Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
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이 연구는 IG 2017-ID. 2017프로젝트 – P.I. 코르시 파비오(P.I. Corsi Fabio)에 따라 라 라이스사 술 칸크로(AIRC) 당 아소시아지오네 이탈리아아나(AirC)에 의해 지원되었다. SM은 자신의 위치를 지원하는 소아 임상 연구 센터 "로미오와 엔리카 Invernizzi"를 인정합니다. AB 감사 AIRC (ID. 20172 프로젝트) 및 연구 펠로우십밀라노 대학. LS와 MS 박사 후 펠로우십은 밀라노 대학의 지원을 받습니다.

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CAF는 세포외 매트릭스를 리모델링하고, 전이 진행을 촉진하고, 종양부위(34)에대한 약물 접근을 제한하는 핵심 플레이어로 부상하고 있다. 그러나, 그들의 이질성 때문에, 그들의 역할은 아직도 논쟁의 여지가 있습니다 - 몇몇 다른 특수형은 종양 억제 역할이 있는 것처럼 보이는 반면, 몇몇 CAF는 종양성 입니다. 이러한 맥락에서, 그들의 고립은 중요한 임상 적 의미를 가질 것이다 암 진행에 있는 그들의 많은 토론된 역할에 더 많은 빛을 비추기 위하여 극단적인 관심사일 수 있습니다12,31. 더욱이, 인간 및 전임상 마우스 종양 모델에서 성공적인 CAF 추출은 또한 새로운 CAF 표적화 약의 개발을 용이하게 할 것입니다. 이 논문은 유방암의 합성 전임상 모델에서 1차 CAF를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 보고합니다. 경험을 바탕으로 세 가지 실험 단계는 대부분 프로토콜의 성공에 영향을 미칩니다.
첫 번째는 컬럼의 응고 및 감속 세포 의 혈중 의 위험과 관련된 세포 현탁액의 응집을 피하기 위해 빠르게 노력하고 있습니다 : 실제로 컬럼을 통과 한 세포가 함께 클러스터링되었을 때, 최적 격리 프로세스의 확률이 증가하고 최종 배양에는 "오염물질"세포 클론이 포함되었습니다. 두 번째는 고갈 통로 후에 상이한 종양에서 세포를 풀링하여 최종 농축 단계에서 통과될 충분한 세포를 보장한다. 마지막 중요한 문제는 높은 세포 밀도에서 추출 된 세포를 도금하는 것입니다, 가장 가능성이 최대 4-5 통로에 대한 세포 성장과 식민지 확장을 강화하기 위해 24 웰 플레이트의 단일 우물에서 시작. 셀이 낮은 밀도에서 시드된 경우 자유 표면에서 확장되어 복제를 신속하게 중단했습니다.
몇몇 연구 결과는 이미 암 발달 및 침략을 승진시키기에 있는 그들의 역할을 공부하기 위하여 인간과 마우스 기원 둘 다의 CAF 추출 방법을 기술했습니다. 이것은 유방암, 흑색종, cholangiocarcinoma 및 췌장 선암35,36,37,38를포함하여 종양의 많은 모형에서 행해졌습니다. 그러나 특정 CAF 마커의 부족과 이질성으로 인해 이러한 프로세스의 결과는 여전히 최적이 아닙니다.
여기서, 분리된 세포는 항FAP 표적화 모니티로 기능화된 HFn 나노케이지의 CAF 표적화 능력을 검증하기 위해 사용되었다. CAFs의 1차 배양물의 사용은 나노약물 최적화의 이 예비 단계에서 생체내에서 직접 수행하는 것보다 훨씬 간단하고 비용 효율적인 결합 실험을 통해 나노전략 전 생체권의 검증을 허용하는 중요한 이점이었다.
이러한 의미에서 CAF에 대한 전 생체 내 검사는 CAF의 최적의 표적을 위해 가장 유망한 나노입자의 스크리닝 및 선택을 허용함으로써 생체 내 동물 실험에 선행될 수 있다. 여기에 제시된 CAF 모델은 활성 약물로 나노입자를 적재할 때 예비 효능 연구에도 사용될 수 있다. 동물은 나중에 생체 분포, 약물 동학 및 효능 연구를 평가하기 위해 나중에만 사용됩니다.
