Name: megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Фабьена Пертюя и Алисию Агилар, которые изначально разработали эту методику в лаборатории, а также Доминика Коллина (Institut Charles Sadron - Страсбург), который охарактеризовал вязкоупругие свойства гидрогеля метилцеллюлозы. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в медицине и санте-публике) и грантом ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Жюли Бошер является получателем гранта ФДТ2020120104222).

Все эксперименты должны проводиться в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных. Все протоколы, показанные на видео, были выполнены в строгом соответствии с европейским законодательством и рекомендациями Наблюдательно...

<ol>
	<li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells.">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels.">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li><li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments.">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li><li>Shin, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells.">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li><li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+platelet+formation+at+a+glance.">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li><li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., L&#233;on, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation.">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li><li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation.">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li><li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombopoietin+from+beginning+to+end.">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li><li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function.">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li><li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+intact+bone+marrow.">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation.">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice.">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li></ol>

В предыдущее десятилетие механобиология вызывала все больший интерес ко многим областям биологии. В настоящее время общепризнано, что механическая среда, окружающая клетки, играет определенную роль в их поведении, подчеркивая важность изучения того, как мегакариоциты чувствуют и реа?...

Клетки в организме испытывают сложную 3D-микросреду и подвергаются взаимодействию между химическими и механофизическими сигналами, включая жесткость из ткани и ограничение из-за соседних клеток и окружающих матриц 1,2,3. Важность жесткости и удержания для поведения клеток была признана только в последние десятилетия. В 2006 году основополагающая работа Engler et al. 4 подчеркнула важность механической среды для дифференцировки клеток. Авторы продемонстрировали, что изменение жесткости клеточного субстрата привело к ориентации стволовых клеток на различные линии дифференцировки. С тех пор влияние механических сигналов на судьбу и поведение клеток становится все более признанным иизученным. Несмотря на то, что это одна из самых мягких тканей организма, костный мозг имеет 3D-структурную организацию, которая ограничена внутри кости. Жесткость костного мозга, хотя технически трудно измерить точно, по оценкам, лежит между 15 и 300 Па 5,6. Внутри стромы клетки плотно ограничены друг другом. Кроме того, большинство из них мигрируют в сторону синусоидальных сосудов, чтобы войти в кровообращение. Эти условия создают дополнительные механические ограничения на соседние клетки, которые должны приспосабливаться к этим силам. Механические сигналы представляют собой важный параметр, последствия которого для дифференцировки мегакариоцитов и образования проплатлетов были изучены совсем недавно. Хотя мегакариоциты могут дифференцироваться in vitro в традиционной жидкой культуре, они не достигают степени созревания, наблюдаемой in vivo,отчасти из-за отсутствия механических сигналов из 3D-среды 7. Выращивание прародителей, встроенных в гидрогель, приносит 3D-механические сигналы, которых не хватает в жидкой среде.
Гидрогели широко используются в течение нескольких десятилетий в гематологической области, в частности, для выращивания клеток в колониеобразующих анализах для количественной оценки гемопоэтических прародителей. Однако такие гидрогели редко использовались для изучения биологического воздействия 3D-механической среды на созревание и дифференцировку кроветворных клеток. За последние несколько лет наша лаборатория разработала 3D-модель культуры с использованием гидрогеля 8 на основеметилцеллюлозы. Этот нереактивный физический гель является полезным инструментом для имитации физических ограничений нативной среды мегакариоцитов. Его получают из целлюлозы путем замены гидроксильных остатков (-OH) метоксидными группами (-OCH3). Как степень метилозамещения, так и концентрация метилцеллюлозы определяют жесткость гидрогеля после его желляции. На этапе разработки данной методики было продемонстрировано, что модуль Юнга в диапазоне от 30 до 60 Па является оптимальной жесткостью геля для роста мегакариоцитов 9.
Следующий протокол описывает метод выращивания мышиных мегакариоцитарных прародителей в 3D-гидрогеле метилцеллюлозы. Ранее было показано, что по сравнению со стандартной жидкой культурой эта гидрогелевая культура повышает степень полиплоидизации мегакариоцитов, улучшает созревание и внутриклеточную организацию, а также увеличивает способность мегакариоцитов к продлению проплацирования после повторного суспендирования в жидкой среде 9. В данной рукописи подробно описан протокол выделения Lin− клеток костного мозга мыши и их встраивания в гидрогель метилцеллюлозы для 3D-культуры, а также количественная оценка их способности производить проплацелеты и восстановление клеток для дальнейших анализов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1001735825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge needles</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>301155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge neeldes</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well culture dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringes</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+05S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoclips</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/CLIPSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnels equiped with filter cards</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>F/JC304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Cytospin 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>41 966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Sterile Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnets</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19856A</td>
			<td>biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&#8211;4) and streptavidin-coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock 1 mL syringes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z551546-100EA</td>
			<td>or 309628 syringes from BD MEDICAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringes connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3%</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>HSC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysin coated slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J2800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSG 100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>1037-016</td>
			<td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &#956;g/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>13551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant hirudin</td>
			<td>Transg&#232;ne</td>
			<td>rHV2-Lys47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human trombopoietin (rhTPO)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>2822</td>
			<td>10,000 units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 10 mL plastique tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottomed 5 mL polystyrene tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte culture in 3d methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement

3D-среда, приводящая как к ограничению, так и к механическим ограничениям, все чаще признается в качестве важного детерминанта поведения клеток. Таким образом, 3D-культура была разработана для лучшего подхода к ситуации in vivo. Мегакариоциты дифференцируются от гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) в костном мозге (BM). БМ является одной из самых мягких тканей тела, заключенной внутри кости. Поскольку кость плохо растяжима в клеточном масштабе, мегакариоциты одновременно подвергаются слабой жесткости и высокой конфайнментности. В этом протоколе представлен метод восстановления отрицательных (Lin-) HSPC линии мыши путем иммуномагнитной сортировки и их дифференцировки в зрелые мегакариоциты в 3D-среде, состоящей из метилцеллюлозы. Метилцеллюлоза не реагирует по отношению к мегакариоцитам, и ее жесткость может быть скорректирована до нормального костного мозга или увеличена, чтобы имитировать патологический фиброзный костный мозг. Процесс восстановления мегакариоцитов для дальнейших клеточных анализов также подробно описан в протоколе. Хотя расширение проплатлетов предотвращается в 3D-среде, ниже описано, как повторно суспендировать мегакариоциты в жидкой среде и количественно оценить их способность расширять проplatelets. Мегакариоциты, выращенные в 3D-гидрогеле, обладают более высокой способностью к образованию проплацетов по сравнению с теми, которые выращиваются в жидкой среде. Эта 3D-культура позволяет i) дифференцировать прародителей в сторону мегакариоцитов, достигающих более высокого состояния созревания, ii) рекапитулировать фенотипы, которые могут наблюдаться in vivo, но оставить незамеченными в классических жидких культурах, и iii) изучать пути трансдукции, индуцированные механическими сигналами, предоставляемыми 3D-средой.

Данные, полученные с помощью этого протокола, были первоначально опубликованы в Blood в 2016году 9.
Согласно протоколу, клетки были посеяны либо в жидкой, либо в метилцеллюлозно-гидрогелевую среду. Ячейки в жидкой среде все осаждены на дне скважины, в контакте с же...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement at JoVE.com

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

В настоящее время признано, что трехмерная среда клеток может играть важную роль в их поведении, созревании и / или дифференцировки. Этот протокол описывает трехмерную модель клеточной культуры, предназначенную для изучения влияния физической локализации и механических ограничений на мегакариоциты.

Культура мегакариоцитов в 3D-гидрогеле на основе метилцеллюлозы для улучшения созревания клеток и изучения влияния жесткости и удержания

