Name: megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

저자는 처음에 실험실에서이 기술을 개발 파비엔 퍼투이와 알리시아 아길라르뿐만 아니라 메틸 셀룰로오스 하이드로 겔의 점탄성 특성을 특징으로 도미니크 콜린 (연구소 찰스 사드론 - 스트라스부르)에게 감사드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 레체 에 데벨로페멘트 en Médecine et Santé Publique)와 ARN 보조금 (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics)에 의해 지원되었다. 줄리 보셔는 퐁디션 부어 라 레체쉬 메디칼 (FRM 교부번호 FDT202012010422)에서 받는 사람입니다.

모든 실험은 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되어야합니다. 비디오에 표시된 모든 프로토콜은 유럽 법과 Etablissement Français du Sang (EFS)의 검토 위원회의 권고에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜의 첫 번째 버전은 원래 분자 생물학 8의방법에서 2018 년에 발표되었다.
참고: 그림 1은 전체 프로세스?...

<ol>
	<li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells.">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels.">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li><li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments.">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li><li>Shin, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells.">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li><li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+platelet+formation+at+a+glance.">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li><li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation.">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li><li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation.">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li><li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin+from+beginning+to+end.">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li><li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function.">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li><li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+intact+bone+marrow.">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation.">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice.">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li></ol>

지난 10 년 동안, mechanobiology생물학은 생물학의 많은 지역에 점점 더 많은 관심을 제기했습니다. 이제 세포를 둘러싼 기계적 환경이 그들의 행동에 중요한 역할을 한다는 것을 일반적으로 인정하며, 메가카르요세포가 세포외 기계적 단서를 감지하고 반응하는 방법을 연구하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다. 특히 대형 포유류의 궤적 뼈 내부에 위치하고 있는 조혈적 붉은 골수를 고려하는 경우...