유방암에서 광역학 치료를 위한 페리틴 나노케이지와 전립선암 모델39,40에서독소루비신을 전달하는 펩티드 계 입자 등 여러 CAF 표적 나노약물이 개발되고 있다. 그러나, 많은 연구는 나노 약물 최적화를 위한 세포 플랫폼으로 CAFs의 격리에 초점을 맞추고 있다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 여러 시약 및 재료의 준비 및 구매를 요구하는 시간이 많이 소요되는 프로토콜입니다. 둘째, 4T1 유방 종양에서 CAF의 희소성 때문에, 그들의 수율은 낮습니다. 나노 입자 실험은 1 차적인 CAFs가 노화를 겪고 오랜 시간 동안 문화권에서 유지 될 수 없기 때문에 필요한 세포 수가 달성되는 즉시 계획및 수행되어야합니다. 결론적으로, CAFs 격리, 배양 및 특성화의 이 방법은 암과의 싸움에서 새로운 표적 나노 의약품의 개발을 가속화하는 강력한 도구가 될 수 있습니다.

지난 수십 년 동안 종양 세포를 죽이는 것은 종양 미세 환경이 종양 재발을 유발하고 치료 저항을 유도 할 수 있기 때문에 일반적으로 악성 종양을 근절하기에 충분하지 않다는 것이분명해졌습니다. 새로운 패러다임은 그 때 나타났습니다: 지원 요인의 종양을 박탈하기 위하여 종양 기질을 표적으로 하고, 따라서, 화학요법의 효험을향상3,4,5. 특히, 암관련 섬유아세포(CAFs)는 많은 고형종양6,7에서흥미로운 기질 표적이다. CAF는 성장 인자, 사이토카인 및 화학요법의 분비를 통해 면역 계통의 암세포 및 세포와 상호 작용하는 세포의 매우 이질적인 그룹입니다; 세포 외 매트릭스를 구축하고 리모델링하는 행위 전이 형성8, 9,10,11,12를활성화한다. 종양 유형에 따라 CAFs는 프로 종양 유발 기능을 나타내고, CAFs의 다른 특수형은 종양 억제 기능이있는것으로보인다. 이 이분법을 더 잘 명확히 하기 위해 1차 및 전이성 종양에서 CAF의 철저한 특성화가 중요합니다.
이러한 맥락에서, 새로운 연구 분야는 종양 미세환경을 리모델링할 수 있는 활성분자 및 약물을15,16,17,18로환전시킴으로써 CAF를 표적으로 하거나 파괴하도록 설계된 나노크기의 제제의 개발에 초점을 맞추고있다. 여러 유형의 나노입자는 세포독성 약물에 의한 CAF 절제를 달성하거나, CAF 표적 광역학 요법을 유도하거나, 정지 상태로 되돌거나 TNF 관련 세포멸 유발 리간드 발현을 유도하여 CAF를 재프로그래밍하도록 설계되어16,19. 더욱이, 많은 나노입자가 특정 생물학적 마커를 적극적으로 표적으로 삼을 수 있는 잠재력은 대상에 대한 CAF 서브셋을 선택할 수 있는 희망을 낳는다. CAF에 대한 절대적 특이성은 여전히 의문을 제기하고 있지만, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 프로 종양성 스트로마의 가장 유망한 표적 중 하나이며 나노약물 전달을 조종하기 위해 악용되어 CAF 표적 나노치료제20,21,22의개발경로를 포장하고 있다.