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Этот протокол позволяет in vitro оценить влияние удержания и жесткости среды, которой подвергаются нативные мегакариоциты в костном мозге, на их поведение и созревание. Основным преимуществом этой методики является упрощенная модель, которая исключает взаимодействие клетки и клеточной матрицы и фокусируется на механических аспектах. Надлежащая лабораторная практика и стерильные условия труда должны строго соблюдаться.Действительно, даже незначительное загрязнение гидрогеля может оказать существенное влияние на дифференцировку мегакариоцитов. Чтобы получить одну лунку культуры гидрогелевых клеток, начните с размораживания двух аликвот в один миллилитр 3% метилцеллюлозы при комнатной температуре, затем покройте метилцеллюлозой один миллилитровый шприц Luer lock, сначала вытащая один миллилитр, а затем выталкивая его все. Далее, используя тот же шприц и иглу, вытянете 333 микролитра метилцеллюлозы из свежей аликвоты.После осторожного извлечения иглы используйте стерилизованные щипцы, чтобы прикрутить разъем замка Luer к концу шприца, а затем прикрепите к разъему второй шприц с замком Luer без покрытия. Равномерно распределите метилцеллюлозу между двумя шприцами и отложите их в сторону. Затем повторно суспендируют ранее выделенные отрицательные гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки линии мыши в концентрированной культурально-питательной среде с плотностью от одного раза 10 до шести клеток на 167 микролитров.Отсоедините один из шприцев от разъема и пипетки 167 микролитров клеточной подвески непосредственно в разъем, одновременно медленно втягивая плунжер шприца, чтобы освободить место для ячеистой подвески. После добавления всей ячеистой подвески в разъем, потяните плунжер дальше, чтобы вынуть подвеску из разъема и осторожно снова подключите второй шприц, заботясь о том, чтобы не потерять подвеску в резьбе винта. Чтобы гомогенизировать метилцеллюлозную среду с клеточной суспензией, медленно перемещайте плунжеры вперед и назад между двумя шприцами 10 раз, затем втягивайте общий объем в один шприц и отсоединяйте два шприца, оставляя разъем на пустом.Опорожняйте содержимое шприца в один колодец четырехстворчатой пластины и инкубируют пластину при 37 градусах под 5% углекислого газа. Для анализа проплац, на третий день культуры аккуратно переложите все клетки из одной лунки в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров ДМЭМ с 1% ПСГ. Повторно суспендируйте клетки, осторожно пипетируя, чтобы полностью разбавить метилцеллюлозу, затем центрифугируйте трубку в течение пяти минут при 300 раз G при комнатной температуре.После выброса супернатанта повторно суспендируют клеточную гранулу в одном миллилитрах полной питательной среды и повторно засевают клетки по 500 микролитров на лунку четырехментной пластины. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия под 5% углекислого газа. На следующий день, используя микроскоп Брайтфилда с объективом 20X, случайным образом получите 10 изображений на скважину, убедившись, что в поле зрения не слишком много клеток и захватите не менее пяти мегакариоцитов на поле.Используя ImageJ, подсчитайте общее количество мегакариоцитов и тех, которые расширяют проplatelets на каждом изображении, чтобы рассчитать долю мегакариоцитов, расширяющих проплацелеты. Чтобы зафиксировать клетки для будущих анализов, добавьте фиксаторный раствор поверх метилцеллюлозы, не нарушая работу геля. Подождав подходящее время в зависимости от используемого фиксатора, используйте пипетку P1000, чтобы аккуратно пипетку фиксатора и геля до тех пор, пока метилцеллюлоза не будет однородно разбавлена.И используя тот же наконечник пипетки, переложить все содержимое скважины в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров DPBS, и гомогенизировать путем перемешивания. Центрифугировать смесь. Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу мегакариоцитов в среде, подходящей для нужного анализа.К третьему дню культуры мегакариоциты в жидкой среде оседают на дне скважины и контактируют с жесткой пластиковой поверхностью, а также с другими клетками. Напротив, клетки, встроенные в гидрогель метилцеллюлозы, равномерно распределены и изолированы от соседних клеток. Анализ среднего диаметра мегакариоцитов при различных условиях культивирования показывает, что 2% метилцеллюлозы незначительно увеличивает средний диаметр мегакариоцитов по сравнению с жидкой культурой.Однако увеличение концентрации метилцеллюлозы на 0,5% ухудшает дифференцировку мегакариоцитов, о чем свидетельствует меньший средний диаметр. На репрезентативных изображениях просвечивающих электронных микроскопий интрацитоплазматические мембраны в мегакариоцитах, дифференцированных in vivo в костном мозге, по-видимому, тесно противоположны очерченным цитоплазматическим территориям. В жидкой культуре мембраны в основном имеют небольшой круглый овальный вид или удлиненные везикулы без разграничения цитоплазматических территорий.Напротив, культура 2% метилцеллюлозы имеет тесно противоположные мембраны с разграничением цитоплазматических территорий, напоминающих структуру in situ. На четвертый день культивации мегакариоциты, ранее культивируемые в гидрогеле, показывают повышенное образование проплатлетов по сравнению с теми, которые культивируются в жидкой среде. Средняя доля мегакариоцитарных проплац, распространяющих проплацелеты, обычно составляет от 15 до 20% с жидким прекультурой по сравнению с 35-40% с предкультурным гидрогелем метилцеллюлозы.При попытке этой процедуры важно очень точно пипетировать соответствующие объемы, так как незначительное изменение конечной концентрации метилцеллюлозы может значительно изменить жесткость среды. После созревания клеток в гидрогеле мегакариоциты могут быть восстановлены для анализа плоидии и клеточных маркеров с помощью проточной цитометрии или зафиксированы для электронной микроскопии или иммуноокрашивания интересующего белка.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Эндотелиальных клеток со-культуры посредником Созревание эмбриональных стволовых клеток человека в поджелудочной железы инсулин продуцирующих клеток в направленной дифференцировки подход

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Устройство для восстановления криоконсервированных образцов случайно уронил в криогенных резервуаров

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Кусочек Культура Метод После Развитие Зуб микробов в эксплантата культуры

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Система по изучению развития щитовидной железы

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Последовательное применение покровные стекла для оценки сжимающей Жесткость объектива мыши: Штамм и Морфометрические анализы

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Измерение Жесткость<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Изоляция и 3D коллаген сэндвич культуры первичных гепатоцитов мыши для изучения роли цитоскелета в Bile Canalicular Формирование в Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Модель культуры клеток адипоцитов для изучения влияния модуляции белка и микро-РНК на функцию адипоцитов

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Крупномасштабное получение мезенхимальных экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости, с помощью 3D-культуры биореактора

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...