Name: isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Bu çalışma, IG 2017-ID. 20172 projesi – P.I. Corsi Fabio kapsamında Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) tarafından desteklenmiştir. SM, konumunu destekleyen Pediatrik Klinik Araştırma merkezi "Romeo ve Enrica Invernizzi"yi kabul ediyor. AB, airc (ID. 20172 projesi) ve Milano Üniversitesi'ne araştırma bursu için teşekkür ediyor. LS ve MS doktora sonrası ve doktora bursları Milano Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer.">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li><li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+and+their+microenvironments:+tilling+the+soil.+Commentary+re:+A.+M.+Scott+et+al.,+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer.">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li><li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+Sanctuary+of+the+devil.">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li><li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+foes+to+friends:+targeting+cancer-associated+fibroblasts.">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li><li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts:+origins,+functions+and+translational+impact.">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Li, X. -. Y., Hu, S. -. Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance.">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li><li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts:+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression.">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li><li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment.">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer.">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li><li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment.">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, 186-196 (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics.">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts:+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy.">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263 (2019).</li><li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment.">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li><li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers.">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027 (2020).</li><li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors.">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li><li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;:+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies.">Fibroblast activation protein-&#945;: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+activation+protein-&#945;+in+fibrogenic+disorders+and+cancer:+more+than+a+prolyl-specific+peptidase.">Fibroblast activation protein-&#945; in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li><li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin.">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li><li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+nanocages:+A+biological+platform+for+drug+delivery,+imaging+and+theranostics+in+cancer.">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size.">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li><li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoferritin+applications+in+nanomedicine.">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li><li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity.">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy.">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li><li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma.">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li><li>Kov&#225;cs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts.">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18 (2020).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425 (2013).</li><li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax.">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328 (2021).</li><li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells.">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li><li>Dvo&#345;&#225;nkov&#225;, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+(CAFs)+for+biomedical+research.">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li><li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages.">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097 (2014).</li><li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma.">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li><li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression.">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li><li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control.">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li><li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery.">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

CAL'ler hücre dışı matrisin yeniden şekillendirilmesinde, metastaz ilerlemesinin teşvikinde ve tümör bölgesine ilaç erişiminin sınırlandırılmasında kilit oyuncular olarak ortaya çıkıyor34. Bununla birlikte, heterojenlikleri nedeniyle rolleri hala tartışmalıdır - bazı CAL'ler tümörijeniktir, diğer bazı alt tipler ise tümör baskılayıcı bir role sahiptir. Bu bağlamda, izolasyonları, kanser ilerlemesinde çok tartışılan rollerine daha fazla ışık tutmak için aşırı ilgi çekici olabilir, bu da önemli klinik etkileri olacaktır12,31. Ayrıca, insan ve preklinik fare tümörü modellerinden başarılı CAF ekstraksiyonu, yeni CAF hedefli ilaçların geliştirilmesini de kolaylaştıracaktır. Bu makale, birincil CAL'leri meme kanserinin singeneik preklinik modelinden verimli bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem bildirmektedir. Deneyime dayanarak, üç deneysel adım çoğunlukla protokolün başarısını etkiler.
Birincisi, sütunda pıhtılaşma ve hücre eflüsünün yavaşlama riski ile ilişkili hücre süspansiyonlarının toplanmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışıyor: aslında, sütundan geçen hücreler birlikte kümelendiğinde, en uygun izolasyon sürecinin altı olasılığı arttı ve son kültürler "kirletici" hücre klonları içeriyordu. İkincisi, son zenginleştirme adımında geçilecek yeterli hücreyi garanti etmek için tükenme geçişinden sonra farklı tümörlerden hücreleri bir araya getirmektir. Son kritik konu, çıkarılan hücreleri yüksek hücre yoğunluklarında kaplamaktır, büyük olasılıkla hücre büyümesini ve koloni genişlemesini 4-5 pasaja kadar artırmak için 24 kuyu plakasının tek bir kuyusundan başlayarak. Hücreler düşük yoğunluklarda tohumlanmışsa, serbest yüzeyde genişlediler ve hızla çoğalmayı durdurdular.
Çeşitli çalışmalar, kanser gelişimini ve istilacılığı teşvik etmedeki rollerini incelemek için hem insan hem de fare kökenli CAF ekstraksiyon yöntemlerini tanımlamaktadır. Bu, meme kanseri, melanom, kolanjiokarsinom ve pankreas adenokarsinom35 , 36 , 37,38dahil olmak üzere birçok tümör türünde yapılmıştır. Bununla birlikte, belirli CAF belirteçlerinin olmaması ve heterojenlikleri nedeniyle, bu süreçlerin sonuçları hala en uygunun altındadır.