이 논문은 뮤린 유방암의 합성 모델에서 1 차 적인 CAFs의 격리를 설명하고 CAF 마커, FAP를 인식하도록 설계된 나노 입자의 표적 화 능력의 연구에서 그들의 사용을 보고합니다. 페리틴 나노케이지는 포팅모이티(23),24의표면 노출에 의해 전달의 특이성이 형성될 수 있기 때문에, 방법을 설정하는 후보 나노시스템으로 사용된다. 더욱이, 페리틴은 항종양 적용을 위한 우수한 생체적합성 셔틀로 성공적으로 입증되어종양질량(25,26,27)에서탑재하중의 급속한 축적을 유발한다. 현재까지 CAF-targeting 나노시스템의 전임상 연구는 CAFs28,29의일부 면역페노티픽 기능의 발현과 세포 활성화를 유도하기 위해 성장 인자 베타를 변형시키는 배양에서 자극된 섬유아세포 세포주에 대한 시험관제 시험에 관여해 있다. 이 방법은 일반적으로 불멸의 세포주 (NIH3T3, LX-2와 같은)에 적용되며 매우 빠르고 간단하며 몇 시간 또는 며칠 동안 활성화 된 세포를 산출합니다. 제한은 시험관 내 자극이 활성화된 심섬유아세포에 기인하는 몇몇 유전자의 발현을 유도하더라도, 실제 CAF의 모든 생물학적 특징, 특히 생체 내의이질성을 완전히 회수할 수 없다는 것입니다.
또 다른 전략은 인간 또는 마우스 종양 샘플30에서1 차적인 CAFs의 추출을포함합니다 30,31. 이를 통해 CAF 활성화는 생리학적 맥락에서 발생하고 CAF 하위 집단의 이질성이 유지되도록 합니다. 연구 목표에 따르면, CAFs는 다른 소스에서 파생 될 수 있습니다., 따라서 가장 신뢰할 수 있는 상태를 공부 하는 가능성을 제공. 여기에서 보고된 프로토콜은 뮤린 유방암 모형에서 CAFs를 표적으로 하기 위하여 디자인된 새로운 나노 입자의 기능에 대한 예비 평가를 능력을 발휘하고자 하는 과학자를 위해 가치가 있을 것입니다. 고립 된 CAFs암의 동물 모델에서 생체 내 평가를 진행하기에 충분히 유망한 나노 입자를 선별하는 데 유용 할 것입니다. 이는 나노입자 생산의 첫 번째 단계에서 관련이 있으며, 나노 기술자가 최적의 표적 특성을 달성하기 위해 리간 고정 전략을 주로 고려하여 나노입자 설계의 정제를 추진합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

암 관련 섬유아세포(CAFs)는 종양 미세 환경의 맥락에서 핵심 배우이다. 종양 세포에 비해 수감소에도 불구하고, CAFs는 종양 진행을 통제하고 항종양 면역으로부터 보호를 제공합니다. 새로운 항암 전략은 프로 종양 유발 CAF의 절제 또는 CAF 기능 및 활성화 상태의 재프로그래밍을 통해 종양 미세 환경을 재모델링하는 것을 목표로합니다. 유망한 접근법은 CAF를 표적으로 할 수 있는 나노 크기의 전달제의 개발로, 따라서 약물 및 활성 분자의 특정 납품을 허용합니다. 이러한 맥락에서, CAFs의 세포 모델은 이러한 나노 제제의 체외 스크리닝 및 예비 조사를 위한 유용한 도구를 제공할 수 있다.
이 연구는 삼중 음성 유방암의 합성 4T1 뮤린 모델에서 1 차적인 CAFs의 격리 그리고 문화를 기술합니다. 자기 구슬은 해리된 종양으로부터 CAFs를 추출하기 위해 2단계 분리 과정에서 사용되었다. 면역페노티핑 제어는 각 통로 후 유동 세포측정을 사용하여 공정 수율을 검증하기 위해 수행되었다. 고립 된 CAF는 종양 미세 환경을 해결하기 위해 설계된 다른 나노 제제의 표적 화 능력을 연구하기 위해 사용될 수있다. 형광표지 H-페리틴 나노케이지는 이 방법을 설정하는 후보 나노입자로 사용되었다. 나노 입자, 맨손으로 또는 표적 리간드와 결합, CAFs에 그들의 바인딩에 대 한 분석 되었다. 결과는 유방 CAFs의 ex vivo 추출이 종양성 CAFs의 특정 표적화를 위한 나노 입자를 시험하고 검증하는 유용한 시스템이 될 수 있다는 것을 건의합니다.

