ粒子のいくつかのタイプは、細胞傷害性薬物によるCAFアブレーションを達成し、CAF標的光線力学療法を誘導するか、または静止状態に戻すことによってCAFを再プログラムするか、または隣接する癌細胞16、19のアポトーシスを誘導するTNF関連アポトーシス誘導リガンド発現を誘導するように設計されている。さらに、多くのナノ粒子が特定の生物学的マーカーを積極的に標的とする可能性は、標的とするCAFサブセットを選択する望みを生み出す。CAFに対する絶対的特異性は依然として問われ、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)は、腫瘍性基質の最も有望な標的の1つであり、ナノドラッグの送達を操縦するために利用され、したがって、CAF標的性ナノセラピューティクス20、21、22の開発への道を開く。
本論文では、マウス乳癌の同系モデルからの原発性CAFの分離について述べ、CAFマーカーFAPを認識するように設計されたナノ粒子の標的化能力の研究におけるそれらの使用を報告する。フェリチンナノケージは、その方法を設定する候補ナノシステムとして使用され、その送達の特異性は、ターゲティング部分23、24の表面露光によって形成され得る。さらに、フェリチンは、抗腫瘍剤用途に対して優れた生体適合性シャトルであることが実証されており、腫瘍質量25、26、27にペイロードの急速な蓄積を引き起こす。現在までに、CAF標的ナノシステムの前臨床試験は、細胞活性化およびCAF2の免疫表現機能の発現を誘導する増殖因子βを培養して刺激された線維芽細胞株のvitro試験に関与している。この方法は、通常、不死化細胞株(NIH3T3、LX-2など)に適用され、非常に迅速かつ単純であり、数時間または数日で活性化細胞を得る。制限は、インビトロ刺激は活性化された筋線維芽細胞に起因するいくつかの遺伝子の発現を誘導するが、実際のCAFのすべての生物学的特徴、特に生体内でのそれらの不均一性を完全に再現することはできない。
もう一つの戦略は、ヒトまたはマウス腫瘍サンプル30,31からの原発CAFの抽出を含む。これにより、CAF活性化が生理学的な文脈で起こり、CAF亜集団の不均一性が維持されることを保証する。研究目的によれば、CAFは異なるソースから導出され、最も信頼性の高い状態を研究する可能性を提供する。ここで報告されたプロトコルは、マウス乳癌モデルからCAFを標的にするように設計された新しいナノ粒子の機能性の予備的評価を行おうとする科学者にとって貴重であろう。分離されたCAFは、癌の動物モデルにおける生体内評価を進めるのに十分有望なナノ粒子をスクリーニングするのに有用であろう。これは、ナノ粒子生産の最初のステップで関連し、ナノ技術者は主に最適な標的化特性を達成するためのリガンド固定化の戦略を検討することによって、ナノ粒子設計の洗練に向けて推進する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

癌関連線維芽細胞(CAF)は、腫瘍微小環境の文脈における主要なアクターである。腫瘍細胞と比較して数が減少しているにもかかわらず、CAFは腫瘍の進行を調節し、抗腫瘍免疫からの保護を提供する。新たな抗がん戦略は、腫瘍性腫瘍性CAFの切り替えまたはCAF機能の再プログラミングとその活性化状態を通じて腫瘍微小環境を再構築することを目指しています。有望なアプローチは、CAFを標的とすることができるナノサイズの送達剤の開発であり、したがって、薬物および活性分子の特異的な送達を可能にする。この文脈において、CAFの細胞モデルは、そのようなナノ製剤の インビトロ スクリーニングおよび予備調査のための有用なツールを提供し得る。
本研究では、三重陰性乳癌の同種4T1マウスモデルからの原発性CAFの分離と培養について説明する。磁気ビーズは、解離された腫瘍からCADFを抽出するために2段階の分離プロセスで使用された。免疫フェノタイピング制御は、プロセス歩留まりを検証するために各通過後のフローサイトメトリーを用いて行った。分離されたCAFは、腫瘍微小環境に取り組むために設計された異なるナノ製剤の標的化能力を研究するために使用することができる。蛍光標識されたHフェリチンナノケージは、この方法を設定する候補ナノ粒子として使用した。ナノ粒子は、裸または標的リガンドと共役し、CAFへの結合について分析した。この結果は、乳房CAFの ex vivo 抽出が、腫瘍化CAFの特異的標的化についてナノ粒子をテストおよび検証するのに有用なシステムである可能性を示唆している。

