Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) sob o projeto IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio. A SM reconhece o centro de Pesquisa Clínica Pediátrica "Romeu e Enrica Invernizzi" que apoia sua posição. AB agradece airc (projeto ID. 20172) e Universidade de Milão para bolsa de pesquisa. As bolsas de pós-doutorado e doutorado de LS e MS são apoiadas pela Universidade de Milão.

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Os autores não têm nada a revelar.

Os CAFs estão emergindo como atores-chave na remodelação da matriz extracelular, promovendo a progressão da metástase e limitando o acesso de medicamentos ao local do tumor34. No entanto, devido à sua heterogeneidade, seus papéis ainda são controversos — alguns CAFs são tumorigênicos, enquanto alguns outros subtipos parecem ter um papel supressivo do tumor. Nesse contexto, seu isolamento pode ser de extremo interesse para lançar mais luz sobre seu tão debatido papel na progressão do câncer, que terá importantes implicações clínicas12,31. Além disso, a extração bem-sucedida do CAF a partir de modelos de tumor de camundongos humanos e pré-clínicos também facilitaria o desenvolvimento de novos medicamentos direcionados ao CAF. Este artigo relata um método para isolar e cultivar eficientemente cafs primários de um modelo pré-clínico sintônico de câncer de mama. Com base na experiência, três etapas experimentais influenciam principalmente o sucesso do protocolo.
O primeiro está trabalhando rápido para evitar a agregação de suspensões celulares associadas ao risco de coagulação na coluna e efflux celular lento: na verdade, quando as células que passavam pela coluna foram agrupadas, a probabilidade de um processo de isolamento sub-ideal aumentou, e as culturas finais continham clones celulares "contaminantes". A segunda é a junção de células de diferentes tumores após a passagem de esgotamento para garantir que células suficientes sejam passadas na etapa final de enriquecimento. A questão crítica final é emplacar as células extraídas em altas densidades celulares, provavelmente a partir de um único poço da placa de 24 poços para impulsionar o crescimento celular e a expansão da colônia para até 4-5 passagens. Se as células foram semeadas em baixas densidades, elas se expandiram na superfície livre e rapidamente pararam de se replicar.
Vários estudos já descreveram métodos de extração de CAF de origem humana e camundongo, para estudar seu papel na promoção do desenvolvimento do câncer e da invasividade. Isso tem sido feito em muitos tipos de tumores, incluindo câncer de mama, melanoma, colangiocarcinoma e adenocarcinoma pancreático35,36,37,38. No entanto, devido à falta de marcadores específicos do CAF e à sua heterogeneidade, os resultados desses processos ainda são sub-ideais.
Aqui, as células isoladas foram utilizadas para validar a capacidade de direcionamento do CAF de nanocálgenas HFn funcionalizadas com moieties anti-FAP. O uso de culturas primárias de CAFs foi uma vantagem significativa, permitindo a validação da nanostrategy ex vivo com um experimento de ligação muito mais simples e econômico do que fazê-lo diretamente in vivo nesta fase preliminar de otimização de nanodrogas.
Nesse sentido, testes ex vivo em CAFs podem preceder experimentos in vivo animal, permitindo a triagem e seleção das nanopartículas mais promissoras para o direcionamento ideal do CAF. O modelo CAF aqui apresentado também pode ser utilizado para estudos preliminares de eficácia, ao carregar nanopartículas com drogas ativas. Os animais só serão usados mais tarde para avaliar estudos de biodistribução, farmacocinética e eficácia.
Vários nanodrogas alvo de CAF estão sendo desenvolvidas, como nanocálgenas de ferritina para terapia fotodinâmica no câncer de mama e partículas à base de peptídeos para fornecer doxorubicina nos modelos de câncer de próstata39,40. No entanto, poucos estudos se concentraram no isolamento dos CAFs como plataformas celulares para otimização de nanodrogas.
Este protocolo tem algumas limitações. Primeiro, é um protocolo demorado, exigindo a preparação e compra de vários reagentes e materiais. Em segundo lugar, devido à escassez de CAFs no tumor de mama 4T1, seu rendimento é baixo. Os experimentos de nanopartículas devem ser planejados e realizados assim que o número de células necessário for alcançado, uma vez que os CAFs primários sofrem senescência e não podem ser mantidos na cultura por muito tempo. Em conclusão, esse método de isolamento, cultivo e caracterização dos CAFs pode ser uma ferramenta poderosa para acelerar o desenvolvimento de novas nanomedicinas direcionadas na luta contra o câncer.