최적의 CAF 격리를 위한 생체 내 모델 설정 105 4T1-luc 세포의 주입암컷 BALB/c 마우스의 유방 지방 패드로 이식 후 5일 후에 검출 가능한 종양 질량의 성장을 유도한다. BLI에 의한 캘리퍼 및 종양 세포 생존가능성에 의한 종양 부피를 측정함으로써, 종양 성장은 이식 후 1개월 동안 모니터링되었다. CAFs 격리에 적합한 희생 창을 찾기 위해, 한편으로는 종양 크기와 BLI 사이에 최적의 타협을 모색하고 다른 한편으로는 새로운 종양 궤양및 괴사(도1). 괴사 코어는 이식 후 20일 후에 나타나고, 25일과 30일(도 1C에서BLI 이미지에 의해 문서화됨)으로 확대되기 때문에, 20일은 격리 과정 후 세포 회복을 최적화하는 시점으로 설정되었다. 종양 처리의첫 번째 단계 동안 모든 눈에 보이는 괴사 영역을 신중하게 제거한 후에도, 죽은 세포의 높은 백분율은 단일 세포로 해리의 끝에서발견되었다(표 1). 이 백분율은 특히 종양 크기의 증가와 관련이 있을 수 있기 때문에 4T1 모델로 작업할 때 죽은 세포 제거가 항상 필요합니다.
CAF 격리 절차, 문화 및 특성화 최적화 수집된 실행 가능한 세포의 패널에서 CAFs(CD90.2+ CD45)의인구를 격리하기 위해 2개의 더 많은 구절이 필요합니다: 비종양 관련 섬유아세포의 고갈 및 종양 관련 섬유아세포의 농축(도2). 고갈 비드 칵테일은 CD45+ 세포를 효율적으로 제거합니다(총 세포의 67.35% 및 0.69%를 차지하며, 각각 표 2)모든 컬럼에서 단일 종양을 처리하는 데 사용되었습니다. 표 1에도시된 바와 같이, 용출된 세포의 수는 고갈 단계 후 3× 106 에서 1 × 105의 평균에서 떨어졌다. 총 세포 수의 이 거대한 감소로 인해, 농축 단계를 진행하기 전에 단일 튜브에서 적어도 2에서 최대 4 종양으로 수집 된 세포를 풀하는 것이 편리합니다. 이렇게 함으로써, 종양 관련 섬유아세포 구슬을 가진 배양을 위해 적절한 수의 세포를 수득하고 단일 분리 컬럼을 통과하여 CD90.2+ CD45의 최종평균을 93% - CD45-세포(표 2)를얻었다.
일단 조직 배양 판에 시드되면, 이러한 회수된 세포는 플라스틱에 부착되어 있으며 섬유아세포(도3A,B)의전형적인 대형 스핀들 모양의 형태를 드러냈으며 4T1 종양 세포(도3D)와상이하였다. 고갈 후 종양을 풀링하지 않는 것은 종양 관련 섬유아세포 마이크로비드와 세포 수율이 너무 낮아 배양을 확립하는 원인이 된다. 다른 경우에는, 마이크로비드를 가진 잠복기의 지속 시간 및 온도가 신중하게 유지되지 않을 때, 몇몇 비특이적 결합이 생길 수 있습니다. 이러한 경우, 농축 단계는 CD90.2- CD45+ 및 CD90.2- CD45- 세포가 CD90.2+ CAFs (5.97 ± 1.5 및 16.75 ± 1.1과 함께 회복되었다)(그림4 및 표 3)의덜 효율적이고 더 높은 백분율이었다. 이러한 오염 물질 세포는 CAF보다 빠르게 성장하고 1차 CAF 배양(도4C)을통해 우세한 상이한형태(도 4B,검은 화살촉)를 가진 작은 클론의 배양에 대한 존재에 대한 책임이 있을 가능성이 높았다. 이러한 최적 결과 CD90.2 및 CD45 발현뿐만 아니라 농축 과정의 끝과 배양세포 성장 중 세포 형태모두 항상 재검사의 중요성을 확인했습니다.