Burada, izole edilmiş hücreler, anti-FAP hedefleme moieties ile işlevsel hale getirilen HFn nanokagelerinin CAF hedefleme yeteneğini doğrulamak için kullanılmıştır. CAF'lerin birincil kültürlerinin kullanımı, nanostrateji ex vivo'nun nanodrug optimizasyonunun bu ön aşamasında doğrudan vivo olarak yapmaktan çok daha basit ve uygun maliyetli bir bağlama deneyi ile doğrulanmasına izin vererek önemli bir avantajdı.
Bu anlamda, CAF'lar üzerinde ex vivo testi, CAF'ın en iyi şekilde hedeflenebilmesi için en umut verici nanopartiküllerin taranmasına ve seçilmesine izin vererek in vivo hayvan deneylerinden önce gelebilir. Burada sunulan CAF modeli, nanopartikülleri aktif ilaçlarla yüklerken ön etkinlik çalışmaları için de kullanılabilir. Hayvanlar daha sonra biyodistribasyon, farmakokinetik ve etkinlik çalışmalarını değerlendirmek için kullanılacaktır.
Meme kanserinde fotodinamik tedavi için ferritin nanokabu ve prostat kanseri modellerinde doxorubicin sağlamak için peptit bazlı parçacıklar gibi çeşitli CAF hedefli nanodruglar geliştirilmektedir39,40. Bununla birlikte, nanodrug optimizasyonu için hücre platformları olarak CAL'lerin izolasyonuna odaklanan çok fazla çalışma yok.
Bu protokolün bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, birkaç reaktif ve malzemenin hazırlanmasını ve satın alınmasını gerektiren zaman alıcı bir protokoldür. İkincisi, 4T1 meme tümöründeki CAL'lerin azlığı nedeniyle verimleri düşüktür. Nanopartikül deneyleri, birincil CAL'ler senescence geçirdiğinden ve kültürde uzun süre sürdürülemediğinden, gerekli hücre sayısı elde edilirlenmez planlanmalı ve yapılmalıdır. Sonuç olarak, bu CAF izolasyonu, kültleştirme ve karakterizasyon yöntemi, kanserle mücadelede yeni hedeflenen nanotıpların gelişimini hızlandırmak için güçlü bir araç olabilir.

Son on yıllarda, tümör mikroçevrasyonu tümörün nüksetmesine neden olabileceğinden ve terapötik direnci tetikleyebileceği için tümör hücrelerini öldürmenin genellikle maligniteyi ortadan kaldırmak için yeterli olmadığı ortaya çıktı1,2. Daha sonra yeni bir paradigma ortaya çıktı: tümörü destekleyici faktörlerden mahrum bırakmak ve böylece kemoterapötiklerin etkinliğini artırmak için tümör stromasını hedeflemek3,4,5. Özellikle, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAL'ler) birçok katı tümörde ilginç bir stromal hedeftir6,7. CAL'ler, büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinlerin salgılanması yoluyla kanser hücreleri ve bağışıklık sisteminin hücreleriyle etkileşime giren çok heterojen bir hücre grubudur; hücre dışı matrisi oluşturmak ve yeniden şekillendirmek; ve metastaz oluşumunu etkinleştirin8,9,10,11,12. Tümör tipine bağlı olarak, CAL'ler pro-tümörijenik fonksiyonlar gösterirken, DIĞER CAL alt tipleri tümör baskılayıcı işlevlere sahip gibi görünmektedir13,14. Bu ikiliği daha iyi netleştirmek için, primer ve metastatik tümörlerden GELEN CAL'lerin kapsamlı bir karakterizasyonu önemlidir.
Bu bağlamda, gelişmekte olan bir araştırma alanı, tümör mikroçevrimini yeniden şekillendirebilen aktif moleküller ve ilaçlar sunarak CAL'leri hedeflemek ve/ veya yok etmek için tasarlanmış nanosize ajanların geliştirilmesine odaklanmıştır15,16,17,18. Çeşitli nanopartikül türleri, sitotoksik ilaçlarla CAF ablasyonunu elde etmek, CAF hedefli fotodinamik tedaviyi teşvik etmek veya CAL'leri sessiz bir duruma geri döndürerek veya komşu kanser hücrelerinin apoptozunu tetikleyen TNF ile ilgili apoptoz kaynaklı ligand ekspresyonunu indükle ederek yeniden programlamak için tasarlanmıştır16,19. Ayrıca, birçok nanopartiküllerin belirli biyolojik belirteçleri aktif olarak hedefleme potansiyeli, hedefe caf alt kümelerini seçme umudunu doğurmaktadır. CAF için mutlak özgüllüğü hala sorgulansa da, fibroblast aktivasyon proteini (FAP) pro-tümörijenik stromanın en umut verici hedeflerinden biridir ve nanodrug teslimatını yönlendirmek için sömürülür, böylece CAF hedefli nanoterapötiklerin geliştirilmesi için yol açmaktadır20,21,22.