Durante as últimas décadas, ficou claro que matar células tumorais geralmente não é suficiente para erradicar a malignidade, pois o microambiente tumoral pode provocar recaída tumoral e induzir resistência terapêutica1,2. Em seguida, surgiu um novo paradigma: direcionar o estroma tumoral para privar o tumor de fatores de apoio e, assim, aumentar a eficácia da quimioterápica3,4,5. Em particular, os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são um alvo estromacal interessante em muitos tumores sólidos6,7. Os CAFs são um grupo muito heterogêneo de células que interagem com células cancerosas e células do sistema imunológico através da secreção de fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas; construir e remodelar a matriz extracelular; e permitir a formação de metástase8,9,10,11,12. Dependendo do tipo de tumor, os CAFs apresentam funções pró-tumorigênicas, enquanto outros subtipos de CAFs parecem ter funções supressivas de tumor13,14. Para esclarecer melhor essa dicotomia, é importante uma caracterização completa dos CAFs de tumores primários e metastáticos.
Nesse contexto, um campo emergente de pesquisa tem focado no desenvolvimento de agentes nanosized projetados para atingir e/ou destruir CAFs, fornecendo moléculas ativas e drogas capazes de remodelar o microambiente tumoral15,16,17,18. Vários tipos de nanopartículas foram projetadas para alcançar a ablação do CAF por meio de drogas citotóxiximicas, para induzir a terapia fotodinâmica direcionada ao CAF, ou para reprogramar CAFs revertendo-os para um estado quiescente ou induzindo a apoptose induzida pela TNF, expressão de ligante induzida pela Apoptose, que induz a apoptose das células cancerígenas vizinhas16,19. Além disso, o potencial de muitas nanopartículas para atingir ativamente marcadores biológicos específicos dá origem à esperança de selecionar subconjuntos da CAF para atingir. Embora sua especificidade absoluta para o CAF ainda seja questionada, a proteína de ativação do fibroblasto (FAP) é um dos alvos mais promissores do estroma pró-tumorigênico e é explorada para orientar a entrega de nanodrogas, pavimentando assim o caminho para o desenvolvimento da nanoterapêutica direcionada ao CAF20,21,22.
Este artigo descreve o isolamento dos CAFs primários de um modelo síngênico de câncer de mama murina e relata seu uso no estudo da capacidade de segmentação de nanopartículas projetadas para reconhecer o marcador CAF, FAP. As nanocagens de ferritina são usadas como nanosistemas candidatos para configurar o método, pois sua especificidade de entrega pode ser moldada pela exposição superficial de moieties de alvo23,24. Além disso, os ferritins têm sido comprovados com sucesso como excelentes transportes biocompatíveis para aplicações antitumorais, desencadeando o rápido acúmulo da carga na massa tumoral25,26,27. Até o momento, estudos pré-clínicos de nanosistemas direcionados ao CAF envolveram testes in vitro em linhas celulares de fibroblasto estimulados na cultura com a transformação do fator de crescimento-beta para induzir a ativação celular e a expressão de algumas características imunofenópicas dos CAFs28,29. Este método é geralmente aplicado a linhas celulares imortalizadas (como NIH3T3, LX-2) e é bastante rápido e simples, produzindo células ativadas em poucas horas ou dias. Uma limitação é que, embora a estimulação in vitro induz a expressão de alguns genes atribuídos a miofibroblasts ativados, não pode recapitular inteiramente todas as características biológicas dos CAFs reais, especialmente sua heterogeneidade in vivo.