절연 된 세포의 사용 엔지니어링 나노 약물의 CAF 타겟팅 잠재력을 평가 새로 고립 된 CAFs는 기초 연구에서 약리학 연구에 이르기까지 여러 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 이 그룹의 목표는 특히 CAF를 대상으로 할 수 있는 HFn 나노케이지를 개발하는 것입니다. HFn은 두 가지 다른 단백질에서 특정 항 FAP 항체 단편(HFn-FAP)으로 기능화되었다: 항체 비(더 낮은 1:1 및 더 높은 1:5), 그리고 CAF를 가진 그들의 결합을 시험하였다. FAP가 프로 종양 유발 CAF의 표면 바이오마커로 사용되었기 때문에, 분리된 CAF(그림3C)에대한 FAP 발현을 확인하는 것이 근본적인 중요성이었다. FAP 표현은 1차 CAF 문화가 원래의 특성을 유지한다는 것을 확인하기 위해 문화5개 구절을 따랐다.
HFn에 대한 FAP 기능화는 베어 HFn에 비해 CAF 타겟팅을 향한 상당한 전환에 기여하는 것으로 나타났으며, 항체(1:1)의 양이 적어 이 효과를 관찰하기에 충분하였다(도5A). 그러나, 이는 생체내 종양 모델을 설정하는 데 사용되는 종양 4T1 세포로 관찰되지 않았으며, 이에 따라 HFn은 기능성 HFn(도5B)보다더 높은 결합을 보였다. 이는 4T1 세포에서 FAP 과발현의 부재와 세포내 HFn 흡수를 조절하는 TfR1과의 HFn의 우대 상호 작용으로 인해 가장 가능성이 높았으며, 이는 이그룹(27,33)에의해 널리 보고되었다. 이러한 결과는 유방 CAFs의 1차 배양을 사용하여 종양 미세 환경을 해결하기 위해 설계된 나노 입자의 표적화 능력을 예식적으로 선별하는 유용성을 확인합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> 도 1: 4T1 종양 모델의 설립. 세포(105세포/마우스)는 매머 지방 패드에 주입하였다. 종양 성장은 생체 발광 이미징에 의해 캘리퍼및(B)로종양부피를 측정하여 이식 후 5 일, 10, 15, 20, 25 및 30일에 선행되었다. 종양 부피 및 BLI는 각각 mm3 및 카운트로 표현된다. 결과는 평균 ± SEM(n=6)으로 보고됩니다. (C)BLI 대표 이미지는 세포 이식 후 5, 10, 15, 20, 25 및 30일 후에 얻은 종양 성장을 25일째까지 확인하여 고원에 도달하는 것으로 보인다. 분석의 마지막 시점(30일)에서 BLI는 25일째에 비해 증가하지 않습니다. 20일째부터 괴사와 궤양이 종양의 중심부분에서 눈에 띄기 시작합니다. 색상 배율: 최소 = 1,194, 최대 = 20,462. 약어: BLI = 생물 발광 화상 진찰; SEM = 평균의 표준 오차입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> 그림 2: 종양 샘플 제제 및 격리 된 CAF의 혈류 세포 측정 특성. 종양은 메스의 도움으로 약 1-2mm의 작은 조각(A)으로 절제되고 감소되었다; (B)세포 소화 후 단일 세포 현탁액 및 절제된 종양의 기계적 해리; (C)적혈구의 리시스 후 얻어진 세포 펠릿; (D)적혈구및 죽은세포의 제거 후 얻어진 세포에서 CD45 및 CD90.2 발현의 혈중 세포 분석,(E)비암 관련 섬유아세포의 고갈 후,(F)암 관련 섬유아세포의 농축 후, 세포의 대부분이 CD90.2+ CD45-(청색 사각형)이다. 약어: CAFs= 암 관련 섬유아세포; CD = 차별화 클러스터; PE-A = 피코에리스린 의 영역; FITC-A = 형광이소이소시아네이트 의 영역. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> 도 3: CAFs 및 FAP 발현의 형태학적 분석.(A, B)CAFs 형태는 광학 현미경검사법(통로 2 및 통로 5에서 의 다른 수준의 인플루엔자)에 의해 배양의 모든 구절을 통해 검사하고(D)4T1 종양 세포에 비해; 스케일 바 = 10 μm.(C)섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 발현은 수집된 CD90.2+ CD45-세포에 대한 격리 과정의 끝에 있는 유동 세포측정에 의해 평가되었다. 형광 임계값은 항체 염색 세포(blue graph) 사이에서 평균 형광 강도 및 양성 세포(FAP+)의백분율을 정량화하기 위해 얼룩지지 않은 대조군 세포(red graph)에 설정되었다. 