最適な CAF 分離のための In vivoモデルのセットアップ 雌BALB/cマウスの乳腺脂肪パッドに105 4T1-luc細胞を注入すると、移植後5日で検出可能な腫瘍塊の増殖を導く。BLIによるキャリパーによる腫瘍体積および腫瘍細胞の生存率を測定することにより、腫瘍の増殖を移植後1ヶ月間モニタリングした。CAFの分離に適した犠牲ウィンドウを見つけるために、一方では腫瘍サイズとBLIの増加と、一方では新たな腫瘍潰瘍と壊死との間で最適な妥協が求められた(図1)。壊死性コアが移植後20日に現れ、25日および30日( 図1CのBLI画像で文書化されているように)で拡大し、20日目は、分離プロセス後の細胞回収を最適化するタイムポイントとして設定した。 ex vivoの腫瘍処理の第1ステップ中に目に見える壊死領域をすべて注意深く除去した後でさえ、単一細胞への解離の終わりに死細胞の高い割合が見つかった(表1)。この割合は、特に腫瘍サイズの増加に関連する可能性があるため、4T1モデルを使用する場合、死細胞除去が常に必要です。
CAF の分離手順、カルチャ、および特性評価の最適化 収集した生存細胞のパネルからCAF(CD90.2+ CD45-)の集団を分離するには、さらに2つの通路が必要です:非腫瘍関連線維芽細胞の枯渇と腫瘍関連線維芽細胞の濃縮(図2)。枯渇ビーズカクテルは、効率的にCD45+細胞を除去し(それぞれ、完全な細胞の67.35%および0.69%を占め、全細胞の前および後の枯渇を占める、表2)、そして常にすべての列の1つの腫瘍を処理するために使用された。表1に示すように、溶出した細胞の数は、除食ステップ後の平均×106から1×105の平均から減少した。 総細胞数のこの大規模な減少のために、集めた細胞を、濃縮工程に進む前に、1つのチューブ内の少なくとも2から最大4個の腫瘍までプールするのが便利です。そうすることにより、腫瘍関連線維芽細胞ビーズによるインキュベーションのために十分な数の細胞が得られ、単一の分離カラムを通過してCD90.2+ CD45-細胞の最終平均93%を得た(表2)。
組織培養プレートに播種すると、これらの回収された細胞はプラスチックに付着し、線維芽細胞の典型的な大きな紡錘形形態を明らかにした(図3A、B)および4T1腫瘍細胞とは異なる(図3D)。枯渇後に腫瘍をプールしないと、腫瘍関連線維芽細胞マイクロビーズを伴う細胞収量が低すぎて培養を確立できない。他の場合、マイクロビーズとのインキュベーションの持続時間および温度が注意深く維持されない場合、いくつかの非特異的結合が生じることがある。このような場合、濃縮ステップは効率が悪く、CD90.2- CD45 +および CD90.2- CD45-セルはCD90.2+ CAF(5.97 ± 1.5 および 1.1)と共 ±に回収された(図4および表3)。これらの汚染物質細胞は、異なる形態を有する小クローンの培養における存在を担う可能性が高かった(図4B、黒矢印)、CAFよりも速く成長し、主要なCAF培養物に勝った(図4C)。これらの最適でない結果は、濃縮プロセスの終わりと培養中の細胞増殖時に、CD90.2およびCD45発現の両方を常に再検査することの重要性を確認した。
分離細胞を用い、工学的ナノドラッグのCAF標的化ポテンシャルを評価 新たに分離されたCAFは、基礎研究から薬理学的研究に至るまで、いくつかの用途に使用することができます。このグループの目的は、特にCAFを標的にできるHFnナノケージを開発することです。HFnは、2つの異なるタンパク質で特異的な抗FAP抗体断片(HFn-FAP)で機能化した:抗体比(低い1:1および高い1:5)、およびそれらのCAFとの結合を試験した。FAPは、腫瘍性腫瘍性CAFの表面バイオマーカーとして使用されていたため、単離されたCAFに対するFAP発現をチェックすることが基本的に重要であった(図3C)。FAP発現は、培養中の5箇所にわたって続き、主要なCAF培養が本来の特徴を維持していることを確認した。
HFnに対するFAP機能化は、裸のHFnと比較してCAF標的化に向けた有意なシフトに寄与することが判明し、抗体の量(1:1)の低下はこの効果を観察するのに十分であった(図5A)。しかし、これはインビボ腫瘍モデルを設定するために使用される腫瘍4T1細胞では認められなかったが、ここで裸HFnは機能化されたHFnよりも高い結合を示した(図5B)。これは、このグループ27,33によって広く報告されているように、4T1細胞におけるFAP過剰発現の欠如と、細胞におけるHFn取り込み調節を調節するTfR1とのHFnの優遇相互作用が原因で最も可能性が高かった。これらの結果は、乳房CAFの一次培養物を使用して、腫瘍微小環境に取り組むために設計されたナノ粒子の標的化能力を予備的にスクリーニングすることの有用性を確認した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> 図1 :4T1腫瘍モデルの確立細胞(105細胞/マウス)を乳腺脂肪パッドに注入した。腫瘍増殖は、移植後5日目、10日目、15日目、20日、25日、25日、30日目(A)で、カリパーによる腫瘍体積を測定し、(B)生物発光イメージングにより続いた。腫瘍容積とBLIはそれぞれmm3とカウントとして表される。結果は平均±SEM(n=6)として報告されます。(C)BLI代表的画像は、細胞移植後5、10、15、20、25、および30日目に得られ、25日目まで腫瘍の増殖を確認し、高原に達したと思われる。最後の分析時点(30日)では、BLIは25日目と比較して増加しません。20日目から、壊死および潰瘍の領域が腫瘍の中央部に見えるようになり始める。カラースケール: 最小 = 1,194、最大 = 20,462。略語: BLI = 生物発光イメージング;SEM = 平均の標準誤差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> 図2:腫瘍試料調製および分離されたCAFのフローサイトメトリー特性測定腫瘍は、メスの助けを借りて、約1〜2mmの小片に切除され、減少した。