Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) under IG 2017-ID. 20172 prosjekt – P.I. Corsi Fabio. SM anerkjenner Pediatric Clinical Research Center "Romeo and Enrica Invernizzi" som støtter hennes posisjon. AB takker AIRC (ID. 20172 prosjekt) og University of Milan for stipendiatstilling. LS og MS postdoktor- og doktorgradsstipend støttes av Universitetet i Milano.

<ol>
	<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer.">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li><li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+and+their+microenvironments:+tilling+the+soil.+Commentary+re:+A.+M.+Scott+et+al.,+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer.">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li><li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+Sanctuary+of+the+devil.">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li><li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+foes+to+friends:+targeting+cancer-associated+fibroblasts.">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li><li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts:+origins,+functions+and+translational+impact.">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Li, X. -. Y., Hu, S. -. Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance.">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li><li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression.">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li><li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer.">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li><li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment.">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, 186-196 (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics.">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts:+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy.">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).</li><li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment.">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li><li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers.">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027 (2020).</li><li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors.">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li><li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;:+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies.">Fibroblast activation protein-&#945;: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;+in+fibrogenic+disorders+and+cancer:+more+than+a+prolyl-specific+peptidase.">Fibroblast activation protein-&#945; in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li><li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin.">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+nanocages:+A+biological+platform+for+drug+delivery,+imaging+and+theranostics+in+cancer.">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size.">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li><li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoferritin+applications+in+nanomedicine.">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li><li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity.">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy.">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li><li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma.">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li><li>Kov&#225;cs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts.">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).</li><li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax.">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328 (2021).</li><li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells.">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li><li>Dvo&#345;&#225;nkov&#225;, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+(CAFs)+for+biomedical+research.">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li><li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages.">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).</li><li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma.">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li><li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression.">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li><li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control.">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li><li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery.">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

CAF-er dukker opp som nøkkelaktører i ombygging av ekstracellulær matrise, fremmer metastaseprogresjon og begrenser narkotikatilgangen til tumorstedet34. På grunn av deres heterogenitet er deres roller fortsatt kontroversielle - noen CAF-er er tumorigene, mens noen andre undertyper ser ut til å ha en tumor-undertrykkende rolle. I denne sammenhengen kan isolasjonen være av ekstrem interesse for å belyse deres mye omdiskuterte rolle i kreftprogresjon, noe som vil ha viktige kliniske implikasjoner12,31. Videre vil vellykket CAF-ekstraksjon fra menneskelige og prekliniske musesvulstmodeller også lette utviklingen av nye CAF-målrettede legemidler. Denne artikkelen rapporterer en metode for effektivt å isolere og dyrke primære CAF-er fra en preklinisk modell av brystkreft. Basert på erfaring påvirker tre eksperimentelle trinn for det meste suksessen til protokollen.
Den første jobber raskt for å unngå aggregering av cellesuspensjoner knyttet til risikoen for koagulering i kolonnen og bremse celleutløp: Faktisk, når celler som passerte gjennom kolonnen ble gruppert sammen, økte sannsynligheten for en sub-optimal isolasjonsprosess, og de endelige kulturene inneholdt "forurensning" cellekloner. Den andre er å samle celler fra forskjellige svulster etter uttømmingspassasjen for å garantere at nok celler skal passeres gjennom i det endelige berikelsestrinnet. Det endelige kritiske problemet er å plating de ekstraherte cellene ved høye celletettheter, mest sannsynlig fra en enkelt brønn av 24-brønnsplaten for å øke celleveksten og koloniutvidelsen i opptil 4-5 passasjer. Hvis cellene ble sådd ved lave tettheter, utvidet de seg på den frie overflaten og sluttet raskt å replikere.
Flere studier har allerede beskrevet CAF-ekstraksjonsmetoder av både menneskelig og mus opprinnelse, for å studere deres rolle i å fremme kreftutvikling og invasivitet. Dette har blitt gjort i mange typer svulster, inkludert brystkreft, melanom, cholangiokarsinom og bukspyttkjertel adenokarsinom35,36,37,38. På grunn av mangel på spesifikke CAF-markører og deres heterogenitet er resultatene av disse prosessene fortsatt under-optimale.