약어: CAFs= 암 관련 섬유아세포; FAP = 섬유아세포 활성화 단백질; CD = 차별화 클러스터; MFI = 평균 형광 강도; Ab = 항체; FITC-A = 형광동체의 면적; FAP + = FAP 양성 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> 도 4: 최적 이하의 CAFs 격리 과정의 예. (A)최종 격리 단계 후 유동 세포 측정 평가는 오염 물질 CD90.2- CD45+ 및 CD90.2- CD45- 세포의 존재를 드러냈다. (B)이들 세포는 시드 시 작은 둥근 형태가 있는 클론으로 볼 수 있다(패널의 왼쪽 하단 모서리에 있는 검은 화살촉과 인세트)이(C)문화권에서 제3통로 후 CAF를 통해 우세했다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: CAF = 암 관련 섬유아세포; CD = 차별화 클러스터; PE-A = 피코에리스린 의 영역; FITC-A = 형광이소이소시아네이트 의 영역. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> 그림 5: CAF 및 4T1에 HFn 나노 케이지의 결합. HFn 나노케이지는 FITC로 형광으로 표시되었고, 두 개의 상이한 단백질 항체 비(1:1 및 1:5)에서 항 FAP 항체 단편(HFn-FAP)으로기능화하고(A)표적 CAFs및(B)4T1 세포를 4°C에서 4°C로 2시간 동안 배양하였다. 결합은 유동 세포측정에 의해 평가되었다. (A)CAFs를 통한 HFn-FAP 결합은 베어 HFn(B)에 비해 두 항체단편 농도모두에서 현저히 증가하며, 4T1 세포에서 베어 HFn의 상당히 높은 결합이 관찰되었으며, 여기서 FAP 인식에 의해 결합이 강화되지 않았다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 보고됩니다. p = 0.0003; °° p = 0.0021; °° p = 0.0008. 약어: CAFs= 암 관련 섬유아세포; FAP = 섬유아세포 활성화 단백질; HFn = 베어 나노 입자 또는 공주로 사용되는 인간 페리틴 중형 체인의 재조합 변형; HFN-FAP = HFn 나노입자는 2개의 HFn:Fab@FAP 어금니비, 1:1 및 1:5로 제조된 항FAP 항체의 가변 부분으로 기능화되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>셀 번호(평균 ± SD)</td>
			<td>추출 수율 합계(통로당)</td>
		</tr>
<tr>
<td>절제된 종양 (적혈구 제거 후)</td>
			<td>1.27 x 108 ± 9.81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>절제된 종양 (사후 죽은 세포 제거)</td>
			<td>3.01 x 106 ± 9.61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>고갈 후 칵테일</td>
			<td>1.15 x 105 ± 4.95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>포스트 농축</td>
			<td>3.00 x 104 ± 1.2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 암 관련 섬유아세포의 각 단계 후에 총 세포 수.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>세포 분포(%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>절제된 종양 (사후 죽은 세포 제거)</td>
			<td>1.81 ± 0.98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>고갈 후 칵테일</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0.14 ± 0.13</td>
			<td>0.55 ± 0.63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>포스트 농축</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0.09 ± 0.1</td>
			<td>0.09 ± 0.08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 암 관련 섬유아세포의 각 통과 후 CD90.2 및 CD45의 발현에 따른 세포 분포.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>세포 분포(%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>포스트 농축(풀링 없음)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1.49 ± 0.4</td>
			<td>5.97 ± 1.5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: CD90.2 및 CD45 발현은 최적 암-관련 섬유아세포 절연 실험 후에 수집하였다.

