Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Denna studie stöddes av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) inom ramen för IG 2017-ID. 20172-projektet – P.I. Corsi Fabio. SM bekräftar Pediatric Clinical Research Center "Romeo och Enrica Invernizzi" som stödjer hennes position. AB tackar AIRC (ID. 20172-projektet) och University of Milan för forskningsstipendium. LS och MS postdoktorala och doktorandstipendier stöds av Universitetet i Milano.

<ol>
	<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer.">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li><li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+and+their+microenvironments:+tilling+the+soil.+Commentary+re:+A.+M.+Scott+et+al.,+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer.">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li><li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+Sanctuary+of+the+devil.">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li><li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+foes+to+friends:+targeting+cancer-associated+fibroblasts.">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li><li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts:+origins,+functions+and+translational+impact.">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Li, X. -. Y., Hu, S. -. Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance.">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li><li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression.">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li><li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer.">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li><li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment.">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, 186-196 (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics.">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts:+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy.">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).</li><li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment.">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li><li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers.">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027 (2020).</li><li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors.">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li><li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;:+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies.">Fibroblast activation protein-&#945;: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;+in+fibrogenic+disorders+and+cancer:+more+than+a+prolyl-specific+peptidase.">Fibroblast activation protein-&#945; in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li><li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin.">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+nanocages:+A+biological+platform+for+drug+delivery,+imaging+and+theranostics+in+cancer.">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size.">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li><li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoferritin+applications+in+nanomedicine.">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li><li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity.">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy.">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li><li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma.">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li><li>Kov&#225;cs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts.">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).</li><li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax.">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328 (2021).</li><li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells.">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li><li>Dvo&#345;&#225;nkov&#225;, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+(CAFs)+for+biomedical+research.">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li><li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages.">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).</li><li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma.">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li><li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression.">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li><li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control.">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li><li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery.">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

CAF växer fram som nyckelspelare i ombyggnad av extracellulär matris, främjar metastaseringsprogression och begränsar läkemedelsåtkomsten tilltumörstället 34. Men på grund av deras heterogenitet är deras roller fortfarande kontroversiella - vissa CAF är tumörogena, medan vissa andra subtyper verkar ha en tumör-suppressiv roll. I detta sammanhang kan deras isolering vara av extremt intresse för att kasta mer ljus över deras omdiskuterade roll i cancerprogression, som kommer att ha viktiga kliniska konsekvenser12,31. Dessutom skulle framgångsrik CAF utvinning från mänskliga och prekliniska mus tumör modeller också underlätta utvecklingen av nya CAF-inriktade läkemedel. Detta dokument rapporterar en metod för att effektivt isolera och odla primära CAF från en syngeneisk preklinisk modell av bröstcancer. Baserat på erfarenhet påverkar tre experimentella steg mestadels protokollets framgång.
Den första arbetar snabbt för att undvika aggregering av cellupphängningar i samband med risken för koagulering i kolumnen och långsammare cellutflöde: i själva verket, när celler som passerade genom kolumnen grupperades tillsammans, ökade sannolikheten för en suboptimal isoleringsprocess och de slutliga kulturerna innehöll "förorenande" cellkloner. Den andra är att slå samman celler från olika tumörer efter utarmningspassagen för att garantera att tillräckligt med celler passerar i det slutliga anrikningssteget. Den sista kritiska frågan är plätering av de extraherade cellerna vid höga celltätheter, troligen från en enda brunn på 24-brunnsplattan för att öka celltillväxten och koloniexpansionen för upp till 4-5 passager. Om cellerna såddes med låg densitet expanderade de på den fria ytan och slutade snabbt replikera.
Flera studier har redan beskrivit CAF extraktionsmetoder av både människa och mus ursprung, för att studera deras roll i att främja cancerutveckling och invasivitet. Detta har gjorts i många typer av tumörer, inklusive bröstcancer, melanom, cholangiocarcinom och bukspottskörteln adenocarcinom35,36,37,38. På grund av bristen på specifika CAF-markörer och deras heterogenitet är resultaten av dessa processer fortfarande suboptimala.