Her ble de isolerte cellene brukt til å validere CAF-målrettingsevnen til HFn nanocages funksjonalisert med anti-FAP-målrettingsmoieties. Bruken av primære kulturer av CAF-er var en betydelig fordel, slik at valideringen av nanostrategy ex vivo med et mye enklere og kostnadseffektivt bindingseksperiment enn å gjøre det direkte in vivo i denne foreløpige fasen av nanodrugoptimalisering.
I denne forstand kan ex vivo-testing på CAF-er gå foran in vivo-dyreforsøk ved å tillate screening og valg av de mest lovende nanopartiklene for optimal målretting av CAF. CAF-modellen som presenteres her kan også brukes til foreløpige effektstudier, ved lasting av nanopartikler med aktive legemidler. Dyr vil først bli brukt senere for å evaluere biodistribusjon, farmakokinetikk og effektstudier.
Flere CAF-målrettede nanodrugs utvikles, for eksempel ferritin nanocages for fotodynamisk terapi i brystkreft og peptidbaserte partikler for å levere doksorubicin i prostatakreftmodeller39,40. Imidlertid har ikke mange studier fokusert på isolering av CAF-er som celleplattformer for nanodrugoptimalisering.
Denne protokollen har noen begrensninger. For det første er det en tidkrevende protokoll som krever forberedelse og kjøp av flere reagenser og materialer. For det andre, på grunn av knappheten på CAF-er i 4T1 brystsvulsten, er utbyttet lavt. Nanopartikkelforsøk bør planlegges og utføres så snart det nødvendige cellenummeret er oppnådd, da primære CAFer gjennomgår senescence og ikke kan opprettholdes i kulturen i lang tid. Til slutt kan denne metoden for CAFs isolasjon, kultivering og karakterisering være et kraftig verktøy for å akselerere utviklingen av nye målrettede nanomedisiner i kampen mot kreft.

I løpet av de siste tiårene har det blitt klart at å drepe tumorceller vanligvis ikke er tilstrekkelig til å utrydde malignitet, da tumormikromiljøet kan føre til tumorrelaps og indusere terapeutisk motstand1,2. Et nytt paradigme har da dukket opp: målretting av tumor stroma for å frata svulsten av støttende faktorer og dermed øke effekten av kjemoterapeutiske3,4,5. Spesielt er kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er) et interessant stromalt mål i mange solide svulster6,7. CAFs er en veldig heterogen gruppe celler som samhandler med kreftceller og celler i immunsystemet gjennom sekresjon av vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner; bygge opp og ombygge den ekstracellulære matrisen; og aktivere metastasedannelse8,9,10,11,12. Avhengig av tumortypen viser CAF-er pro-tumorogene funksjoner, mens andre undertyper av CAF-er ser ut til å ha tumor-undertrykkende funksjoner13,14. For bedre å avklare denne dikotomien er en grundig karakterisering av CAFs fra primære og metastatiske svulster viktig.
I denne sammenhengen har et fremvoksende forskningsfelt fokusert på utvikling av nanosized midler designet for å målrette og / eller ødelegge CAF-er ved å levere aktive molekyler og legemidler som er i stand til å ombygge tumormikromiljøet15,16,17,18. Flere typer nanopartikler er designet for å oppnå CAF-ablasjon av cytotoksiske legemidler, for å indusere CAF-målrettet fotodynamisk terapi, eller for å omprogrammere CAF-er ved å tilbakestille dem til en passiv tilstand eller indusere TNF-relatert apoptose indusert liganduttrykk, som induserer apoptose av nærliggende kreftceller16,19. Videre gir potensialet til mange nanopartikler å aktivt målrette spesifikke biologiske markører opphav til håpet om å velge CAF-delsett å målrette mot. Selv om dens absolutte spesifisitet for CAF fortsatt er stilt spørsmålstegn ved, er fibroblast aktiveringsprotein (FAP) et av de mest lovende målene for pro-tumorigogen stroma og utnyttes til å styre nanodrug levering, og dermed bane banen for utvikling av CAF-rettet nanotherapeutics20,21,22.