본체내 세포는 복잡한 3D 마이크로환경을 경험하고, 인접한 세포와 주변 매트릭스 1,2,3로인한 조직 및 감금으로부터의 강성을 포함하는 화학적 및 메카노물리적 단서 간의 상호작용을 받는다. 세포 행동에 대한 강성과 감금의 중요성은 지난 수십 년 동안만 인식되었습니다. 2006년, Engler 외 4의 정액 작업은 세포 분화를 위한 기계적 환경의 중요성을 강조했습니다. 저자는 세포 기질 강성의 변이가 다양한 분화 혈통을 향해 줄기 세포의 방향을 초래한다는 것을 보여주었습니다. 그 이후로, 세포 운명과 행동에 기계 단서의 영향은 점점 인식되고공부되고있다. 그것은 유기체의 가장 부드러운 조직 중 하나임에도 불구하고, 골수는 뼈 안에 갇혀 있는 3D 구조 조직을 가지고 있습니다. 골수 강성은 기술적으로 정확하게 측정하기 어렵지만 15 ~300 Pa 5,6사이에 있는 것으로 추정됩니다. 스트로마 내에서 세포는 서로 단단히 제한됩니다. 또한, 그들 대부분은 혈액 순환을 입력 하는 부비 동 성 혈관쪽으로 마이그레이션. 이러한 조건은 인접 한 셀에 추가 기계적 제약 조건을 만듭니다., 이러한 힘에 적응 해야. 기계적 단서는 메가카요세포 분화 및 프로플라틀 형성에 대한 결과가 최근에 탐구된 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 메가카요세포는 전통적인 액체 배양에서 시험관내에서 분화할 수 있지만, 3D환경으로부터의 기계적 단서가 없기 때문에 부분적으로 생체 내에서 관찰되는 성숙도에 도달하지 못하고 있다 7. 하이드로겔에 내장된 성장하는 선조는 액체 밀리우가 부족한 3D 기계적 단서를 제공합니다.
하이드로겔은 혈액학적 분야에서 수십 년 동안 널리 사용되어 왔으며, 특히 조혈 선조를 정량화하기 위해 식민지 형성 분석에서 세포를 성장시키는 데 사용되어 왔습니다. 그러나, 이러한 하이드로겔은 3D 기계적 환경이 조혈 세포의 성숙과 분화에 미치는 생물학적 영향을 탐구하는 데 거의 사용되지 않았습니다. 지난 몇 년 동안 우리의 실험실은 메틸 셀룰로오스 기반 하이드로겔 8을 사용하여 3D 배양 모델을 개발했습니다. 이 비반응성 물리적 젤은 네이티브 거대 카르요세포 환경의 물리적 제약을 모방하는 유용한 도구입니다. 그것은 메탈옥사이드 군(-OCH3)에의해 하이드록실 잔류물(-OH)의 대체에 의해 셀룰로오스로부터 유래된다. 메틸 대체정도와 메틸셀룰로오스 농도모두 젤화되면 하이드로겔 강성을 결정한다. 이 기술의 개발 단계에서, 30~60Pa 범위의 영의 계수는 메가카요세포 성장에 가장 적합한 겔 강성임을 입증했다 9.
다음 프로토콜은 3D 메틸셀룰로오스 하이드로겔에서 마우스 거대 촉매 선조를 성장시키는 방법을 설명합니다. 이전에는 표준 액체 배양과 비교하여, 이러한 하이드로겔 배양은 메가카요퀴트 폴리플로이이드화의 정도를 증가시키고, 성숙및 세포내 조직을 향상시키고, 액체 배지 9에서다시 중단된 프로플라틀을 연장하기 위해 메가카르요사이클의 용량을 증가시킨다는 것을 이전에 보여주었다. 이 원고는 마우스 골수 Lin−세포의 분리와 3D 배양을 위한 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 포함시키는 프로토콜과 추가 분석을 위한 프로플라틀을 생성하는 능력의 정량화를 자세히 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1001735825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge neeldes</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoclips</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/CLIPSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnels equiped with filter cards</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/JC304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cytospin 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>41 966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Sterile Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnets</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19856A</td>
			<td>biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&#8211;4) and streptavidin-coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock 1 mL syringes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z551546-100EA</td>
			<td>or 309628 syringes from BD MEDICAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringes connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3%</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>HSC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysin coated slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J2800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG 100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>1037-016</td>
			<td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &#956;g/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant hirudin</td>
			<td>Transg&#232;ne</td>
			<td>rHV2-Lys47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human trombopoietin (rhTPO)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>2822</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 10 mL plastique tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 5 mL polystyrene tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement

감금과 기계적 제약으로 이어지는 3D 환경은 세포 행동의 중요한 결정요인으로 점점 더 인식되고 있습니다. 따라서 3D 배양은 생체 내 상황에 더 잘 접근하기 위해 개발되었습니다. 메가카요세포는 골수(BM)에서 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)와 분화한다. BM은 뼈 안에 갇혀 있는 신체의 가장 부드러운 조직 중 하나입니다. 뼈는 세포 규모에서 제대로 확장되지 않으며, 메가카요세포는 약한 강성과 높은 감금을 수반한다. 이 프로토콜은 면역 자기 분류에 의한 마우스 계보 음성(Lin-) HSPC의 회수 방법을 제시하고 메틸셀룰로오스로 구성된 3D 배지에서 성숙한 메가카요사이클로 분화한다. 메틸셀룰로오스는 메가카요세포로 반응하지 않으며 그 강성은 정상적인 골수에 맞게 조정되거나 병리학적인 섬유질 골수를 모방하기 위해 증가될 수 있다. 추가 세포 분석을 위해 메가카요세포를 복구하는 프로세스는 또한 프로토콜에 상세합니다. 프로플라츠판 확장은 3D 밀리유 내에서 방지되지만, 액체 배지에서 거대 카르요퀴트를 재중단하고 프로플라츠를 확장하는 능력을 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 3D 하이드로겔에서 자란 메가카요세포는 액체 밀리우에서 자란 것과 비교하여 프로플라츠를 형성하는 더 높은 용량을 가지고 있습니다. 이러한 3D 배양은 i)가 더 높은 성숙 상태에 도달하는 메가카르요세포쪽으로 선조들을 구별할 수 있게 하고, ii) 생체내에서 관찰될 수 있지만 고전 액체 배양에서 주목받지 못하는 표현형을 회수하고, iii) 3D 환경에 의해 제공되는 기계적 단서에 의해 유도된 변환 경로를 연구할 수 있다.