Här användes de isolerade cellerna för att validera CAF-inriktningsförmågan hos HFn nanocages funktionella med anti-FAP inriktning moieties. Användningen av primära kulturer av CAF var en betydande fördel, vilket möjliggör validering av nanostrategy ex vivo med ett mycket enklare och kostnadseffektivt bindande experiment än att göra det direkt in vivo i denna preliminära fas av nanodrogoptimering.
I den meningen kan ex vivo-testning på CAF:er föregå djurförsök in vivo genom att tillåta screening och urval av de mest lovande nanopartiklarna för optimal inriktning av CAF. CAF-modellen som presenteras här kan också användas för preliminära effektstudier, vid lastning av nanopartiklar med aktiva läkemedel. Djur kommer endast att användas senare för att utvärdera biodistribution, farmakokinetik och effektstudier.
Flera CAF-riktade nanodroger utvecklas, såsom ferritinnananocager för fotodynamisk terapi vid bröstcancer och peptidbaserade partiklar för att leverera doxorubicin i prostatacancermodeller39,40. Men inte många studier har fokuserat på isolering av CAF som cellplattformar för nanodrogoptimering.
Det här protokollet har vissa begränsningar. För det första är det ett tidskrävande protokoll som kräver förberedelse och inköp av flera reagenser och material. För det andra, på grund av bristen på CAF i 4T1 brösttumör, deras utbyte är lågt. Nanopartikelexperiment bör planeras och utföras så snart det önskade cellnumret har uppnåtts, eftersom primära CAF genomgår senescens och inte kan upprätthållas i kulturen under lång tid. Sammanfattningsvis kan denna metod för CAFs isolering, odling och karakterisering vara ett kraftfullt verktyg för att påskynda utvecklingen av nya riktade nanomediciner i kampen mot cancer.

Under de senaste decennierna har det blivit tydligt att döda tumörceller vanligtvis inte är tillräckligt för att utrota malignitet, eftersom tumörmikromiljön kan leda till tumöråterfall och inducera terapeutisk resistens1,2. Ett nytt paradigm har sedan dykt upp: rikta tumör stroma för att beröva tumören av stödjande faktorer och därmed öka effektiviteten av kemoterapeutiska3,4,5. I synnerhet är cancerrelaterade fibroblaster (CAF) ett intressant stromalt mål i många solidatumörer 6,7. CAF är en mycket heterogen grupp celler som interagerar med cancerceller och celler i immunsystemet genom utsöndring av tillväxtfaktorer, cytokiner och kemokiner; bygga upp och bygga om den extracellulära matrisen; och aktivera metastasering8,9,10,11,12. Beroende på tumörtyp visar CAF pro-tumorigenic funktioner, medan andra subtyper av CAFs verkar ha tumör-suppressiva funktioner13,14. För att bättre klargöra denna dikotomi är en grundlig karakterisering av CAFs från primära och ögonbevarande tumörer viktigt.
I detta sammanhang har ett framväxande forskningsområde fokuserat på utveckling av nanosized medel utformade för att rikta in sig på och / eller förstöra CAF genom att leverera aktiva molekyler och läkemedel som kan bygga om tumörmikromiljön15,16,17,18. Flera typer av nanopartiklar har utformats för att uppnå CAF-ablation av cytotoxiska läkemedel, för att inducera CAF-riktad fotodynamisk terapi, eller för att omprogrammera CAF genom att återställa dem till ett quiescent tillstånd eller inducera TNF-relaterad apoptos inducerad ligand uttryck, som inducerar apoptos av angränsande cancerceller16,19. Dessutom ger potentialen hos många nanopartiklar att aktivt rikta in sig på specifika biologiska markörer upphov till hoppet om att välja CAF-undergrupper att rikta in sig på. Även om dess absoluta specificitet för CAF fortfarande ifrågasätts, är fibroblastaktiveringsprotein (FAP) ett av de mest lovande målen för protumörogen stroma och utnyttjas för att styra nanodrogleverans, vilket banar väg för utveckling av CAF-riktade nanoterapeuter20,21,22.