Denne artikkelen beskriver isolering av primære CAF-er fra en modell av murin brystkreft og rapporterer deres bruk i studiet av målrettingsevnen til nanopartikler konstruert for å gjenkjenne CAF-markøren, FAP. Ferritin nanocages brukes som kandidat nanosystemer for å sette opp metoden, da deres spesifisitet av levering kan formes av overflateeksponeringen av målretting av moieties23,24. Videre har ferritins vist seg å være gode biokompatible skyttelbusser for antitumorapplikasjoner, noe som utløser rask opphopning av nyttelasten i tumormassen25,26,27. Til dags dato har prekliniske studier av CAF-målrettede nanosystemer involvert in vitro-testing på fibroblastcellelinjer stimulert i kultur med transformerende vekstfaktor-beta for å indusere celleaktivering og uttrykket av noen immunofenotypiske trekk ved CAFs28,29. Denne metoden brukes vanligvis på udødelige cellelinjer (for eksempel NIH3T3, LX-2) og er ganske rask og enkel, noe som gir aktiverte celler om noen timer eller dager. En begrensning er at selv om in vitro stimulering induserer uttrykket av noen gener som tilskrives aktiverte myofibroblaster, kan den ikke helt rekapitulere alle de biologiske egenskapene til ekte CAFer, spesielt deres heterogenitet in vivo.
En annen strategi innebærer utvinning av primære CAF-er fra menneskelige eller musesvulstprøver30,31. Dette sikrer at CAF-aktivering skjer i en fysiologisk kontekst, og at heterogeniteten til CAF-delpopulasjoner opprettholdes. I henhold til forskningsmålet kan CAF-er være avledet fra forskjellige kilder, og dermed tilby muligheten til å studere den mest pålitelige tilstanden. Protokollen som rapporteres her ville være verdifull for forskere som søker å utføre en foreløpig evaluering av funksjonaliteten til nye nanopartikler designet for å målrette CAF-er fra en murin brystkreftmodell. Isolerte CAF-er vil være nyttige for screening av de nanopartiklene som er lovende nok til å fortsette med in vivo-evaluering i dyremodeller av kreft. Dette vil være relevant i løpet av de første trinnene i nanopartikkelproduksjon, drive nanoteknologiske stoffer mot raffinement av nanopartikkeldesign ved hovedsakelig å vurdere strategien for ligand immobilisering for å oppnå optimale målrettingsegenskaper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er) er sentrale aktører i sammenheng med tumormikromiljøet. Til tross for at de er redusert i antall sammenlignet med tumorceller, regulerer CAF-er tumorprogresjon og gir beskyttelse mot antitumorimmunitet. Nye anticancer strategier tar sikte på å ombygge tumor mikromiljøet gjennom ablasjon av pro-tumorigenic CAFs eller omprogrammering av CAFs funksjoner og deres aktiveringsstatus. En lovende tilnærming er utviklingen av nanosized leveringsmidler som er i stand til å målrette CAF-er, og dermed tillate spesifikk levering av legemidler og aktive molekyler. I denne sammenhengen kan en mobilmodell av CAFer gi et nyttig verktøy for in vitro screening og foreløpig undersøkelse av slike nanoformuleringer.
Denne studien beskriver isolasjonen og kulturen til primær-CAF-er fra den nye 4T1-murinmodellen av trippelnegative brystkreft. Magnetiske perler ble brukt i en 2-trinns separasjonsprosess for å trekke ut CAF-er fra dissosierte svulster. Immunofenotypingskontroll ble utført ved hjelp av strømningscytometri etter hver passasje for å verifisere prosessutbyttet. Isolerte CAF-er kan brukes til å studere målrettingsevnen til forskjellige nanoformuleringer designet for å takle tumormikromiljøet. Fluorescerende merket H-ferritin nanocages ble brukt som kandidat nanopartikler for å sette opp metoden. Nanopartikler, enten nakne eller konjugert med en målrettingsligand, ble analysert for binding til CAF-er. Resultatene tyder på at ex vivo utvinning av bryst CAFs kan være et nyttig system for å teste og validere nanopartikler for spesifikk målretting av tumorigeniske CAF-er.