이 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 원래 2016 년9에혈액에 게시되었습니다.
프로토콜에 따르면, 세포는 액체 또는 메틸셀룰로오스 하이드로겔 배지에서 시드되었다. 액체 매체의 세포는 모두 딱딱한 플라스틱 표면과 접촉하고 다른 세포와 언젠가 접촉하여 우물 의 바닥에 퇴적되어 있습니다. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 내장된 세포는 겔?...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

이제 세포의 3차원 환경이 행동, 성숙 및/또는 분화에서 중요한 역할을 할 수 있음을 인정합니다. 이 프로토콜은 거대 카르요세포에 대한 물리적 봉쇄 및 기계적 제약의 영향을 연구하도록 설계된 3차원 세포 배양 모델을 설명합니다.

세포 성숙을 개선하고 강성과 감금의 영향을 연구하기 위해 3D 메틸셀룰로오스 기반 하이드로겔의 메가카요세포 배양

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

이 프로토콜은 네이티브 거대 카르요세포가 골수에서 그들의 행동과 성숙에 노출된 감금 및 중간 강성의 영향의 체외 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호 작용을 제거하고 기계적 측면에 초점을 맞춘 단순화 된 모델입니다. 좋은 실험실 실습 및 멸균 작업 조건은 엄격하게 관찰되어야 합니다.실제로, 하이드로겔의 약간의 오염조차도 메가카요세포 분화에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 하이드로겔 세포 배양의 단일 우물을 얻으려면 실온에서 3 % 메틸 셀룰로오스의 1 밀리리터 알리쿼트 2 개를 해동한 다음 먼저 1 밀리리터를 끌어서 메틸 셀룰로오스로 1 밀리리터 루어 잠금 주사기를 코팅한 다음 모든 것을 추방합니다. 다음으로, 동일한 주사기와 바늘을 사용하여 신선한 알리쿼트에서 메틸셀룰로오스 333 마이크로리터를 그립니다.바늘을 조심스럽게 제거 한 후, 살균 된 집게를 사용하여 주사기 의 끝에 Luer 잠금 커넥터를 나사로 고정 한 다음 두 번째 비 코팅 된 1 밀리리터 Luer 잠금 주사기를 커넥터에 부착하십시오. 마찬가지로 두 주사기 사이에 메틸 셀룰로오스를 분배하고 따로 둡니다. 다음으로, 167마이크로리터당 6개의 세포에 10배의 밀도로 집중배양배지에서 이전에 격리된 마우스 계보 음성 조혈 줄기 및 전구세포를 재중단한다.셀 서스펜션의 커넥터 및 파이펫 167 마이크로리터에서 주사기 중 하나를 커넥터에 직접 분리하는 동시에 주사기 플런저를 천천히 그리는 동시에 셀 서스펜션을 위한 공간을 마련합니다. 커넥터에 모든 셀 서스펜션을 추가한 후 플런저를 더 끌어내어 커넥터에서 서스펜션을 철회하고 두 번째 주사기를 조심스럽게 다시 연결하여 나사 스레드에서 서스펜션을 잃지 않도록 주의하십시오. 세포 현탁액으로 메틸셀룰로오스 배지를 균질화하려면 두 주사기 사이에 플런저를 10번 앞뒤로 천천히 이동한 다음 총 부피를 하나의 주사기로 끌어들이고 두 주사기를 분리하여 커넥터를 빈 상태로 둡시합니다.주사기의 내용물들을 4웰 플레이트 한 웰에 비우고 이산화탄소 5% 미만의 37도에서 플레이트를 배양합니다. 프로플라슬을 분석하기 위해, 문화의 셋째 날에, 신중하게 1 %의 PSGDMEM의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 모든 세포를 잘 전송합니다. 메틸셀룰로오스를 완전히 희석시키기 위해 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 다시 중단한 다음 실온에서 300배 G에서 5분간 튜브를 원심분리합니다.