Detta dokument beskriver isoleringen av primära CAFs från en syngeneisk modell av murin bröstcancer och rapporterar deras användning i studien av inriktning kapacitet nanopartiklar konstruerade för att känna igen CAF markör, FAP. Ferritinnannocages används som kandidatnanosystem för att ställa in metoden, eftersom deras leveranss specificitet kan formas av ytexponeringen för inriktning av moieties23,24. Dessutom har ferritiner framgångsrikt visat sig vara utmärkta biokompatibla skyttlar för antitumörapplikationer, vilket utlöser snabb ackumulering av nyttolasten itumörmassan 25,26,27. Hittills har prekliniska studier av CAF-inriktade nanosystem involverat vitro-testning på fibroblast cellinjer stimuleras i kultur med omvandla tillväxtfaktor-beta för att inducera cellaktivering och uttryck för vissa immunofenotypiska funktioner i CAFs28,29. Denna metod tillämpas vanligtvis på odödliga celllinjer (som NIH3T3, LX-2) och är ganska snabb och enkel, vilket ger aktiverade celler på några timmar eller dagar. En begränsning är att även om in vitro-stimulering inducerar uttrycket av vissa gener som tillskrivs aktiverade myofibroblaster, kan det inte helt rekapitulera alla biologiska egenskaper hos verkliga CAF, särskilt deras heterogenitet in vivo.
En annan strategi innebär extraktion av primära CAF från mänskliga eller mus tumör prover30,31. Detta säkerställer att CAF-aktivering sker i ett fysiologiskt sammanhang och att heterogeniteten hos CAF-subpopulationer upprätthålls. Enligt forskningsmålet kan CAF härledas från olika källor, vilket ger möjlighet att studera det mest tillförlitliga tillståndet. Protokollet som rapporteras här skulle vara värdefullt för forskare som försöker utföra en preliminär utvärdering av funktionaliteten hos nya nanopartiklar utformade för att rikta in sig på CAF från en murin bröstcancermodell. Isolerade CAF skulle vara användbart för att undersöka de nanopartiklar som är tillräckligt lovande för att gå vidare för in vivo-utvärdering i djurmodeller av cancer. Detta kommer att vara relevant under de första stegen i nanopartikelproduktionen, vilket driver nanotekniker mot förfining av nanopartiklars design genom att främst överväga strategin för ligand immobilisering för att uppnå optimala inriktningsegenskaper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Cancer-associerade fibroblaster (CAFs) är nyckelaktörer i samband med tumör microenvironment. Trots att de minskas i antal jämfört med tumörceller reglerar CAF tumörprogression och ger skydd mot antitumörimmunitet. Framväxande strategier mot cancer syftar till att omforma tumörmikromiljön genom ablation av protumörogena CAF eller omprogrammering av CAF-funktioner och deras aktiveringsstatus. Ett lovande tillvägagångssätt är utvecklingen av nanosized leveransmedel som kan rikta in sig på CAF, vilket möjliggör specifik leverans av läkemedel och aktiva molekyler. I detta sammanhang kan en cellulär modell av CAF vara ett användbart verktyg för in vitro-screening och förstudie av sådana nanoformuleringar.
Denna studie beskriver isolering och kultur av primära CAFs från den syngeneiska 4T1 murin modellen av trippel-negativa bröstcancer. Magnetiska pärlor användes i en 2-stegs separationsprocess för att extrahera CAF från dissociated tumörer. Immunophenotyping kontroll utfördes med hjälp av flöde cytometri efter varje passage för att verifiera processen utbyte. Isolerade CAF kan användas för att studera inriktningsförmågan hos olika nanoformuleringar utformade för att hantera tumörmikromiljön. Fluorescerande märkta H-ferritin nanocages användes som kandidat nanopartiklar för att ställa in metoden. Nanopartiklar, antingen nakna eller konjugerade med en målligand, analyserades för sin bindning till CAF. Resultaten tyder på att ex vivo utvinning av bröst CAFs kan vara ett användbart system för att testa och validera nanopartiklar för specifik inriktning av tumörogena CAFs.