In vivo-modelloppsett for optimal CAFs-isolasjon Injeksjonen av 105 4T1-luc celler i mammary fett puten av kvinnelige BALB / c mus fører til vekst av en påviselig tumormasse på 5 dager etter implantasjon. Ved å måle tumorvolumet med kalipere og tumorcellens levedyktighet av BLI, ble tumorveksten overvåket i en måned etter implantasjon. For å finne et offervindu som er tilstrekkelig for CAFs isolasjon, ble det søkt et optimalt kompromiss mellom høyere tumorstørrelse og BLI på den ene siden og en fremvoksende tumorsår og nekrose på den annen side (Figur 1). Ettersom en nekrotisk kjerne vises 20 dager etter implantasjon, og den forstørres etter 25 og 30 dager (som dokumentert av BLI-bilder i figur 1C), ble dag 20 satt som tidspunkt for å optimalisere cellegjenoppretting etter isolasjonsprosessen. Selv etter nøye fjerning av alle synlige nekrotiske områder under de første trinnene i tumorhåndtering ex vivo, ble det funnet en høy prosentandel av døde celler på slutten av dissosiasjon i enkeltceller (Tabell 1). Siden denne prosentandelen kan være relevant, spesielt med økningen i tumorstørrelse, er fjerning av døde celler alltid nødvendig når du arbeider med 4T1-modellen.
Optimalisering av CAFs isolasjonsprosedyre, kultur og karakterisering To passasjer er nødvendig for å isolere populasjonen av CAFer (CD90.2+ CD45-) fra panelet av innsamlede levedyktige celler: uttømming av ikke-tumor-assosierte fibroblaster og berikelse av tumor-assosierte fibroblaster (Figur 2). Uttømmingsperlecocktailen fjerner effektivt CD45+ celler (som står for henholdsvis 67,35% og 0,69% av totale celler før og etter uttømming, henholdsvis tabell 2), og ble alltid brukt til å behandle en enkelt svulst i hver kolonne. Som vist i tabell 1falt antall eluterte celler fra et gjennomsnitt på 3 × 106 til 1 × 105 etter uttømmingstrinnet. På grunn av denne massive nedgangen i totalt cellenummer, er det praktisk å samle de innsamlede cellene fra minst 2 til maksimalt 4 svulster i et enkelt rør før du fortsetter med berikelsestrinnet. Ved å gjøre det ble det oppnådd et tilstrekkelig antall celler for inkubasjon med tumorrelaterte fibroblastperler og passert gjennom en enkelt separasjonskolonne for å oppnå et siste gjennomsnitt på 93% av CD90,2+ CD45- celler (Tabell 2).
Når de er sådd på vevskulturplater, gjenopprettet disse cellene festet til plasten og avslørte en stor spindelformet morfologi som er typisk for fibroblaster (Figur 3A,B) og forskjellig fra 4T1 tumorceller (Figur 3D). Ikke å samle svulster etter uttømming fører til at det cellulære utbyttet med tumor-assosierte fibroblastmikrober er for lave til å etablere en kultur. I andre tilfeller, når varigheten og temperaturen på inkubasjonene med mikrober ikke opprettholdes nøye, kan det oppstå noen ikke-spesifikke bindinger. I slike tilfeller var berikelsestrinnene mindre effektive og høyere prosentandeler av CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45- cellene ble gjenopprettet sammen med CD90.2+ CAF-ene (henholdsvis 5,97 ± 1,5 og 16,75 ± 1,1) (figur 4 og tabell 3). Disse forurensningscellene var sannsynligvis ansvarlige for tilstedeværelsen i kulturen av små kloner med forskjellig morfologi (Figur 4B, svarte pilspisser) som vokste raskere enn CAF-er og seiret over den primære CAF-kulturen (Figur 4C). Disse suboptimale resultatene bekreftet viktigheten av alltid å dobbeltsjekke både CD90.2- og CD45-uttrykket, samt cellemorfologi på slutten av berikelsesprosessen og under cellevekst i kulturen.