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Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

이 논문은 삼중 음성 유방암의 합성 뮤린 모델과 종양 미세 환경을 대상으로 설계된 새로운 나노 입자의 전임상 연구를위한 응용 프로그램에서 1 차 암 관련 섬유 아세포의 격리 및 배양에 대한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다.

표적 나노 입자의 연구를 위한 유방암의 합성 Murine 모형에서 1 차적인 암 관련섬유세포의 격리

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

이 프로토콜은 무린 유방암에서 섬유아세포와 관련된 1차 암을 성공적으로 분리하고 배양하여 종양 마이크로 환경을 표적으로 설계된 새로운 나노입자를 선별할 수 있게 한다. 1차 CAF는 종양 기질의 체외 연구를 위한 가장 신뢰할 수 있고 생리적인 모형을 나타냅니다. 이 프로토콜에서는 최적의 수율을 달성하는 방법을 설명합니다.시작하려면 종양 해리를 위한 소화 믹스를 준비하고 튜브를 단단히 닫은 후 용액에 3~5mm 종양 조각을 담그십시오. 튜브를 거꾸로 뒤집어 종양의 모든 조각이 튜브 의 바닥에 캡을 향하고 있는지 확인합니다. 그런 다음 적절한 하우징에서 기계적 해리에 튜브를 부착하고 거친 종양을 위해 특별히 설계된 해리 프로그램을 실행합니다.달리기 후 튜브를 분리하고 거꾸로 놓고 샘플을 섭씨 37도에서 40분 동안 부드러운 흔들림으로 배양합니다. 그런 다음 적절한 하우징에서 해리에 튜브를 다시 부착하고 거친 종양에 대한 해리 프로그램을 두 번 실행하여 절차의 끝에 큰 조직 조각이 남아 있지 않도록합니다. 50 밀리리터 튜브에서 40 미크론 세포 스트레이너를 통해 샘플을 필터링합니다.그런 다음 RPMI 1640 배지 및 원심분리기의 10 밀리리터로 필터를 세척합니다. 원심 분리 후 PBS, 0.5%BSA 및 2개의 밀리머 EDTA로 구성된 PBE 버퍼에서 펠릿을 다시 중단하고 Trypan Blue로 세포를 계산합니다. 멸균 이중 증류수로 20X 바인딩 버퍼 스톡 솔루션을 희석하여 데드 셀 제거 바인딩 버퍼를 복구합니다.1X 결합 버퍼와 원심분리기의 5밀리리터로 셀을 세척합니다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 0.1 밀리리터의 죽은 세포 제거 미생물로 7세포까지 10밀리리터로 재보중단하고 실온에서 15분 동안 배양한다. 인큐베이션 중에 후드 아래에 자기 스탠드를 준비하고, 팁을 아래로 가리키며 강자성 분리 열을 걸어 놓습니다.콜드 바인딩 버퍼0.5 밀리리터로 열을 상화하고 솔루션이 흐를 때까지 기다립니다. 인큐베이션 후, 비드 및 셀 서스펜션에 400 마이크로리터의 냉바인딩 버퍼를 추가합니다. 전체 부피를 컬럼에 적재하고 15 밀리리터 튜브에서 유출물을 수집합니다.콜드 바인딩 버퍼의 0.5 밀리리터로 열을 네 번 세척하고 동일한 튜브에서 총 유출물을 수집합니다. 비암 관련 섬유아데스의 고갈을 위해, PBS로 촉촉한 70 마이크론 세포 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 필터링하고 세포를 원심분리한다. 상체를 제거하고 차가운 PBE 버퍼의 80 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.비 종양 관련 섬유아세포 고갈 칵테일의 20 마이크로리터를 추가합니다. 잘 섞고, 어둠 속에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양하십시오. 구슬이 있는 인큐베이션 동안 마그네틱 스탠드에 강자성 고갈 컬럼을 준비합니다.냉간 PBE 버퍼의 두 밀리리터로 컬럼을 상화하고 용액이 흐를 때까지 기다립니다. 