In vivo-modellinställt för optimal isolering av KLIENT-filer Injektionen av 105 4T1-luc celler i bröstfett pad av kvinnliga BALB/c möss leder till tillväxten av en detekterbar tumör massa 5 dagar efter implantation. Genom att mäta tumörvolymen efter bromsok och tumör cellen livskraft av BLI, tumör tillväxt övervakades i en månad efter implantation. För att hitta ett offerfönster som är tillräckligt för CAFs isolering söktes en optimal kompromiss mellan högre tumörstorlek och BLI å ena sidan och en framväxande tumörsår och nekros å andra sidan (Figur 1). Eftersom en nekrotisk kärna visas 20 dagar efter implantationen, och den förstoras vid 25 och 30 dagar (vilket dokumenteras av BLI-bilder i figur 1C),sattes dag 20 som tidspunkt för att optimera cellåterställning efter isoleringsprocessen. Även efter att noggrant ha avlägsnat alla synliga nekrotiska områden under de första stegen av tumörhantering ex vivo, hittades en hög andel döda celler i slutet av dissociationen i enstaka celler (Tabell 1). Eftersom denna procentandel kan vara relevant, särskilt med ökningen av tumörstorlek, är död cellborttagning alltid nödvändigt när man arbetar med 4T1-modellen.
Optimering av CAF-isoleringsprocedur, kultur och karakterisering Ytterligare två passager behövs för att isolera populationen av CAF (CD90.2+ CD45-) från panelen av insamlade livskraftiga celler: utarmning av icke-tumör-associerade fibroblaster och berikning av tumör-associerade fibroblaster (Figur 2). Utarmning pärla cocktail effektivt tar bort CD45+ celler (står för 67,35% och 0,69% av de totala cellerna före respektive efter utarmning, tabell 2), och användes alltid för att bearbeta en enda tumör i varje kolumn. Som visas i tabell 1sjönk antalet eluterade celler från i genomsnitt 3 × 106 till 1 × 105 efter utarmningssteget. På grund av denna massiva minskning av det totala antalet celler är det bekvämt att slå samman de insamlade cellerna från minst 2 till högst 4 tumörer i ett enda rör innan du fortsätter med anrikningssteget. Genom att göra detta erhölls ett tillräckligt antal celler för inkubation med tumör-associerade fibroblast pärlor och passerade genom en enda separation kolumn för att få ett slutligt genomsnitt på 93% av CD90.2+ CD45- celler (Tabell 2).
När de såts på vävnadskulturplattor, dessa återvunna celler kopplade till plasten och visade en stor spindelformad morfologi som är typisk för fibroblaster (Figur 3A, B) och skiljer sig från 4T1 tumörceller ( Figur3D). Att inte poola tumörer efter utarmning orsakar cellulär avkastning med tumör-associerade fibroblast mikrober att vara för låg för att etablera en kultur. I andra fall, när inkubationerna med mikrober inte upprätthålls noggrant, kan viss icke-specifik bindning uppstå. I sådana fall var anrikningsstegen mindre effektiva och högre procentandelar CD90,2- CD45+ och CD90,2- CD45- celler återfanns tillsammans med CD90.2+ CAF (5,97 ± 1,5 respektive 16,75 ± 1,1) (figur 4 respektive tabell 3). Dessa främmande celler var sannolikt ansvariga för närvaron i kulturen av små kloner med olika morfologi(figur 4B,svarta pilspetsar) som växte snabbare än CAF och segrade över den primära CAF-kulturen (Figur 4C). Dessa suboptimala resultat bekräftade vikten av att alltid dubbelkontrollera både CD90.2 och CD45 uttryck, liksom cell morfologi i slutet av anrikningsprocessen och under cell tillväxt i kultur.