Bu makale, birincil CAL'lerin singeneik bir murine meme kanseri modelinden izolasyonu açıklanmaktadır ve CAF işaretleyicisi FAP'ı tanımak için tasarlanmış nanopartiküllerin hedefleme yeteneğinin incelenmesinde kullanımlarını raporlamaktadır. Ferritin nanokaveleri yöntemi kurmak için aday nanosistemler olarak kullanılır, çünkü teslimat özellikleri hedefleme moieties23,24'ünyüzeye maruz kalmasıyla şekillenebilir. Ayrıca, ferritinlerin antitümör uygulamalar için mükemmel biyouyumlu mekikler olduğu başarıyla kanıtlanmıştır, bu da yükün tümör kütlesinde hızlı birikmesini tetikler25,26,27. Bugüne kadar, CAF hedefleme nanosistemlerinin preklinik çalışmaları, hücre aktivasyonunu teşvik etmek için büyüme faktörü-beta'yı dönüştürmek ve CAF'lerin bazı immünofenotipik özelliklerinin ifade edilmesi ile kültürde uyarılan fibroblast hücre hatları üzerinde vitro testlere dahil28,29. Bu yöntem genellikle ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına (NIH3T3, LX-2 gibi) uygulanır ve oldukça hızlı ve basittir, birkaç saat veya gün içinde aktif hücreler verir. Bir sınırlama, in vitro stimülasyonun aktif miyofibroblastlara atfedilen bazı genlerin ekspresyonunu teşvik etmesine rağmen, gerçek CAL'lerin tüm biyolojik özelliklerini, özellikle de heterojenliklerini tamamen yeniden yakalayamamasıdır.
Başka bir strateji, birincil CAL'lerin insan veya fare tümörü örneklerinden çıkarılmasını içerir30,31. Bu, CAF aktivasyonunun fizyolojik bir bağlamda gerçekleşmesini ve CAF alt nüfuslarının heterojenliğinin korunmasını sağlar. Araştırma amacına göre, CAL'ler farklı kaynaklardan türetilebilir, böylece en güvenilir koşulu inceleme imkanı sunar. Burada bildirilen protokol, bir murine meme kanseri modelinden CAL'leri hedeflemek için tasarlanmış yeni nanopartiküllerin işlevselliğinin ön değerlendirmesini yapmak isteyen bilim adamları için değerli olacaktır. İzole CAL'ler, kanserin hayvan modellerinde in vivo değerlendirmeye devam etmek için yeterince umut verici nanopartiküllerin taranmasını sağlamak için yararlı olacaktır. Bu, nanopartikül üretiminin ilk adımları sırasında, nanoteknologları nanopartikül tasarımının iyileştirilmesine yönlendirerek, esas olarak optimum hedefleme özellikleri elde etmek için ligand hareketsizleştirme stratejisini göz önünde bulundurarak ilgili olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Store at +15&#176; to +30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody</td>
			<td>Immunological Science</td>
			<td>IS-20022</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FAP Fab fragment (3F2)</td>
			<td>Creative Biolabs</td>
			<td>TAB-024WM-F(E)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028BALB/C</td>
			<td>7 weeks old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-796</td>
			<td>FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2 antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-960</td>
			<td>PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>laser configuration B4-R2-V0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td>contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20&#215; Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2&#8722;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td>reagent for in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose w/o L-Glutamine&#160; w/ Sodium Pyruvate</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7501L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Keep at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>Before use, heat at 56 &#176;C for 30 min to kill all the complement proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Store protected from light at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>They are used in combination with the gentleMACS Dissociator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160; w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB7502L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II imaging system</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>200 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light/fluorescence microscope equipped with camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule</td>
			<td>inverted microscope for live cells with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>Position the magnet on appropriate stand before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Removal Agent</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECMC210A</td>
			<td>Dilute in culture medium 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non essential aminoacids</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3054D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn)&#160;</td>
			<td>Molirom</td>
			<td>MLR-P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB9006L</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-474</td>
			<td>Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer&#39;s instructions, aliquot and store at - 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td>Warm at 37 &#176;C in a water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Primo TC flask</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td>7K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>CL15.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1-luc2</td>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td>Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ET5050B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of breast cancer for the study of targeted nanoparticles

Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAL' ler) tümör mikroçevrim bağlamında önemli aktörlerdir. Tümör hücrelerine göre sayı olarak azalmasına rağmen, CAL'ler tümörün ilerlemesini düzenler ve antitümör bağışıklığından koruma sağlar. Ortaya çıkan antikanser stratejileri, pro-tümörijenik CAL'lerin ablasyonu veya CAL işlevlerinin yeniden programlanması ve aktivasyon durumları yoluyla tümör mikroçevricisini yeniden şekillendirmeyi amaçlamaktadır. Umut verici bir yaklaşım, CAL'leri hedefleyebilen nanosize teslimat ajanlarının geliştirilmesidir, böylece ilaçların ve aktif moleküllerin spesifik olarak teslimine izin verir. Bu bağlamda, BIR hücresel CAF modeli in vitro tarama ve bu tür nanoformülasyonların ön araştırılması için yararlı bir araç sağlayabilir.