(B)組織消化後の単細胞懸濁液および切除腫瘍の機械的解離;(C)赤血球のリシス後に得られる細胞ペレット;(D) 赤血球および死細胞の除去後に得られた細胞におけるCD45およびCD90.2発現のフローサイトメトリー解析、(E)非癌関連線維芽細胞の枯渇後、および(F)癌関連線維芽細胞の濃縮後、大多数の細胞がCD90.2+ CD45-(青色長方形)略語: CAF= 癌関連線維芽細胞;CD = 分化のクラスター;PE-A = フィコエリスリンの領域;FITC-A = フルオレセインイソチオシアネートの領域<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> 図3:CAFsおよびFAP発現の形態学的解析(A,B)の形態学的形態は、光学顕微鏡(通過2および通過5における異なる合流レベル)によって培養のすべての通路全体でチェックされ、(D)4T1腫瘍細胞と比較した。スケールバー=10μm(C)線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)発現を、採取したCD90.2+CD45-細胞上の分離プロセスの終了時にフローサイトメトリーにより評価し、それらの分子特性を確認した。蛍光閾値を未染色対照細胞(赤色グラフ)に設定し、抗体染色細胞の平均蛍光強度と陽性細胞の割合(FAP+)を定量化した(青グラフ)。略語: CAF= 癌関連線維芽細胞;FAP =線維芽細胞活性化タンパク質;CD = 分化のクラスター;MFI = 平均蛍光強度;Ab = 抗体;FITC-A = フルオレセインイソチオシアネートの領域;FAP+ = FAP陽性細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> 図4: 最適でないCAF分離プロセスの例( A)最終分離工程後のフローサイトメトリー評価は、汚染物質CD90.2-CD45+およびCD90.2-CD45-細胞の存在を明らかにした。 (B)これらの細胞は、培養中の3回目の通過後にCAFに勝った(パネルの左下隅に黒い矢印と差し込み)播種時に小さな丸い形態を持つクローンとして見ることができる。スケールバー= 10 μm略語: CAF = 癌関連線維芽細胞;CD = 分化のクラスター;PE-A = フィコエリスリンの領域;FITC-A = フルオレセインイソチオシアネートの領域<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> 図5: カフスと4T1上のHFnナノケージの結合HFnナノケージをFITCで蛍光標識し、2つの異なるタンパク質抗体比(1:1および1:5)で抗FAP抗体断片(HFn-FAP)で機能し、4°Cで(A)標的CAFおよび(B)4T1細胞で2時間インキュベートした。結合はフローサイトメトリーで評価した。(A)HFn-FAP結合は、両方の抗体断片濃度において、裸のHFnと比較して3倍に有意に増加し、対照的に、4T1細胞において、VF認識によって結合が増強されない、裸のHFnの有意に高い結合が認められた。結果は、3つの独立した実験の平均±標準偏差として報告される。p = 0.0003;°° p = 0.0021 ;°°°p = 0.0008.略語: CAF= 癌関連線維芽細胞;FAP =線維芽細胞活性化タンパク質;HFn = 裸ナノ粒子または共役として使用されるヒトフェリチン重鎖の組換え変異体;HFN-FAP =HFnナノ粒子は、2つのHFn:Fab@FAPモル比、1:1および1:5で調製された抗FAP抗体の可変部分で機能化した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>セル番号(平均±SD)</td>
			<td>抽出収量合計(1節あたり)</td>
		</tr>
<tr>
<td>摘出された腫瘍(ポスト赤血球除去)</td>
			<td>1.27 x 108 ± 9.81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>摘出された腫瘍(死細胞除去後)</td>
			<td>3.01 x 106 ± 9.61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>枯渇後のカクテル</td>
			<td>1.15 x 105 ± 4.95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>投稿のエンリッチメント</td>
			<td>3.00 x 104 ± 1.2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:癌関連線維芽細胞の分離の各ステップ後の総細胞数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>細胞分布(%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>摘出された腫瘍(死細胞除去後)</td>
			<td>1.81 ± 0.98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>枯渇後のカクテル</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0.14 ± 0.13</td>
			<td>0.55 ± 0.63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>投稿のエンリッチメント</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0.09 ± 0.1</td>
			<td>0.09 ± 0.08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:癌関連線維芽細胞の分離の各通過後のCD90.2およびCD45の発現に従った細胞分布。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>細胞分布(%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>投稿のエンリッチメント (プーリングなし)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1.49 ± 0.4</td>
			<td>5.97 ± 1.5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:CD90.2およびCD45発現は、最適でない癌関連線維芽細胞単離実験の後に収集した。