Användning av isolerade celler för att utvärdera CAF-inriktningspotentialen hos konstruerade nanodroger De nyisolerade CAF:erna kan användas för flera tillämpningar, allt från grundforskning till farmakologiska studier. Denna grupps mål är att utveckla HFn nanocages som specifikt kan rikta sig till CAF. HFn var funktionaliserade med en specifik anti-FAP antikropp fragment (HFn-FAP) vid två olika protein:antikroppar förhållanden (en lägre 1:1 och en högre 1:5), och deras bindning med CAF testades. Eftersom FAP användes som ytbiomarkör av protumörogena CAF: er var det av grundläggande betydelse att kontrollera FAP-uttrycket på isolerade CAF (Figur 3C). FAP-uttryck följdes över 5 passager i kulturen för att bekräfta att den primära CAF-kulturen behöll sina ursprungliga egenskaper.
FAP-funktionalisering på HFn konstaterades bidra till en betydande förskjutning mot CAF-inriktning jämfört med bar HFn, och den lägre mängden antikroppar (1:1) var tillräckligt för att observera denna effekt (figur 5A). Detta observerades dock inte med tumör 4T1 celler som används för att ställa in vivo tumör modell, där i bare HFn visade högre bindning än functionalized HFn (Figur 5B). Detta berodde sannolikt på avsaknaden av FAP-överuttryck i 4T1-celler och den förmånliga interaktionen mellan HFn och TfR1, som reglerar HFn-upptaget i celler, vilket allmänt rapporterats av denna grupp27,33. Dessa resultat bekräftar nyttan av att använda primära kulturer av bröst CAFs för att preliminärt screena inriktningsförmågan hos nanopartiklar utformade för att hantera tumör mikromiljön.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Figur 1: Fastställande av 4T1 tumörmodell. Celler (105 celler/mus) injicerades i bröst fett pad. Tumör tillväxt följdes vid dagarna 5, 10, 15, 20, 25 och 30 efter implantation (A) genom att mäta tumör volym med bromsok och (B) med bioluminescens imaging. Tumörvolymer och BLI uttrycks som mm3 respektive räknas. Resultaten rapporteras som genomsnittligt ± SEM (n=6). (C) BLI representativa bilder erhöll 5, 10, 15, 20, 25 och 30 dagar efter cellimplantation bekräfta tumör tillväxt fram till dag 25, när det verkar nå en platå. Vid den senaste analyspunkten (30 dagar) ökar INTE BLI jämfört med dag 25. Från dag 20 börjar områden av nekros och sårbildning att bli synliga i den centrala delen av tumören. Färgskala: Min = 1 194, Max = 20 462. Förkortningar: BLI = bioluminescensavbildning; SEM = standardfel av medelvärdet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Figur 2: Tumörprovberedning och flödescytometri karakterisering av isolerade CAF. Tumörer strukits och reducerats till (A) små bitar på cirka 1-2 mm med hjälp av en skalpell; B)Enkelcelligsuspension efter vävnadsuppsmältning och mekanisk dissociation av en struken tumör. C)Cellpellet som erhålls efter lys av röda blodkroppar. D)Flödescytometrianalys av CD45- och CD90,2-uttryck i celler som erhållits efter avlägsnande av röda blodkroppar och dödaceller, (E)efter utarmning av icke-cancerrelaterade fibroblaster och (F) efter berikning av cancerrelaterade fibroblaster, där majoriteten av cellerna är CD90,2+ CD45- (blå rektangel). Förkortningar: CAFs= cancerrelaterade fibroblaster; CD = differentieringskluster; PE-A = område av fykoerytrin; FITC-A = områden med fluorescein isothiocyanate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Figur 3:Morfologisk analys av CAF-och FAP-uttryck. (A, B) CAF-morfologi kontrollerades genom alla kulturpassager med optisk mikroskopi (olika nivåer av sammanflöde vid passage 2 och passage 5) och jämfördes med (D) 4T1 tumörceller; skala stänger = 10 μm. (C) Fibroblast aktivering protein (FAP) uttryck utvärderades av flöde cytometri i slutet av isoleringsprocessen på de insamlade CD90.2+ CD45 - cellerför att bekräfta deras molekylära egenskaper. En fluorescenströskel sattes på osedda kontrollceller (rött diagram) för att kvantifiera genomsnittlig fluorescensintensitet och andelen positiva celler (FAP+) bland antikroppsfärgade