Outra estratégia envolve a extração de CAFs primários de amostras de tumor humanos ou camundongos30,31. Isso garante que a ativação do CAF ocorra em um contexto fisiológico, e que a heterogeneidade das subpopulações do CAF seja mantida. De acordo com o objetivo da pesquisa, os CAFs podem ser derivados de diferentes fontes, oferecendo assim a possibilidade de estudar a condição mais confiável. O protocolo aqui relatado seria valioso para cientistas que buscam realizar uma avaliação preliminar da funcionalidade de novas nanopartículas projetadas para atingir CAFs de um modelo de câncer de mama murina. CAFs isolados seriam úteis para o rastreamento dessas nanopartículas que são promissoras o suficiente para proceder à avaliação in vivo em modelos animais de câncer. Isso será relevante durante os primeiros passos da produção de nanopartículas, levando os nanotecnólogos para o refinamento do design de nanopartículas, considerando principalmente a estratégia de imobilização de ligantes e para alcançar propriedades de mira ideais.

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		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
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			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são atores-chave no contexto do microambiente tumoral. Apesar de ter sido reduzido em número em comparação com as células tumorais, os CAFs regulam a progressão do tumor e fornecem proteção contra imunidade antitumoral. Estratégias anticancerígenas emergentes visam remodelar o microambiente tumoral através da ablação de CAFs pró-tumorigênicos ou reprogramação das funções dos CAFs e seu status de ativação. Uma abordagem promissora é o desenvolvimento de agentes de entrega nanosized capazes de atingir CAFs, permitindo assim a entrega específica de medicamentos e moléculas ativas. Neste contexto, um modelo celular de CAFs pode fornecer uma ferramenta útil para triagem in vitro e investigação preliminar de tais nanoformulações.
Este estudo descreve o isolamento e a cultura dos CAFs primários do modelo síngênico 4T1 murine de câncer de mama triplo-negativo. Contas magnéticas foram usadas em um processo de separação em 2 etapas para extrair CAFs de tumores dissociados. O controle de imunofenofoteping foi realizado utilizando-se a citometria de fluxo após cada passagem para verificar o rendimento do processo. CaFs isolados podem ser empregados para estudar a capacidade de segmentação de diferentes nanoformulações projetadas para combater o microambiente tumoral. Nanocages de H-ferritin fluorescentes foram usadas como nanopartículas candidatas para configurar o método. Nanopartículas, nuas ou conjugadas com ligante de alvo, foram analisadas para sua vinculação aos CAFs. Os resultados sugerem que a extração ex vivo de CAFs mamários pode ser um sistema útil para testar e validar nanopartículas para o direcionamento específico de CAFs tumorigênicos.

Configuração do modelo in vivo para o isolamento ideal dos CAFs A injeção de 10 células 4T1-luc na almofada de gordura mamária de camundongos BALB/c fêmeas leva ao crescimento de uma massa tumoral detectável em 5 dias após a implantação. Medindo o volume do tumor por pinças e a viabilidade da célula tumoral pela BLI, o crescimento do tumor foi monitorado por um mês após a implantação. Para encontrar uma janela de sacrifício adequada para o isolamento dos CAFs, foi buscado um comprometimento ideal entre maior tamanho do tumor e BLI por um lado e uma ulceração e necrose tumoral emergentes por outro lado(Figura 1). Como um núcleo necrosado aparece 20 dias após a implantação, e aumenta aos 25 e 30 dias (conforme documentado pelas imagens bli na Figura 1C), o dia 20 foi definido como o ponto de tempo para otimizar a recuperação celular após o processo de isolamento. Mesmo depois de remover cuidadosamente todas as áreas necróticas visíveis durante os primeiros passos do tratamento do tumor ex vivo,uma alta porcentagem de células mortas foi encontrada no final da dissociação em células únicas(Tabela 1). Como esse percentual pode ser relevante, especialmente com o aumento do tamanho do tumor, a remoção de células mortas é sempre necessária ao trabalhar com o modelo 4T1.
Otimização do procedimento de isolamento, cultura e caracterização dos CAFs Mais duas passagens são necessárias para isolar a população de CAFs (CD90.2+ CD45-) do painel de células viáveis coletadas: o esgotamento de fibroblastos não associados ao tumor e o enriquecimento de fibroblastos associados ao tumor(Figura 2). O coquetel de contas de esgotamento remove eficientemente células CD45+ (representando 67,35% e 0,69% do total de células pré e pós-esgotamento, respectivamente, Tabela 2), e sempre foi usado para processar um único tumor em cada coluna. Como mostrado na Tabela 1, o número de células elucidadas caiu de uma média de 3 × 106 para 1 × 105 após a etapa de esgotamento. Devido a essa diminuição maciça no número total de células, é conveniente juntar as células coletadas de pelo menos 2 a um máximo de 4 tumores em um único tubo antes de prosseguir com a etapa de enriquecimento. Ao fazê-lo, obteve-se um número adequado de células para incubação com contas fibroblastos associadas ao tumor e passou por uma única coluna de separação para obter uma média final de 93% do CD90,2+ CD45- células(Tabela 2).