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Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

本論文は、三重陰性乳癌の同種マウスモデルからの原発性癌関連線維芽細胞の単離と培養と、腫瘍微小環境を標的とするように設計された新規ナノ粒子の前臨床試験への応用を目的とする。

標的ナノ粒子の研究のための乳癌の同質性マウスモデルからの原発癌関連線維芽細胞の分離

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

このプロトコルは、ムリン乳癌から一次癌関連線維芽細胞を単離および培養し、腫瘍微小環境を標的とするように設計された新規ナノ粒子をスクリーニングすることを可能にする。原発CAFは、腫瘍間質のインビトロ研究のための最も信頼性の高い、生理学的モデルを表す。このプロトコルでは、最適な歩留まりを達成する方法を説明します。まず、腫瘍解離のための消化ミックスを調製し、チューブをしっかりと閉じた後、溶液中に3〜5ミリメートルの腫瘍断片を浸します。チューブを逆さまにして、腫瘍のすべての部分がキャップに向かってチューブの底にあることを確認します。次に、チューブを適切なハウジングの機械的解離器に取り付け、特に厳しい腫瘍のために設計された解離プログラムを実行します。走った後、チューブを取り外し、逆さまに置き、穏やかな揺れで40分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。その後、適切なハウジングの解離剤にチューブを再び取り付け、硬い腫瘍に対する解離プログラムを2回実行し、手順の最後に大きな組織片が残らないようにします。50ミリリットルチューブ内の40ミクロンの細胞ストレーナーを通してサンプルをフィルターします。その後、フィルターをRPMI 1640培地と遠心分離機の10ミリリットルで洗浄します。遠心分離後、PBEバッファー内のペレットを再懸濁し、PBS、0.5%BSA、および2ミリモルEDTAで構成し、トリパンブルーで細胞をカウントする。滅菌二重蒸留水で20X結合バッファーストック溶液を希釈することにより、死細胞除去結合バッファーを修復します。1X結合バッファーと遠心分離機の 5 ミリリットルで細胞を洗浄します。.遠心分離後、死細胞除去マイクロビーズを0.1ミリリットルで7番目の細胞まで10ミリリットル再懸濁し、室温で15分間インキュベートする。インキュベーション中に、ボンネットの下に磁気スタンドを用意し、先端を下に向けて強磁性分離カラムを吊り下げます。0.5 ミリリットルのコールド バインディング バッファーで列を平衡化し、溶液が流れるまで待ちます。インキュベーション後、400マイクロリットルのコールド結合バッファーをビーズおよび細胞懸濁液に加えます。カラムに全容を積み込み、15ミリリットルのチューブで排水を集めます。0.5ミリリットルのコールドバインディングバッファーでカラムを4回洗浄し、同じチューブ内の総排水量を収集します。非癌関連線維芽細胞の枯渇については、PBSで湿らせた70ミクロンの細胞ストレーナーを用いて細胞懸濁液を濾過し、細胞を遠心分離する。上清を取り除き、冷たいPBEバッファーの80マイクロリットルにペレットを再懸濁します。非腫瘍関連線維芽細胞枯渇カクテルの20マイクロリットルを追加します。よく混ぜ、暗闇の中で15分間摂氏4度でサンプルをインキュベートします。ビーズでのインキュベーション時に、磁気スタンドに強磁性破壊カラムを用意します。2 ミリリットルの冷たい PBE バッファーで列を平衡化し、溶液が流れるまで待ちます。インキュベーション後、ビーズと細胞懸濁液に400マイクロリットルのバッファーを加えます。カラムに全容を積み込み、15ミリリットルのチューブで排水を集めます。