celler (blått diagram). Förkortningar: CAFs= cancerrelaterade fibroblaster; FAP = fibroblastaktiveringsprotein; CD = differentieringskluster; MFI = genomsnittlig fluorescensintensitet; Ab = antikroppar; FITC-A = område av fluorescein isothiocyanate; ANP+ = FAP-positiva celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Figur 4: Exempel på en suboptimal CAFs isoleringsprocess. (A) Flöde cytometri utvärdering efter det slutliga isoleringssteget visade förekomsten av förorenande CD90.2- CD45+ och CD90.2- CD45- celler. (B) Dessa celler kan ses som kloner med liten rund morfologi vid sådd (svarta pilspetsar och inset i panelens nedre vänstra hörn) som (C) segrade över CAF efter den tredje passagen i kulturen. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: CAF = cancer-associerade fibroblast; CD = differentieringskluster; PE-A = område av fykoerytrin; FITC-A = områden med fluorescein isothiocyanate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Figur 5: Bindning av HFn-nanocages på CAF och 4T1. HFn nanocages var fluorescerande märkta med FITC, functionalized med en anti-FAP antikroppar fragment (HFn-FAP) vid två olika protein-antikropp förhållanden (1:1 och 1:5), och inkuberas med (A) mål CAFs och (B) 4T1 celler vid 4 °C för 2 h. Bindningen utvärderades av flödescytometri. (A) HFn-FAP-bindning med CAF ökas signifikant vid båda antikroppsfragmentkoncentrationerna med trefaldigt jämfört med bar HFn. (B) däremot observerades en betydligt högre bindning av bar HFn i 4T1-celler, där bindningen inte förbättras genom FAP-erkännande. Resultaten rapporteras som genomsnittlig ± standardavvikelse för tre oberoende experiment. p = 0,0003; °° p = 0,0021; °°° p = 0.0008. Förkortningar: CAFs= cancerrelaterade fibroblaster; FAP = fibroblastaktiveringsprotein; HFn = rekombinant variant av mänsklig ferritin tung kedja som används som bar nanopartikel eller konjugerad; HFN-FAP = HFn nanopartiklar som funktionaliseras med den varierande delen av en anti-FAP-antikropp beredd vid två HFn:Fab@FAP molarförhållanden, 1:1 och 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Cellnummer (genomsnittligt ± SD)</td>
			<td>Totalt utsugsutbyte (per passage)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Struken tumör (Borttagning av röda blodkroppar)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Struken tumör (Post död cellborttagning)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail efter utarmning</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter berikning</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Totalt antal celler efter varje steg av isolering av cancerrelaterade fibroblaster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cellfördelning (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Struken tumör (Post död cellborttagning)</td>
			<td>1.81 ± 0.98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cocktail efter utarmning</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0.14 ± 0.13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter berikning</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Cellfördelning enligt uttryck av CD90.2 och CD45 efter varje passage av isolering av cancerrelaterade fibroblaster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cellfördelning (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter anrikning (ingen poolning)</td>
			<td>75.80 ± 2.9</td>
			<td>1.49 ± 0.4</td>
			<td>5.97 ± 1.5</td>
			<td>16.75 ± 1.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: CD90.2 och CD45 uttryck av celler samlas in efter en suboptimal cancer-associerade fibroblast isolering experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Detta dokument syftar till att tillhandahålla ett protokoll för isolering och kultur av primära cancer-associerade fibroblaster från en syngeneisk murin modell av trippelnegativa bröstcancer och deras tillämpning för prekliniska studien av nya nanopartiklar utformade för att rikta tumör microenvironment.