Bu çalışma, primer CAL'lerin üç negatif meme kanserinin singeneik 4T1 murine modelinden izolasyonu ve kültürünü açıklar. Manyetik boncuklar, ayrışmış tümörlerden CAL'leri çıkarmak için 2 aşamalı bir ayırma işleminde kullanıldı. Proses verimini doğrulamak için her geçişten sonra akış sitometrisi kullanılarak immünofenotiran kontrol gerçekleştirildi. tümör mikroçevrimi ile başa çıkmak için tasarlanmış farklı nanoformülasyonların hedefleme kapasitesini incelemek için izole CAF'ler kullanılabilir. Floresan etiketli H-ferritin nanokabutlar, yöntemi kurmak için aday nanopartiküller olarak kullanılmıştır. Çıplak veya hedefleme ligand ile eşleştirilmiş nanopartiküller, CAL'lere bağlanması için analiz edildi. Sonuçlar, meme CAL'lerinin ex vivo ekstraksiyonunun, tümörojenik CAL'lerin spesifik hedeflemesi için nanopartikülleri test etmek ve doğrulamak için yararlı bir sistem olabileceğini göstermektedir.

En iyi CAL yalıtımı için in vivo model kurulumu Dişi BALB/c farelerinin meme yağ yastığına 10 adet5 adet 4T1-luc hücresinin enjekte edilmesi implantasyondan 5 gün sonra saplanabilen bir tümör kitlesinin büyümesine yol açar. Tümör hacmi kaliperlere göre, tümör hücre canlılığı ise BLI ile ölçülerek implantasyon sonrası bir ay boyunca tümör büyümesi izlendi. CAL izolasyonu için yeterli bir kurban penceresi bulmak için, bir yandan daha yüksek tümör büyüklüğü ve BLI ile diğer yandan ortaya çıkan tümör ülserasyon ve nekroz arasında optimal bir uzlaşma arandı (Şekil 1). Nekrotik bir çekirdek implantasyondan 20 gün sonra ortaya çıktığı ve 25 ve 30 günde genişlediği için (Şekil 1C'dekiBLI görüntülerinde belge edildiği gibi), 20. gün izolasyon işleminden sonra hücre iyileşmesini optimize etmek için zaman noktası olarak ayarlanmıştır. Tümör elleçleme ex vivo'nunilk adımları sırasında tüm görünür nekrotik alanları dikkatlice çıkardıktan sonra bile, tek hücrelere ayrışma sonunda yüksek oranda ölü hücre bulundu(Tablo 1). Bu yüzde alakalı olabileceğinden, özellikle tümör boyutunun artmasıyla, 4T1 modeli ile çalışırken ölü hücre çıkarılması her zaman gereklidir.
CAL'lerin yalıtım prosedürünün, kültürünün ve karakterizasyonunun optimizasyonu CAF popülasyonu (CD90.2+ CD45-) toplanabilir hücrelerin panelinden izole etmek için iki pasaj daha gereklidir: tümörle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesi ve tümörle ilişkili fibroblastların zenginleştirilmesi (Şekil 2). Tükenme boncuk kokteyli CD45+ hücrelerini verimli bir şekilde kaldırır (sırasıyla, tablo 2 öncesi ve sonrası toplam hücrelerin% 67.35'ini ve% 0.69'unu oluşturur) ve her zaman her sütunda tek bir tümörü işlemek için kullanılmıştır. Tablo 1'degösterildiği gibi, geçen hücrelerin sayısı tükenme adımından sonra ortalama 3 × 106'dan 1'e ×10 5'e düştü. Toplam hücre sayısındaki bu büyük azalma nedeniyle, toplanan hücreleri zenginleştirme adımına geçmeden önce tek bir tüpte en az 2 ila en fazla 4 tümör arasında bir araya getirmek uygundur. Bunu yaparak tümörle ilişkili fibroblast boncukları ile inkübasyon için yeterli sayıda hücre elde edildi ve CD90.2+ CD45- hücrelerin son ortalamasını elde etmek için tek bir ayırma kolonundan geçirildi (Tablo 2).