Uma vez semeadas em placas de cultura tecidual, essas células recuperadas se conectaram ao plástico e revelaram uma grande morfologia em forma de fuso típica de fibroblastos(Figura 3A, B) e diferente das células tumorais 4T1(Figura 3D). Não juntar tumores após o esgotamento faz com que o rendimento celular com microesferas fibroblastos associadas ao tumor seja muito baixo para estabelecer uma cultura. Em outros casos, quando a duração e a temperatura das incubações com microesferas não são cuidadosamente mantidas, algumas ligações não específicas podem ocorrer. Nesses casos, as etapas de enriquecimento foram menos eficientes e maiores percentuais de CD90.2- CD45+ e CD90,2- CD45- células foram recuperadas juntamente com as células CD90.2+ CAFs (5,97 ± 1,5 e 16,75 ± 1,1, respectivamente) (Figura 4 e Tabela 3). Essas células contaminantes provavelmente seriam responsáveis pela presença na cultura de pequenos clones com diferentes morfologias(Figura 4B, pontas de flecha preta) que cresceram mais rápido que os CAFs e prevaleceram sobre a cultura primária do CAF(Figura 4C). Esses resultados subótimos confirmaram a importância de sempre verificar duas vezes tanto a expressão CD90.2 quanto a CD45, bem como a morfologia celular no final do processo de enriquecimento e durante o crescimento celular na cultura.
Uso de células isoladas para avaliar o potencial de segmentação do CAF de nanodrogas projetadas Os CAFs recém-isolados podem ser usados para várias aplicações que vão desde pesquisas básicas até estudos farmacológicos. O objetivo deste grupo é desenvolver nanocagens HFn que possam especificamente atingir CAFs. O HFn foi funcionalizado com um fragmento de anticorpo anti-FAP específico (HFn-FAP) em duas diferentes proporções de proteínas:anticorpos (uma menor 1:1 e um 1:5 maior), e sua ligação com CAFs foi testada. Como o FAP foi utilizado como biomarcador superficial de CAFs pró-tumorigênicos, foi de fundamental importância verificar a expressão fap em CAFs isolados(Figura 3C). A expressão fap foi seguida ao longo de 5 passagens na cultura para confirmar que a cultura principal do CAF manteve suas características originais.
A funcionalidade fap no HFn foi encontrada para contribuir para uma mudança significativa em relação à segmentação do CAF em comparação com a HFn nua, e a menor quantidade de anticorpos (1:1) foi suficiente para observar esse efeito(Figura 5A). No entanto, isso não foi observado com as células tumorais 4T1 utilizadas para configurar o modelo de tumor in vivo, onde hfn nu mostrou maior ligação do que hfn funcionalizado (Figura 5B). Isso provavelmente deveu-se à ausência de superexpressão fap em células 4T1 e à interação preferencial do HFn com o TfR1, que regula a absorção de HFn nas células, conforme amplamente relatado por este grupo27,33. Esses resultados confirmam a utilidade do uso de culturas primárias de CAFs mamários para examinar preliminarmente a capacidade de segmentação de nanopartículas projetadas para combater o microambiente tumoral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Figura 1: Estabelecimento do modelo de tumor 4T1. As células (105 células/camundongos) foram injetadas na almofada de gordura mamária. O crescimento tumoral foi acompanhado nos dias 5, 10, 15, 20, 25 e 30 após a implantação (A) medindo o volume do tumor com pinças e (B) por bioluminescência por imagem. Os volumes tumorais e bli são expressos como mm3 e conta, respectivamente. Os resultados são relatados como média ± SEM (n=6). (C) Imagens representativas da BLI obtidas 5, 10, 15, 20, 25 e 30 dias após a implantação celular confirmam o crescimento do tumor até o dia 25, quando parece atingir um platô. No último ponto de análise (30 dias), o BLI não aumenta em relação ao dia 25. A partir do dia 20, áreas de necrose e ulceração começam a se tornar visíveis na parte central do tumor. Escala de cores: Min = 1.194, Max = 20.462. Abreviaturas: BLI = bioluminescência por imagem; SEM = erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Figura 2: Preparação da amostra de tumores e caracterização da citometria de fluxo de CAFs isolados. Os tumores foram extirpados e reduzidos em (A) pequenos pedaços de aproximadamente 1-2 mm com a ajuda de um bisturi; (B) suspensão celular única após digestão tecidual e dissociação mecânica de um tumor excisado; (C)pelota celular obtida após a lise dos glóbulos vermelhos; (D) análise da citometria de fluxo da expressão CD45 e CD90.2 em células obtidas após a remoção de glóbulos vermelhos e células mortas, (E) após esgotamento de fibroblastos não associados ao câncer, e (F) após o enriquecimento de fibroblastos associados ao câncer, onde a maioria das células são CD90.2+ CD45- (retângulo azul). Abreviaturas: CAFs= fibroblastos associados ao câncer; CD = cluster de diferenciação; PE-A = área de ficoerthrina; FITC-A = áreas de isocitonato de fluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Figura 3: A análise morfológica da expressão CAF e FAP. (A, B) A morfologia dos CAFs foi verificada em todas as passagens da cultura por microscopia óptica (diferentes níveis de confluência na passagem 2 e passagem 5) e comparada com (D) células tumorais 4T1; barras de escala = 10 μm. (C) A expressão da proteína de ativação do fibroblasto (FAP) foi avaliada pela citometria de fluxo no final do processo de isolamento nascélulas CD90.2+ CD45 coletadas para confirmar suas características moleculares. Um limiar de fluorescência foi definido em células de controle não manchadas (gráfico vermelho) para quantificar a intensidade média de fluorescência e a porcentagem de células positivas (FAP+) entre células manchadas de anticorpos (gráfico azul). Abreviaturas: CAFs= fibroblastos associados ao câncer; FAP = proteína de ativação do fibroblasto; CD = cluster de diferenciação; MFI = intensidade média de fluorescência; Ab = anticorpo; FITC-A = área de isocitonato de fluoresceína; FAP+ = Células FAP-positivas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Figura 4: Exemplo de um processo de isolamento de CAFs sub-ideal. (A) Avaliação da citometria de fluxo após a etapa final de isolamento revelou a presença de células de CD90.2- CD45+ e CD90.2- CD45- . (B) Essas células podem ser vistas como clones com pequena morfologia redonda ao semear (pontas de flecha preta e entrada no canto inferior esquerdo do painel) que (C) prevaleceu sobre CAFs após a terceira passagem na cultura. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: CAF = fibroblasto associado ao câncer; CD = cluster de diferenciação; PE-A = área de ficoerthrina; FITC-A = áreas de isocitonato de fluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Figura 5: Ligação de nanocagens HFn em CAFs e 4T1. As nanocágens HFn foram rotuladas fluorescentemente com FITC, funcionalizadas com um fragmento de anticorpo anti-FAP (HFn-FAP) em duas diferentes relações proteína-anticorpos (1:1 e 1:5), e incubadas com (A) células alvo e (B) 4T1 a 4 °C por 2 h. A vinculação foi avaliada por citometria de fluxo. (A) A ligação HFn-FAP com CAFs é significativamente aumentada em ambas as concentrações de fragmentos de anticorpos em três vezes em comparação com hfn. (B) nua em contraste, uma ligação significativamente maior de HFn nua foi observada em células 4T1, onde a vinculação não é aprimorada pelo reconhecimento fap. Os resultados são relatados como ± desvio padrão médio de três experimentos independentes. p = 0,0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Abreviaturas: CAFs= fibroblastos associados ao câncer; FAP = proteína de ativação do fibroblasto; HFn = variante recombinante da cadeia pesada de ferritina humana usada como nanopartícula nua ou conjugada; HFN-FAP = Nanopartículas HFn funcionalizadas com a porção variável de um anticorpo anti-FAP preparado a duas razões molar de HFn:Fab@FAP, 1:1 e 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Número de celular (± médio SD)</td>
			<td>Total de rendimento de extração (por passagem)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumor excisado (Remoção pós-glóbulos vermelhos)</td>
			<td>1.27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumor excisado (Remoção de células mortas)</td>
			<td>3.01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coquetel pós esgotamento</td>
			<td>1.15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pós enriquecimento</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Contagem total de células após cada etapa de isolamento de fibroblastos associados ao câncer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Distribuição celular (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumor excisado (Remoção de células mortas)</td>
			<td>1,81 ± 0,98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coquetel pós esgotamento</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0.14 ± 0.13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pós enriquecimento</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0.09 ± 0.1</td>
			<td>0.09 ± 0.08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Distribuição celular de acordo com a expressão de CD90.2 e CD45 após cada passagem de isolamento de fibroblastos associados ao câncer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Distribuição celular (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pós Enriquecimento (sem pooling)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1.49 ± 0.4</td>
			<td>5.97 ± 1.5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Expressão CD90.2 e CD45 de células coletadas após um experimento de isolamento fibroblasto associado ao câncer sub-ideal.