Bruk av isolerte celler for å evaluere CAF-målrettingspotensialet til konstruerte nanodrugs De nyisolerte CAF-ene kan brukes til flere bruksområder som spenner fra grunnleggende forskning til farmakologiske studier. Denne gruppens mål er å utvikle HFn nanocages som spesifikt kan målrette CAF-er. HFn ble funksjonalisert med et spesifikt anti-FAP antistofffragment (HFn-FAP) ved to forskjellige protein:antistoffforhold (en lavere 1:1 og en høyere 1:5), og deres binding med CAFs ble testet. Ettersom FAP ble brukt som overflatebiomarkør for pro-tumorige CAF-er, var det av grunnleggende betydning å sjekke FAP-uttrykk på isolerte CAF-er (Figur 3C). FAP-uttrykket ble fulgt over 5 passasjer i kulturen for å bekrefte at den primære CAF-kulturen opprettholdt sine opprinnelige egenskaper.
FAP-funksjonalisering på HFn ble funnet å bidra til et betydelig skifte mot CAF-målretting sammenlignet med bare HFn, og den nedre mengden antistoff (1:1) var nok til å observere denne effekten (Figur 5A). Dette ble imidlertid ikke observert med tumor 4T1-cellene som brukes til å sette opp in vivo tumor-modellen, hvor bare HFn viste høyere binding enn funksjonalisert HFn (Figur 5B). Dette skyldtes mest sannsynlig fraværet av FAP-overekspression i 4T1-celler og fortrinnsvis interaksjon av HFn med TfR1, som regulerer HFn-opptak i celler, som mye rapportert av denne gruppen27,33. Disse resultatene bekrefter nytten av å bruke primære kulturer av bryst-CAFer for å foreløpig screene målrettingsevnen til nanopartikler designet for å takle tumormikromiljøet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Figur 1: Etablering av 4T1 tumormodellen. Celler (105 celler/mus) ble injisert i fettputen hos pattedyret. Tumorvekst ble fulgt på dag 5, 10, 15, 20, 25 og 30 etter implantasjon (A) ved å måle tumorvolum med kalipere og (B) ved bioluminescensavbildning. Tumorvolumer og BLI uttrykkes som henholdsvis mm3 og teller. Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± SEM (n=6). (C) BLI representative bilder oppnådd 5, 10, 15, 20, 25 og 30 dager etter celleimplantasjon bekrefter tumorvekst til dag 25, når det ser ut til å nå et platå. Ved siste analysetidspunkt (30 dager) øker ikke BLI sammenlignet med dag 25. Fra dag 20 begynner områder med nekrose og sårdannelse å bli synlige i den sentrale delen av svulsten. Fargeskala: Min = 1 194, Maks = 20 462. Forkortelser: BLI = bioluminescensavbildning; SEM = standardfeil av gjennomsnittet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Figur 2: Tumorprøvepreparering og strømningscytometrikarakterisering av isolerte CAFer. Svulster ble utskilt og redusert til (A) små biter på ca. 1-2 mm ved hjelp av en skalpell; (B) encellet suspensjon etter vev fordøyelse og mekanisk dissosiasjon av en utskilt svulst; (C) cellepellet oppnådd etter lysis av røde blodlegemer; (D) strømning cytometri analyse av CD45 og CD90.2 uttrykk i celler oppnådd etter fjerning av røde blodlegemer og døde celler, (E) etter uttømming av ikke-kreft-assosierte fibroblaster, og (F) etter berikelse av kreft-assosierte fibroblaster, hvor de fleste celler er CD90.2+ CD45- (blå rektangel). Forkortelser: CAFs = kreft-assosierte fibroblaster; CD = differensieringsklynge; PE-A = arealet av phycoerythrin; FITC-A = områder av fluorescein isothiocyanate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Figur 3: Morfologisk analyse av CAF og FAP-uttrykk. (A, B) CAFs morfologi ble sjekket gjennom alle kulturpassasjer ved optisk mikroskopi (ulike nivåer av samløp ved passasje 2 og passasje 5) og sammenlignet med (D) 4T1 tumorceller; skalastenger = 10 μm. (C) Fibroblast aktiveringsprotein (FAP) uttrykk ble evaluert av strømningscytometri på slutten av isolasjonsprosessen på den innsamlede CD90,2+ CD45- celler for å bekrefte deres molekylære egenskaper. En fluorescensterskel ble satt på unstained kontrollceller (rød graf) for å kvantifisere gjennomsnittlig fluorescensintensitet og