Doku kültürü plakalarına tohumlandıktan sonra, bu geri kazanılan hücreler plastiğe bağlı ve fibroblastların tipik büyük bir iğ şeklinde morfolojisini ortaya çıkardı (Şekil 3A, B) ve 4T1 tümör hücrelerinden farklı ( Şekil3D). Tükenmeden sonra tümörlerin bir araya alınmaması, tümörle ilişkili fibroblast mikrobeadlarla hücresel verimin bir kültür oluşturamayacak kadar düşük olmasına neden olur. Diğer durumlarda, mikrobeadlarla inkübasyonların süresi ve sıcaklığı dikkatlice korunmadığında, spesifik olmayan bazı bağlamalar meydana gelebilir. Bu gibi durumlarda, zenginleştirme adımları CD90.2- CD45+ ve CD90.2- CD45 ' in daha az verimli ve daha yüksek yüzdeleriydi- CD90.2+ CAL'ler (sırasıyla 5.97 ± 1.5 ve 16.75 ± 1.1) ile birlikte hücreler kurtarıldı (Şekil 4 ve Tablo 3). Bu kirletici hücrelerin, CAL'lerden daha hızlı büyüyen ve birincil CAF kültürüne üstün gelen farklı morfolojiye(Şekil 4B, siyah ok uçları) sahip küçük klonların kültüründeki varlığından sorumlu olması muhtemeldir (Şekil 4C). Bu yetersiz sonuçlar, hem CD90.2 hem de CD45 ekspresyonunun yanı sıra zenginleştirme sürecinin sonunda ve kültürde hücre büyümesi sırasında hücre morfolojisini her zaman çift kontrol ederek önemini doğruladı.
Mühendislik nanodruglarının CAF hedefleme potansiyelini değerlendirmek için izole hücrelerin kullanımı Yeni izole edilmiş CAL'ler, temel araştırmalardan farmakolojik çalışmalara kadar çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu grubun amacı, özellikle CAL'leri hedef alabilen HFn nanokaveleri geliştirmektir. HFn, iki farklı proteinde (daha düşük 1:1 ve daha yüksek 1:5) spesifik bir anti-FAP antikor parçası (HFn-FAP) ile işlevselleştirildi ve CAL'lerle bağlanmaları test edildi. FAP, pro-tümörojenik CAL'lerin yüzey biyobelirteci olarak kullanıldığından, izole EDILMIŞ CAL'lerde FAP ekspresyonunun kontrol etmek temel öneme sahiptir (Şekil 3C). FAP ifadesi, birincil CAF kültürünün orijinal özelliklerini koruduğunu doğrulamak için kültürde 5 pasajdan fazla izlendi.
HFn'deki FAP fonksiyonelizasyonunun, çıplak HFn ile karşılaştırıldığında CAF hedeflemesine önemli bir kaymaya katkıda bulunduğu bulunmuştur ve daha düşük antikor miktarı (1:1) bu etkiyi gözlemlemek için yeterli bulunmuştur (Şekil 5A). Bununla birlikte, bu, in vivo tümör modelini kurmak için kullanılan tümör 4T1 hücreleri ile gözlenmedi, burada çıplak HFn fonksiyonelleştirilmiş HFn'den daha yüksek bağlama gösterdi (Şekil 5B). Bu büyük olasılıkla 4T1 hücrelerinde FAP aşırı ifadesinin olmaması ve HFn'nin hücrelerde HFn alımını düzenleyen TfR1 ile tercihli etkileşimi nedeniyle, bu grup tarafından yaygın olarak bildirildiği gibi27,33. Bu sonuçlar, tümör mikroçevrimi ile başa çıkmak için tasarlanmış nanopartiküllerin hedefleme yeteneğini önceden taramak için meme CAL'lerinin birincil kültürlerini kullanmanın yararlılığını doğrulamamaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg"> Şekil 1: 4T1 tümör modelinin kurulması. Meme yağ yastığına hücreler(10 5 hücre/fare) enjekte edildi. Tümör büyümesi implantasyondan sonra 5, 10, 15, 20, 25ve 30. Tümör hacimleri ve BLI sırasıyla mm3 ve sayı olarak ifade edilir. Sonuçlar ortalama ± SEM (n=6) olarak bildirilmektedir. (C) Hücre implantasyonundan 5, 10, 15, 20, 25 ve 30 gün sonra elde edilen BLI temsili görüntüleri, tümör büyümesini platoya ulaştığı 25. güne kadar doğrular. Analizin son zaman noktasında (30 gün), BLI 25. güne göre artmaz. 20. günden itibaren tümörün orta kısmında nekroz ve ülserasyon bölgeleri belirginleşmeye başlar. Renk Ölçeği: Min = 1.194, Maks = 20.462. Kısaltmalar: BLI = biyolüminesans görüntüleme; SEM = ortalamanın standart hatası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg"> Şekil 2: İzole YFO'ların tümör örneklem hazırlama ve akış sitometrisi karakterizasyonu. Tümörler neşter yardımıyla yaklaşık 1-2 mm'lik(A)küçük parçalara çıkarıldı; (B) doku sindirimi ve eksizyon tümörün mekanik ayrışması sonrası tek hücreli süspansiyon; (C) kırmızı kan hücrelerinin lizizden sonra elde edilen hücre pelezi; (D) kırmızı kan hücrelerinin ve ölü hücrelerin çıkarılmasından sonra elde edilen hücrelerde CD45 ve CD90.2 ekspresyonunun akış sitometrisi analizi, (E) kanserle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesi ve (F) hücrelerin çoğunluğunun CD90.2+ CD45- (mavi dikdörtgen) olduğu kanserle ilişkili fibroblastların zenginleştirilmesinden sonra. Kısaltmalar: CAL'ler= kanserle ilişkili fibroblastlar; CD = farklılaşma kümesi; PE-A = fitoerythrin alanı; FITC-A = floresan izotiyosiyanat alanları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg"> Şekil 3: CAF'ların morfolojik analizi ve FAP ekspresyolojisi. (A, B) CALFs morfolojisi, kültürün tüm pasajlarında optik mikroskopi (2. ve geçiş 5 geçişlerinde farklı düzeyde iz bırakma) ve(D) 4T1 tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında kontrol edildi; ölçek çubukları = 10 μm. (C) Fibroblast aktivasyon proteini (FAP) ekspresyonu, toplanan