Isolering av primära cancerrelaterade fibroblaster från en syngeneisk murinmodell av bröstcancer för studier av riktade nanopartiklar

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Detta protokoll gör det möjligt att framgångsrikt isolera och odla primär cancer associerade fibroblaster från murin bröstcancer, att screena nya nanopartiklar utformade för att rikta tumör mikromiljön. Primära CAF representerar den mest tillförlitliga och fysiologiska modellen för in vitro studier av tumör stroma. I detta protokoll beskriver vi hur man uppnår en optimal avkastning.För att börja, förbered en matsmältningsblandning för tumördissociation och blötlägg de tre till fem millimeters tumörfragmenten i lösningen efter att ha stängt röret tätt. Vänd röret upp och ner och kontrollera att alla bitar av tumör är längst ner på röret mot locket. Fäst sedan röret på en mekanisk dissociater i rätt hus och kör ett dissociationsprogram speciellt utformat för tuffa tumörer.Efter körningen lossar du röret och placerar det upp och ner för att inkubera provet vid 37 grader Celsius i 40 minuter med mild skakning. Sätt sedan tillbaka röret till dissociatern i rätt hus och kör dissociationsprogrammet för tuffa tumörer två gånger, vilket säkerställer att inga stora vävnadsbitar förblir i slutet av proceduren. Filtrera provet genom en 40 mikron cell sil i ett 50 milliliter rör.Tvätta sedan filtret med 10 milliliter RPMI 1640 medium och centrifuger. Efter centrifugation, återanvänd pelleten i PBE-buffert, bestående av PBS, 0,5% BSA och två millimolar EDTA, och räkna cellerna med Trypan Blue. Reparera bindbufferten för avlägsnande av döda blodkroppar genom att späda ut 20X-bindningsbuffertlagerlösningen med sterilt dubbeldestillerat vatten.Tvätta cellerna med fem milliliter 1X bindningsbuffert och centrifuger. Efter centrifugation, återanvänd cellpelleten med 0,1 milliliter döda cellborttagningsmikrober i upp till 10 till de sjunde cellerna och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Under inkubationen, förbered ett magnetiskt stativ under huven och häng ferromagnetiska separationskolonner till den, med spetsarna pekande nedåt.Jämvikta pelarna med 0,5 milliliter kallbindande buffert och vänta tills lösningen har flödat igenom. Efter inkubation, tillsätt 400 mikroliter kallbindningsbuffert till pärlan och cellupphängningen. Lasta hela volymen på kolonnen och samla upp utflödet i ett 15 milliliter rör.Tvätta kolonnen fyra gånger med 0,5 milliliter kallbindande buffert och samla in det totala utflödet i samma rör. För utarmning av icke-cancer associerade fibroblaster, filtrera cellupphängningen med en 70 mikron cell sil fuktas med PBS och centrifugera cellerna. Ta bort supernaten och återanvänd pelleten i 80 mikroliter kall PBE-buffert.Tillsätt 20 mikroliter icke tumör-associerade fibroblast utarmning cocktail. Blanda väl och inkubera provet vid 4 grader Celsius i 15 minuter i mörkret. Under inkubationen med pärlor, förbered ferromagnetiska utarmningskolonner på ett magnetiskt stativ.Balansera kolonnerna med två milliliter kall PBE-buffert och vänta tills lösningen har flödat igenom. Efter inkubation, tillsätt 400 mikroliter buffert till pärlan och cellupphängningen. Lasta hela volymen på kolonnen och samla upp utflödet i ett 15 milliliter rör.Tvätta kolonnen två gånger med två milliliter PBE. Samla det totala utflödet i samma rör och centrifugera utflödet. För det positiva urvalet av cancerrelaterade fibroblaster, återanvänd pelleten i 80 mikroliter kall PBE-buffert.Sedan vid 20 mikroliter tumör-associerade fibroblaster mikrober, och inkubera proverna vid 4 grader Celsius i 15 minuter i mörkret. Under inkubation, förbered ferromagnetiska separationskolonner på ett magnetiskt stativ och balansera dem med 0,5 milliliter kall PBE-buffert. Efter inkubation, tillsätt 400 mikroliter PBE till pärlan och cellupphängningen.Ladda hela volymen på