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Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Este artigo tem como objetivo fornecer um protocolo para o isolamento e cultura de fibroblastos primários associados ao câncer a partir de um modelo de murina síngênica de câncer de mama triplo-negativo e sua aplicação para o estudo pré-clínico de novas nanopartículas projetadas para atingir o microambiente tumoral.

Isolamento de fibroblastos associados ao câncer primário de um modelo de murina síndica do câncer de mama para o estudo de nanopartículas-alvo

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Este protocolo permite isolar e cultivar com sucesso fibroblastos associados ao câncer primário a partir do câncer de mama murin, para tela de novas nanopartículas projetadas para atingir o ambiente de micro tumores. O CAF primário representa o modelo mais confiável e fisiológico para estudos in vitro de estroma tumoral. Neste protocolo, descrevemos como alcançar um rendimento ideal.Para começar, prepare uma mistura de digestão para dissociação do tumor, e mergulhe os fragmentos tumorais de três a cinco milímetros na solução depois de fechar firmemente o tubo. Vire o tubo de cabeça para baixo, verificando se todos os pedaços do tumor estão na parte inferior do tubo em direção à tampa. Em seguida, conecte o tubo a um dissociador mecânico na carcaça adequada, e execute um programa de dissociação especificamente projetado para tumores resistentes.Após a corrida, desprende o tubo e coloque-o de cabeça para baixo para incubar a amostra a 37 graus Celsius por 40 minutos com agitação suave. Em seguida, recoloque o tubo ao dissociador na carcaça adequada, e execute o programa de dissociação para tumores resistentes duas vezes, garantindo que não haja grandes pedaços de tecido no final do procedimento. Filtre a amostra através de um coador de células de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros.Em seguida, lave o filtro com 10 mililitros de RPMI 1640 médio e centrífuga. Após a centrifugação, resuspenque a pelota no buffer PBE, composto por PBS, 0,5% BSA e dois milimôlares EDTA, e conte as células com Trypan Blue. Repare o tampão de ligação de célula morta diluindo a solução de estoque tampão de ligação de 20X com água destilada dupla estéril.Lave as células com cinco mililitros de tampão de ligação 1X e centrífuga. Após a centrifugação, resuspenja a pelota celular com 0,1 mililitro de microesferas de remoção de células mortas por até 10 a 7 células, e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Durante a incubação, prepare um suporte magnético sob o capô, e pendure colunas de separação ferromagnéticas para ele, com as pontas apontando para baixo.Equilibre as colunas com 0,5 mililitros de tampão de ligação a frio e espere até que a solução flua. Após a incubação, adicione 400 microliters de tampão de ligação fria à suspensão da conta e da célula. Coloque todo o volume na coluna e colete o efluente em um tubo de 15 mililitros.Lave a coluna quatro vezes com 0,5 mililitros de tampão de ligação fria e colete o efluente total no mesmo tubo. Para o esgotamento de fibroblastos associados ao não-câncer, filtre a suspensão celular usando um coador de células de 70 mícrons umedecido com PBS, e centrifugar as células. Remova o supernatante e resuspenja a pelota em 80 microliters de tampão PBE frio.Adicione 20 microliters de coquetel de esgotamento do fibroblasto não associado ao tumor. Misture bem, e incubar a amostra a 4 graus Celsius por 15 minutos no escuro. Durante a incubação com contas, prepare colunas de esgotamento ferromagnético em um suporte magnético.Equilibre as colunas com dois mililitros de tampão PBE frio e espere até que a solução flua. Após a incubação, adicione 400 microliters de tampão à suspensão de contas e células. Coloque todo o volume na coluna e colete o efluente em um tubo de 15 mililitros.Lave a coluna