CD90.2+ CD45hücrelerinde izolasyon sürecinin sonunda moleküler özelliklerini doğrulamak için akış sitometrisi ile değerlendirildi. Antikor lekeli hücreler (mavi grafik) arasında ortalama floresan yoğunluğunu ve pozitif hücrelerin yüzdesini (FAP+) ölçmek için bozulmamış kontrol hücrelerine (kırmızı grafik) floresan eşiği ayarlandı. Kısaltmalar: CAL'ler= kanserle ilişkili fibroblastlar; FAP = fibroblast aktivasyon proteini; CD = farklılaşma kümesi; MFI = ortalama floresan yoğunluğu; Ab = antikor; FITC-A = floresan izotiyosiyanat alanı; FAP+ = FAP pozitif hücreler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg"> Şekil 4: En uygun alt CAF'ler izolasyon işlemi örneği. (A) Son izolasyon adımından sonra akış sitometrisi değerlendirmesi, kirletici CD90.2- CD45+ ve CD90.2 - CD45- hücrelerinin varlığını ortaya koydu. (B) Bu hücreler, (C) kültürdeki üçüncü pasajdan sonra CAL'lere üstün gelen tohumlama üzerine küçük yuvarlak morfolojiye sahip klonlar (panelin sol alt köşesinde siyah ok uçları ve inset) olarak görülebilir. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: CAF = kanserle ilişkili fibroblast; CD = farklılaşma kümesi; PE-A = fitoerythrin alanı; FITC-A = floresan izotiyosiyanat alanları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg"> Şekil 5: HFn nanokaçalarının CAL'lere bağlanması ve 4T1. HFn nanokageleri FLORESAN olarak FITC ile etiketlendi, iki farklı protein-antikor oranında (1:1 ve 1:5) bir anti-FAP antikor parçası (HFn-FAP) ile işlevselleştirildi ve(A)hedef CAL'ler ve (B) 4T1 hücreleri ile 4 °C'de 2 saat boyunca inkübe edildi. Bağlama akış sitometrisi ile değerlendirildi. (A) CAL'lerle HFn-FAP bağlanması, her iki antikor parçası konsantrasyonunda da çıplak HFn'ye kıyasla üç kat artmıştır. Sonuçlar, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapması olarak bildirilmektedir. p = 0.0003; °° p = 0,0021 ; °°° p = 0,0008. Kısaltmalar: CAL'ler= kanserle ilişkili fibroblastlar; FAP = fibroblast aktivasyon proteini; HFn = çıplak nanopartikül veya konjuge olarak kullanılan insan ferritin ağır zincirinin rekombinant varyantı; HFN-FAP = HFn nanopartikülleri, 1:1 ve 1:5 olmak üzere iki HFn:Fab@FAP molar oranında hazırlanan bir anti-FAP antikorunun değişken kısmı ile işlevsel hale getirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Hücre Numarası (ortalama ± SD)</td>
			<td>Ekstraksiyon Verim Toplamı (geçiş başına)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksist tümör (Kırmızı kan hücresi çıkarılması sonrası)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107
</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksist tümör (Ölü hücre sonrası çıkarma sonrası)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105
</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tükenme sonrası kokteyl</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104
</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zenginleştirme sonrası</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104
</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Kanserle ilişkili fibroblastların izolasyonunun her adımından sonra toplam hücre sayısı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hücre Dağılımı (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksist tümör (Ölü hücre sonrası çıkarma sonrası)</td>
			<td>1,81 ± 0,98</td>
			<td>10,78 ± 4,51</td>
			<td>56,57 ± 14,05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tükenme sonrası kokteyl</td>
			<td>69,33 ± 16,75</td>
			<td>0,14 ± 0,13</td>
			<td>0,55 ± 0,63</td>
			<td>39,89 ± 30,31</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zenginleştirme sonrası</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0,09 ± 0,1</td>
			<td>0,09 ± 0,08</td>
			<td>6,69 ± 3,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Kanserle ilişkili fibroblastların izolasyonunun her geçişinden sonra CD90.2 ve CD45 ekspresyonlarına göre hücre dağılımı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hücre Dağılımı (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-
</td>
			<td>CD90.2+ CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45+
</td>
			<td>CD90.2- CD45-
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zenginleştirme Sonrası (havuz yok)</td>
			<td>75,80 ± 2,9</td>
			<td>1,49 ± 0,4</td>
			<td>5,97 ± 1,5</td>
			<td>16,75 ± 1,1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Cd90.2 ve CD45 alt optimal kanser ilişkili fibroblast izolasyon deneyi sonrasında toplanan hücrelerin ekspresyasyonu.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles at JoVE.com

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Bu makale, üçlü negatif meme kanserinin singeneik bir murine modelinden primer kanser ilişkili fibroblastların izolasyonu ve kültürü ve tümör mikroçevrimini hedeflemek için tasarlanmış yeni nanopartiküllerin preklinik çalışması için uygulanması için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır.