인큐베이션 후 400 마이크로리터의 버퍼를 비드 및 셀 서스펜션에 추가합니다. 전체 부피를 컬럼에 적재하고 15 밀리리터 튜브에서 유출물을 수집합니다.PBE의 두 밀리리터로 컬럼을 두 번 씻으시다. 동일한 튜브에 총 유출물을 수집하고 유출물을 원심분리합니다. 암 관련 섬유아세포의 긍정적인 선택을 위해, 차가운 PBE 완충제의 80 마이크로리터에서 펠릿을 다시 놓아.그런 다음 종양 관련 섬유아세포 마이크로비드의 20 마이크로리터에서, 어둠 속에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다. 인큐베이션 하는 동안, 자기 스탠드에 강자성 분리 열을 준비 하 고 차가운 PBE 버퍼의 0.5 밀리 리터와 그들을 평형. 인큐베이션 후, 비드 및 셀 현탁액에 PBE의 400 마이크로 리터를 추가합니다.전체 볼륨을 컬럼에 로드하고 레이블이 없는 셀이 15 밀리리터 튜브로 흐르게 합니다. 0.5 밀리리터의 PBE 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 동일한 튜브에 총 유출물을 수집합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 1.5 밀리리터 튜브에 놓습니다.PBE 의 밀리리터 1밀리리터를 열에 넣고 플런저를 기둥으로 밀어 내밀어 셀을 플러시합니다. 원심 분리 후, DMEM의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 조직 배양 판에 세포를 시드한다. 현미경의 밑에 세포 밀도를 확인하고, 세포가 고착되고 성장할 수 있도록 37섭씨, 5%이산화탄소에 접시를 놓습니다.4T1 루시파라제 세포를 암컷 마우스의 유방 지방 패드로 주입하여 이식 후 5일 후에 검출 가능한 종양 질량의 성장을 주도하였다. CAF 격리에 적합한 희생 창을 찾기 위해, 한편으로는 종양 크기와 생물 발광 이미징, 그리고 새로운 종양 궤양 및 괴사 사이에 최적의 타협이 모색되었다. 20일은 격리 과정 이후에 세포 회수를 최적화하는 시점으로 설정되었다.수집된 실행 가능한 세포의 패널, 비 종양 관련 섬유아세포의 고갈 및 종양 관련 섬유아세포의 농축에서 CAF의 인구를 격리하기 위해 2개의 더 많은 통로가 필요했습니다. CAF 세포는 섬유아세포의 전형인 대형 스핀들 모양의 형태를 밝혀냈으며, 4T1 종양 세포와 달랐다. FAP 표현은 다섯 구절을 통해 다음 기본 CAF 문화는 원래의 특성을 유지 확인.미생물을 가진 잠복기의 지속 시간 및 온도가 유지되지 않았을 때, 다른 형태를 가진 클론은 고립된 문화 사이에서 찾아냈습니다. 이 오염 물질 세포는 더 빨리 성장하고 1 차 CAF 배양에 지배. 인간 페리틴 Hfn-FAP 기능성 나노 약물과 결합하는 CAF는 맨HFN에 비해 1대 1, 1대 5 항체 단편 농도가 3배 증가했습니다.반대로, 종양 4T1 세포의 경우, 베어 HFN은 기능성 HFN보다 더 높은 결합을 보였다. 격리된 CAF의 수율 불순물을 증가시키기 위해 버퍼를 차갑게 유지하고, 구슬로 잠복시간을 존중하며, 최종 농축 단계 전에 컬럼당 최대 4개의 종양을 당깁니다. 격리된 CAFs는 생체 내 전임상 실험을 진행하기 전에 결합, 섭취 및 약리학적 효능의 용어로 여러 후보 나노 약물을 선별하는 데 사용할 수 있습니다.CAF 절연은 나노 입자가 종양 미세 환경을 표적으로 하는 데 사용될 수 있는지 시험할 수 있었습니다. 따라서 화학 요법과 시너지 효과로 일하는 새로운 표적 치료법으로 가는 길을 열어주기도 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

연구

암 연구학

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

주변 방사선 조사에 의해 유도 된 피로의 마우스 모델

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...