prosentandelen positive celler (FAP+) blant antistofffargede celler (blå graf). Forkortelser: CAFs = kreft-assosierte fibroblaster; FAP = fibroblast aktiveringsprotein; CD = differensieringsklynge; MFI = gjennomsnittlig fluorescensintensitet; Ab = antistoff; FITC-A = område av fluorescein isothiocyanate; FAP+ = FAP-positive celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Figur 4: Eksempel på en sub-optimal CAFs isolasjonsprosess. (A) Flow cytometrievaluering etter det endelige isolasjonstrinnet avslørte tilstedeværelsen av forurensning CD90.2- CD45+ og CD90.2- CD45- celler. (B) Disse cellene kan sees på som kloner med liten rund morfologi ved såing (svarte pilspisser og innside i nedre venstre hjørne av panelet) som (C) seiret over CAFer etter den tredje passasjen i kulturen. Skalastenger = 10 μm. Forkortelser: CAF = kreftrelatert fibroblast; CD = differensieringsklynge; PE-A = arealet av phycoerythrin; FITC-A = områder av fluorescein isothiocyanate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Figur 5: Binding av HFn nanocages på CAF-er og 4T1. HFn nanocages ble fluorescerende merket med FITC, funksjonalisert med et anti-FAP antistofffragment (HFn-FAP) ved to forskjellige protein-antistoffforhold (1:1 og 1:5), og inkubert med (A) mål CAFs og (B) 4T1 celler ved 4 °C i 2 timer. Binding ble evaluert ved strømningscytometri. (A) HFn-FAP binding med CAF-er er betydelig økt ved begge antistoff fragmentkonsentrasjoner med tre ganger sammenlignet med bare HFn. (B) i kontrast, en betydelig høyere binding av bare HFn ble observert i 4T1 celler, hvor binding er ikke forbedret av FAP anerkjennelse. Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Forkortelser: CAFs = kreft-assosierte fibroblaster; FAP = fibroblast aktiveringsprotein; HFn = rekombinant variant av menneskelig ferritin tungt kjede som brukes som bar nanopartikkel eller konjugert; HFN-FAP = HFn nanopartikler funksjonalisert med den variable delen av et anti-FAP-antistoff fremstilt ved to HFn:Fab@FAP molarforhold, 1:1 og 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Celletall (gjennomsnittlig ± SD)</td>
			<td>Ekstraksjonsutbytte totalt (per passering)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utskilt svulst (Post rød blodlegeme fjerning)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utskilt svulst (Post dead cell removal)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail etter uttømming</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etterberikelse</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Totalt celleantall etter hvert trinn i isolasjon av kreftrelaterte fibroblaster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cellefordeling (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utskilt svulst (Post dead cell removal)</td>
			<td>1.81 ± 0,98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail etter uttømming</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0,14 ± 0,13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etterberikelse</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Cellefordeling i henhold til uttrykk for CD90.2 og CD45 etter hver passasje av isolering av kreftrelaterte fibroblaster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cellefordeling (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etterberikelse (ingen pooling)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1,49 ± 0,4</td>
			<td>5,97 ± 1,5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: CD90.2- og CD45-uttrykk for celler samlet inn etter et sub-optimalt kreftrelatert fibroblastisolasjonsforsøk.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Denne artikkelen tar sikte på å gi en protokoll for isolering og kultur av primærkreft-assosierte fibroblaster fra en syngeneisk murine modell av trippel-negativ brystkreft og deres anvendelse for preklinisk studie av nye nanopartikler designet for å målrette svulstmikromiljøet.