duas vezes com dois mililitros de PBE. Colete o efluente total no mesmo tubo e centrifufique o efluente. Para a seleção positiva de fibroblastos associados ao câncer, resuspenque a pelota em 80 microliters de tampão PBE frio.Em seguida, em 20 microlitres de micróbios associados ao tumor, e incubar as amostras a 4 graus Celsius por 15 minutos no escuro. Durante a incubação, prepare colunas de separação ferromagnética em um suporte magnético e equilibre-as com 0,5 mililitros de tampão PBE frio. Após a incubação, adicione 400 microliters de PBE à suspensão de contas e células.Carregue todo o volume na coluna e deixe as células sem rótulos fluírem através de um tubo de 15 mililitros. Lave a coluna três vezes com 0,5 mililitros de tampão PBE e colete o efluente total no mesmo tubo. Remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.Adicione um mililitro de PBE na coluna e empurre imediatamente o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células. Após a centrifugação, resuspenque a pelota celular em um volume apropriado de DMEM, e semee as células em uma placa de cultura tecidual. Verifique a densidade celular sob um microscópio, e coloque a placa a 37 graus Celsius, e 5% dióxido de carbono para permitir que as células aderam e cresçam.A injeção de células luciferase 4T1 na almofada de gordura mamária de camundongos fêmeas levou ao crescimento de uma massa tumoral detectável cinco dias após a implantação. Para encontrar uma janela de sacrifício adequada para o isolamento do CAF, foi buscado um comprometimento ideal entre maior tamanho do tumor e bioluminescência por um lado, e uma ulceração tumoral emergente e necrose, por outro lado. O dia 20 foi definido como o ponto de tempo para otimizar a recuperação celular, após o processo de isolamento.Foram necessárias mais duas passagens para isolar a população de CAFs, do painel de células viáveis coletadas, o esgotamento de fibroblastos não associados ao tumor e o enriquecimento de fibroblastos associados ao tumor. As células CAF revelaram uma grande morfologia em forma de fuso, típica dos fibroblastos, e eram diferentes das células tumorais 4T1. A expressão fap seguiu mais de cinco passagens confirmando que a cultura primária do CAF manteve suas características originais.Quando a duração e a temperatura das incubações com microesferas não foram mantidas, foram encontrados clones com diferentes morfologias entre a cultura isolada. Essas células contaminantes cresceram mais rápido e prevaleceram sobre a cultura principal do CAF. CaFs ligados com a droga nano funcionalizada Human Ferritin Hfn-FAP aumentaram em uma para uma, e concentrações de fragmentos de anticorpos de um a cinco por três vezes, em comparação com hfn nua.Pelo contrário, para as células tumorais 4T1, hfn nua mostrou maior ligação do que HFN funcionalizada. Para aumentar a impureza de rendimento do CAF isolado, mantenha os tampões frios, respeite o tempo de incubação com contas e puxe até quatro tumores por coluna antes da etapa final de enriquecimento. Os CAFs isolados podem ser usados para triagem de várias nanodrogas candidatas em termos de vinculação, absorção e eficácia farmacológica antes de prosseguir com experimentos in vivo pré-clínicos.O isolamento da CAF nos permitiu testar se nanopartículas podem ser usadas para atingir o microambiente tumoral. Assim, abrindo caminho para novas terapias-alvo que trabalham em sinergia com quimioterapia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancer eficácia da terapia fotodinâmica com Nanopartículas Lung Cancer segmentadas

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Pesquisa do câncer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Um modelo de Mouse Syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotópico transplante de células de Adenocarcinoma de pulmão Syngeneic para estudar a expressão de PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...