상체를 폐기한 후, 완전한 배양 배지의 1밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단하고 4웰 플레이트의 웰당 500 마이크로리터로 세포를 다시 시드한다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 20X 목표를 가진 브라이트 필드 현미경을 사용하여, 무작위로 잘 당 10 개의 이미지를 획득하여 시야에 너무 많은 세포를 가지고 있지 않도록하고 필드당 적어도 5 메가 카요사이클을 캡처합니다.ImageJ를 사용하여 각 이미지에서 메가카요사이클의 총 수와 프로플라셋을 확장하는 것을 계산하여 프로플라셋을 확장하는 메가카요사이클의 비율을 계산합니다. 향후 분석을 위해 세포를 수정하려면 젤을 방해하지 않고 메틸셀룰로오스 위에 고정 솔루션을 추가합니다. 사용된 고정에 따라 적절한 시간을 기다린 후, P1000 파이펫을 사용하여 메틸셀룰로오스가 균질하게 희석될 때까지 고정 및 젤을 부드럽게 피펫합니다.그리고 동일한 파이펫 팁을 사용하여, DPBS의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 우물의 모든 내용을 전송하고 혼합하여 균질화. 혼합물을 원심분리합니다. 상체를 버리고 원하는 분석에 적합한 매체에서 메가카요세포 펠릿을 재연한다.3일째배양문화시, 액체 배지의 거대카르요세포는 우물 의 바닥에 퇴적되어 딱딱한 플라스틱 표면뿐만 아니라 다른 세포와 접촉하고 있다. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 내장된 세포는 동질적으로 분산되고 인접한 세포로부터 분리된다. 상이한 배양 조건 하에서 메가카요세포의 평균 직경을 분석한 결과, 2%메틸셀룰로오스가 액체 배양에 비해 평균 메가카요사이클지름을 약간 증가시킨다는 것을 보여준다.그러나 메틸셀룰로오스 농도를 0.5% 증가시켜 평균 직경이 작아지는 메가카요사이클 분화를 손상시다. 대표적인 투과 전자 현미경 이미지에서, 골수 내의 생체내에서 분화된 거대 카르요세포의 내 트라이토플라심 막은 묘사된 세포질 계열과 밀접하게 반대되는 것으로 보인다. 액체 배양에서 멤브레인은 주로 세포질 영토의 제한없이 작은 둥근 타원형 모양또는 길쭉한 소포를 가지고 있습니다.대조적으로, 2% 메틸셀룰로오스 배양은 시상 구조와 유사한 세포질 영토를 구분하는 막에 밀접하게 반대했습니다. 문화의 4일째에, 하이드로겔에서 이전에 배양된 거대 카르요세포는 액체 배지에서 배양된 것과 비교하여 프로플라틀 형성이 증가합니다. 프로플라츠를 확장하는 메가카요퀴트의 평균 비율은 메틸셀룰로오스 하이드로겔 프리 배양으로 35~40%에 비해 액체 사전 배양으로 약 15~20%이다.이 절차를 시도할 때, 최종 메틸셀룰로오스 농도의 사소한 변화가 미디어 강성을 크게 수정할 수 있으므로 적절한 볼륨을 매우 정확하게 피펫하는 것이 중요합니다. 하이드로겔에서 세포 성숙에 이어, 메가카요세포는 혈중 세포측정을 통해 계피 및 세포 마커 분석을 위해 회수되거나 전자 현미경 검사또는 관심 있는 단백질의 면역염색을 위해 고정될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Cryopreserved 샘플 복구를 위해 손수 함 장치 실수로 극저온 저장 탱크 떨어졌고

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

마우스 렌즈의 압축 강성을 평가하는 유리 Coverslips는 순차적으로 응용 프로그램 : 스트레인과 형태 학적 분석

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

3D 생물반응기 배양에 의한 활액 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 대규모 제조

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...