Isolering av primærkreft-assosierte fibroblaster fra en syngeneisk murinemodell av brystkreft for studiet av målrettede nanopartikler

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Denne protokollen gjør det mulig å lykkes med å isolere og kultur primærkreft assosiert fibroblaster fra murin brystkreft, for å screene nye nanopartikler designet for å målrette svulstmikromiljøet. Primær CAF representerer den mest pålitelige og fysiologiske modellen for in vitro-studier av tumor stroma. I denne protokollen beskriver vi hvordan vi oppnår et optimalt utbytte.Til å begynne med, lag en fordøyelsesblanding for tumordissosiasjon, og suge de tre til fem millimeter tumorfragmentene i løsningen etter tett lukking av røret. Snu røret opp ned, og kontroller at alle svulststykkene er på bunnen av røret mot hetten. Fest deretter røret til en mekanisk dissosiator i riktig hus, og kjør et dissosiasjonsprogram spesielt designet for tøffe svulster.Etter løpet løsner du røret og legger det opp ned for å inkubere prøven ved 37 grader Celsius i 40 minutter med mild risting. Fest deretter røret til dissociater i riktig hus, og kjør dissosiasjonsprogrammet for tøffe svulster to ganger, slik at ingen store vevsstykker forblir på slutten av prosedyren. Filtrer prøven gjennom en 40 mikron cellesil i et 50 milliliterrør.Vask deretter filteret med 10 milliliter RPMI 1640 medium og sentrifuge. Etter sentrifugering, resuspend pellet i PBE buffer, sammensatt av PBS, 0,5%BSA, og to millimolar EDTA, og telle cellene med Trypan Blue. Reparer bindingsbufferen for fjerning av døde celler ved å fortynne 20X bindingsbufferlagerløsningen med sterilt dobbelt destillert vann.Vask cellene med fem milliliter 1X bindingsbuffer og sentrifuge. Etter sentrifugering, resuspend cellepellet med 0,1 milliliter død celle fjerning mikrober for opptil 10 til syvende celler, og inkubere ved romtemperatur i 15 minutter. Under inkubasjonen, lag et magnetisk stativ under hetten, og heng ferromagnetiske separasjonskolonner til den, med spissene pekende ned.Likevekt kolonnene med 0,5 milliliter kaldbindingsbuffer, og vent til løsningen har strømmet gjennom. Etter inkubasjon, tilsett 400 mikroliter kaldbindingsbuffer til perle og celleoppheng. Legg hele volumet på kolonnen og samle avløpet i et 15 milliliterrør.Vask kolonnen fire ganger med 0,5 milliliter kaldbindingsbuffer, og samle det totale avløpet i samme rør. For uttømming av ikke-kreftrelaterte fibroblaster, filtrer cellefjæringen ved hjelp av en 70 mikron cellesil fuktet med PBS, og sentrifuger cellene. Fjern supernatanten og resuspend pellet i 80 mikroliter kald PBE buffer.Tilsett 20 mikroliter ikke tumor-assosiert fibroblast uttømming cocktail. Bland godt, og inkuber prøven ved 4 grader Celsius i 15 minutter i mørket. Under inkubasjonen med perler, lag ferromagnetiske uttømmingskolonner på et magnetisk stativ.Likevekt kolonnene med to milliliter kald PBE-buffer og vent til løsningen har strømmet gjennom. Etter inkubasjon, tilsett 400 mikroliter buffer til perle og celle suspensjon. Legg hele volumet på kolonnen og samle avløpet i et 15 milliliterrør.Vask kolonnen to ganger med to milliliter PBE. Samle det totale avløpet i samme rør, og sentrifuger avløpet. For det positive utvalget av kreftrelaterte fibroblaster, resuspender pellet i 80 mikroliter kald PBE buffer.Deretter ved 20 mikroliter tumor-assosierte fibroblaster mikrober, og inkubere prøvene ved 4 grader Celsius i 15 minutter i mørket. Under inkubasjon, lag ferromagnetiske separasjonskolonner på et magnetisk stativ og likevekt dem med 0,5 milliliter kald PBE-buffer. Etter inkubasjon, tilsett 400 mikroliter PBE til perle og celle suspensjon.Legg hele volumet på kolonnen, og la de umerkede cellene strømme gjennom i et 15 milliliterrør. Vask kolonnen tre ganger