Hedeflenen Nanopartiküllerin Çalışması için Meme Kanserinin Singeneik Murine Modelinden Primer Kanserle İlişkili Fibroblastların İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Bu protokol, tümör mikro ortamını hedeflemek için tasarlanmış yeni nanopartiküllerin taranması için birincil kanser ilişkili fibroblastların murin meme kanserinden başarılı bir şekilde izole edildiğini ve kültürlendiğini mümkün kılar. Primer CAF, tümör stromasının in vitro çalışmaları için en güvenilir ve fizyolojik modeli temsil eder. Bu protokolde, optimum verimin nasıl elde edeceğimizi açıklıyoruz.Başlamak için, tümör ayrışması için bir sindirim karışımı hazırlayın ve tüpü sıkıca kapattıktan sonra üç ila beş milimetre tümör parçalarını çözeltiye batırın. Tüpü ters çevirin, tüm tümör parçalarının tüpün altında kapağa doğru bunların uzadığını kontrol edin. Daha sonra tüpü uygun gövdedeki mekanik bir dissosiyatere takın ve özellikle sert tümörler için tasarlanmış bir ayrışma programı çalıştırın.Çalıştırdıktan sonra, tüpü ayırın ve numuneyi hafifçe sallayarak 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için baş aşağı yerleştirin. Daha sonra tüpü uygun gövdedeki dissosiyatere yeniden takın ve sert tümörler için ayrışma programını iki kez çalıştırın, prosedürün sonunda büyük doku parçalarının kalmamasını sağlayın. Numuneyi 50 mililitrelik bir tüpteki 40 mikron hücreli süzgeçten geçirin.Ardından filtreyi 10 mililitre RPMI 1640 orta ve santrifüj ile yıkayın. Santrifüjlemeden sonra, peleti PBS, %0,5 BSA ve iki milimolar EDTA'dan oluşan PBE arabelleğine yeniden ayırın ve hücreleri Trypan Blue ile sayın. 20X bağlama tampon stok çözeltisini steril çift damıtılmış su ile seyrelterek ölü hücre çıkarma bağlama tamponunu onarın.Hücreleri beş mililitre 1X bağlama tamponu ve santrifüj ile yıkayın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 0,1 mililitre ölü hücre çıkarma mikrobu ile yedinci hücrelere kadar 10'a kadar yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, kaputun altına manyetik bir stand hazırlayın ve uçları aşağıyı işaret ederek ferromanyetik ayırma sütunlarını asın.Sütunları 0,5 mililitre soğuk bağlama arabelleği ile dengele ve çözelti akana kadar bekleyin. Kuluçkadan sonra, boncuk ve hücre süspansiyonu için 400 mikrolitre soğuk bağlayıcı tampon ekleyin. Tüm hacmi sütuna yükleyin ve atıksu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.Sütunu 0,5 mililitre soğuk bağlama tamponu ile dört kez yıkayın ve toplam atık suyu aynı tüpte toplayın. Kanserle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesi için, PBS ile nemlendirilmiş 70 mikron hücreli bir süzgeç kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin ve hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve peleti 80 mikrolitre soğuk PBE tamponunda yeniden depolayın.Tümörle ilişkili olmayan 20 mikrolitre fibroblast tükenme kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve numuneyi karanlıkta 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Boncuklarla inkübasyon sırasında, manyetik bir stand üzerinde ferromanyetik tükenme sütunları hazırlayın.Sütunları iki mililitre soğuk PBE arabelleği ile dengele ve çözelti akana kadar bekleyin. Kuluçkadan sonra, boncuk ve hücre süspansiyonu içine 400 mikrolitre tampon ekleyin. Tüm hacmi sütuna yükleyin ve atıksu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.Sütunu iki mililitre PBE ile iki kez yıkayın. Toplam atık suları aynı tüpe toplayın ve atık suları santrifüj edin. Kanserle ilişkili fibroblastların pozitif seçimi için peleti 80 mikrolitre soğuk PBE tamponunda yeniden depola.Daha sonra 20 mikrolitre tümörle ilişkili fibroblast mikrobeadlarda ve