PBEを2ミリリットルでカラムを2回洗います。同じチューブに総流出を収集し、排水を遠心します。癌関連線維芽細胞の陽性選択のために、80マイクロリットルの冷たいPBEバッファーのペレットを再懸濁させる。次いで、腫瘍関連線維芽細胞マイクロビーズの20マイクロリットルで、暗い状態で15分間摂氏4度でサンプルをインキュベートする。インキュベーション時に磁気スタンドに強磁性分離カラムを用意し、0.5ミリリットルの冷たいPBEバッファーで平衡化します。インキュベーション後、ビーズと細胞懸濁液に400マイクロリットルのPBEを加えます。ボリューム全体をカラムにロードし、ラベルなしの細胞を15ミリリットルのチューブに流します。0.5ミリリットルのPBEバッファーでカラムを3回洗浄し、同じチューブ内の総排水量を収集します。磁石から柱を取り出し、1.5ミリリットルのチューブに入れる。PBEを1ミリリットルのPBEをカラムに追加し、すぐにプランジャーを列に押し込んでセルをフラッシュします。遠心分離後、適切なDMEMの体積で細胞ペレットを再懸濁し、細胞を組織培養プレートに播種する。細胞密度を顕微鏡で確認し、プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%にして細胞が付着して成長できるようにします。4T1ルシメラーゼ細胞を雌マウスの乳腺脂肪パッドに注入すると、移植の5日後に検出可能な腫瘍塊の増殖につながった。CAF単離に適した犠牲ウィンドウを見つけるために、一方でより高い腫瘍サイズと生物発光イメージングと、一方で新たな腫瘍潰瘍および壊死の間で最適な妥協が求められた。20日目は、分離プロセスの後、細胞回復を最適化する時間ポイントとして設定した。収集された生存細胞のパネル、非腫瘍関連線維芽細胞の枯渇、および腫瘍関連線維芽細胞の濃縮から、CAFの集団を分離するためにさらに2つの通路が必要であった。CAF細胞は、線維芽細胞の典型的な大きな紡錘形形態を明らかにし、4T1腫瘍細胞とは異なっていた。FAP発現は5つの節を超えて、主要なCAF培養が元の特徴を維持していることを確認した。マイクロビーズを用いたインキュベーションの持続時間および温度が維持されなかった場合、分離培養物の中に異なる形態を有するクローンが見出された。これらの汚染物質細胞は、より速く成長し、主要なCAF培養物に勝った。ヒトフェリチンHfn-FAP機能性ナノドラッグと結合するCAFは、裸HFNと比較して1対1、および1対5の抗体断片濃度を3倍に増加させた。反対に、腫瘍4T1細胞については、裸HFNは機能的なHFNよりも高い結合を示した。分離されたCAFの不純物の収率を高めるために、バッファーを冷たく保ち、ビーズでインキュベーション時間を尊重し、最終濃縮ステップの前にカラムあたり最大4つの腫瘍を引き上げます。分離されたCAFは、生体内実験の前臨床を進める前に、結合、取り込み、および薬理学的有効性の期間に複数の候補ナノ医薬品をスクリーニングするために使用することができる。CAF単離により、ナノ粒子を使用して腫瘍微小環境を標的にできるかどうかをテストすることができました。したがって、化学療法との相乗効果で働く新しい標的療法への道を開く。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

肺癌標的化ナノ粒子と光線力学療法の抗がん効能

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

定量的および前臨床治療の縦評価のための転移性腎細胞癌の同系マウスモデル

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

周辺照射による疲労のマウスモデル

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...