kolonnen och låt de omärkta cellerna flöda igenom i ett 15 milliliter rör. Tvätta kolonnen tre gånger med 0,5 milliliter PBE-buffert och samla in det totala utflödet i samma rör. Ta bort kolonnen från magneten och placera den i ett 1,5 milliliter rör.Lägg till en milliliter PBE i kolumnen och tryck omedelbart in kolven i kolumnen för att spola ut cellerna. Efter centrifugation, återanvänd cellpelleten i en lämplig volym DMEM och så cellerna i en vävnadskulturplatta. Kontrollera celltätheten under ett mikroskop och placera plattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid så att cellerna kan klibba och växa.Injektionen av 4T1 luciferasceller i bröstfettdynan hos kvinnliga möss ledde till tillväxten av en detekterbar tumörmassa fem dagar efter implantationen. För att hitta ett offerfönster som är tillräckligt för CAF-isolering söktes en optimal kompromiss mellan högre tumörstorlek och bioluminescenstomografi å ena sidan och en framväxande tumör ulceration och nekros å andra sidan. Dag 20 var inställd som tidspunkt för att optimera cellåterställningen efter isoleringsprocessen.Ytterligare två passager behövdes för att isolera befolkningen av CAFs, från panelen av insamlade livskraftiga celler, utarmning av icke tumör associerade fibroblaster och berikning av tumör associerade fibroblaster. CAF celler visade stora spindel formade morfologi, typiska för fibroblaster, och var skiljer sig från 4T1 tumör celler. FAP-uttryck följt över fem avsnitt bekräftar att primär CAF-kultur behöll sina ursprungliga egenskaper.När varaktighet och temperatur av inkubationerna med mikrober inte bibeads inte bibehölls, hittades kloner med olika morfologi bland den isolerade kulturen. Dessa förorenande celler växte snabbare och segrade över den primära CAF-kulturen. CAF bindning med Human Ferritin Hfn-FAP funktionaliserade nano läkemedel ökade vid en-till-en och en-till-fem antikropp fragment koncentrationer med trefaldigt, jämfört med nakna HFN.Tvärtom, för tumör 4T1 celler, bar HFN visade högre bindning än functionalized HFN. För att öka utbytesförstörelse av isolerade CAF, håll buffertar kalla, respektera inkubationstiden med pärlor och dra upp till fyra tumörer per kolumn före det slutliga anrikningssteget. De isolerade CAF kan användas för att screena flera kandidat nano läkemedel när det gäller bindande, upptag och farmakologisk effekt innan du fortsätter med prekliniska in vivo experiment.CAF isolering tillät oss att testa om nanopartiklar kan användas för att rikta tumör microenvironment. Därmed banar väg för nya riktade terapier som arbetar i synergi med kemoterapi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancer Effekten av fotodynamisk terapi med lungcancer-Targeted Nanopartiklar

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En portådern Injection modell för att studera levermetastaser av bröstcancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Ett syngent musmodell av metastaserad njurcellscancer för kvantitativ och Longitudinal Bedömning av Prekliniska terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musmodell av trötthet inducerad av perifera bestrålning

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En syngena pankreascancer musmodell att studera effekterna av irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En självlysande och fluorescerande ortotop syngena murina modell av Androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av ortotop Homograft (syngena) av murina primära KPC pankreas duktal adenokarcinom av flödescytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotop Transplantation av syngena lunga adenokarcinom celler att studera PD-L1-uttryck

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som ett mer fysiologiskt system för cancer-associerade fibroblaster differentiering och invasion in vitro-studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...