örnekleri karanlıkta 15 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, ferromanyetik ayırma kolonlarını manyetik bir stand üzerinde hazırlayın ve 0,5 mililitre soğuk PBE tamponu ile dengelayın. Kuluçkadan sonra, boncuk ve hücre süspansiyonu içine 400 mikrolitre PBE ekleyin.Tüm birimi sütuna yükleyin ve etiketlenmemiş hücrelerin 15 mililitrelik bir tüpe akmasına izin verin. Sütunu 0,5 mililitre PBE arabelleği ile üç kez yıkayın ve toplam atık suları aynı tüpte toplayın. Sütunu mıknatıstan çıkarın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Sütuna bir mililitre PBE ekleyin ve hücreleri boşaltmak için pistonu hemen sütuna itin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini uygun bir DMEM hacminde yeniden depolar ve hücreleri bir doku kültürü plakasında tohumlar. Mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin ve hücrelerin yapışmasını ve büyümesini sağlamak için plakayı 37 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite yerleştirin.Dişi farelerin meme yağ yastığına 4T1 luciferaz hücrelerinin enjekte edilmesi, implantasyondan beş gün sonra tespit edilebilir bir tümör kütlesinin büyümesine yol açtı. CAF izolasyonu için yeterli bir kurban penceresi bulmak için, bir yandan daha yüksek tümör büyüklüğü ve biyolüminesans görüntülemesi ile diğer yandan ortaya çıkan tümör ülserasyon ve nekroz arasında optimal bir uzlaşma arandı. 20. gün, izolasyon işleminden sonra hücre iyileşmesini optimize etmek için zaman noktası olarak ayarlandı.TOPLANAN canlı hücrelerin panelinden, tümörle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesinden ve tümör ilişkili fibroblastların zenginleştirilmesinden, CAL popülasyonunun izole edilmesi için iki bölüme daha ihtiyaç vardı. CAF hücreleri fibroblastlara özgü büyük iğ şeklinde morfolojiyi ortaya çıkardı ve 4T1 tümör hücrelerinden farklıydı. Beş pasajdan fazla izlenen FAP ifadesi, birincil CAF kültürünün orijinal özelliklerini koruduğunu doğrulamaktadır.Mikrobeadlarla inkübasyonların süresi ve sıcaklığı korunmadığında, izole kültür arasında farklı morfolojiye sahip klonlar bulundu. Bu kirletici hücreler daha hızlı büyüdü ve birincil CAF kültürüne üstün geldi. İnsan Ferritin Hfn-FAP fonksiyonelleştirilmiş nano ilaç ile bağlayıcı CAL'ler, çıplak HFN'ye kıyasla bire bir ve bire beş antikor parçası konsantrasyonlarını üç kat artırdı.Aksine, tümör 4T1 hücreleri için çıplak HFN fonksiyonel HFN'den daha yüksek bağlayıcılık gösterdi. İzole CAF'ın verim safsızlığını artırmak için tamponları soğuk tutun, boncuklarla kuluçka süresine saygı gösterin ve son zenginleştirme adımından önce kolon başına dört tümör çekin. İzole EDILMIŞ CAL'ler, preklinik in vivo deneylerine devam etmeden önce bağlama, alma ve farmakolojik etkinlik açısından birkaç aday nano ilacı taramak için kullanılabilir.CAF izolasyonu, nanopartiküllerin tümör mikroçevrimini hedeflemek için kullanılıp kullanılabileceğini test etmemizi sağladı. Böylece kemoterapi ile sinerji içinde çalışan yeni hedefe dönük tedavilerin yolu açilmiş oldu.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Akciğer Kanseri Hedefli Nanopartiküller ile Fotodinamik Tedavi antikanser Etkinliği

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Preklinik Tedaviler Nicel ve Boyuna Değerlendirme A sinjeneik Fare Modeli Yapmış Bir Renal Hücreli Karsinom

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Geri dönüşü olmayan Elektroporasyon etkilerini incelemek için bir Syngeneic pankreas kanseri fare modeli

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic nakli PD-L1 ifade çalışmaya Syngeneic akciğer adenokarsinom hücre

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...