med 0,5 milliliter PBE-buffer, og samle det totale avløpet i samme rør. Fjern kolonnen fra magneten og legg den i et 1,5 milliliterrør.Tilsett en milliliter PBE på kolonnen, og skyv stempelet umiddelbart inn i kolonnen for å skylle cellene ut. Etter sentrifugering, resuspend cellepellet i et passende volum av DMEM, og frø cellene i en vev kultur plate. Kontroller celletettheten under et mikroskop, og plasser platen på 37 grader Celsius, og 5% karbondioksid for å la cellene feste seg og vokse.Injeksjonen av 4T1 luciferaseceller i brystfettputen til kvinnelige mus førte til veksten av en påviselig tumormasse fem dager etter implantasjon. For å finne et offervindu som er tilstrekkelig for CAF-isolasjon, ble det søkt et optimalt kompromiss mellom høyere tumorstørrelse og bioluminescensavbildning på den ene siden, og en fremvoksende tumorsår og nekrose på den annen side. Dag 20 ble satt som tidspunkt for å optimalisere cellegjenoppretting, etter isolasjonsprosessen.To passasjer var nødvendig for å isolere befolkningen i CAFs, fra panelet av samlede levedyktige celler, uttømming av ikke-tumorrelaterte fibroblaster og berikelse av tumorrelaterte fibroblaster. CAF-celler avslørte stor spindelformet morfologi, typisk for fibroblaster, og var forskjellig fra 4T1 tumorceller. FAP-uttrykk fulgt over fem passasjer bekrefter at den primære CAF-kulturen opprettholdt sine opprinnelige egenskaper.Når varighet og temperatur på inkubasjonene med mikrober ikke ble opprettholdt, ble kloner med forskjellig morfologi funnet blant den isolerte kulturen. Disse forurensningscellene vokste raskere og seiret over den primære CAF-kulturen. CAFs binding med Human Ferritin Hfn-FAP funksjonalisert nanomedisin økte med en-til-en, og en-til-fem antistoff fragment konsentrasjoner med tre ganger, sammenlignet med bare HFN.Tvert imot, for tumor 4T1 celler, bar HFN viste høyere binding enn funksjonalisert HFN. For å øke utbyttet urenhet av isolert CAF, holde buffere kalde, respektere inkubasjonstid med perler, og trekke opp til fire svulster per kolonne før det endelige berikelsestrinnet. De isolerte CAF-ene kan brukes til å screene flere kandidat nanomedisiner når det gjelder binding, opptak og farmakologisk effekt før du fortsetter med prekliniske in vivo-eksperimenter.CAF-isolasjon tillot oss å teste om nanopartikler kan brukes til å målrette tumormikromiljøet. Dermed baner veien til nye målrettede terapier som arbeider i synergi med kjemoterapi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancer Effekten av fotodynamisk behandling med Lung Cancer-Målrettet Nanopartikler

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection modell for å studere levermetastaser fra brystkreft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

En syngene mus modell av metastatisk nyrecellekarsinom for Kvantitativ og Langsgående vurdering av Prekliniske terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musemodell av Fatigue indusert av Peripheral Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En Syngeneic bukspyttkjertelkreft musemodell å studere virkningene av Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En Bioluminescent og fluorescerende Orthotopic Syngeneic murint modell av Androgen-avhengige og kastrering-resistente prostatakreft

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av Orthotopic Homograft (Syngeneic) av Murine primære KPC bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma av flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantasjon av Syngeneic lunge Adenocarcinoma celler å studere PD-L1 uttrykk

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som en mer fysiologisk system for kreft-Associated fibroblaster differensiering og Invasion in vitro studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...