Name: proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل MIUR (الوزير الجامعي Ricerca، PRIN 2017 إلى MG) وPOR كالابريا FESR 2014-2020، الإجراء 1.2.2، "INNOPROST".

<ol>
	<li>H&#252;ttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).</li><li>Roobol, M. J., Carlsson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+stratification+in+prostate+cancer+screening.">Risk stratification in prostate cancer screening.</a> Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).</li><li>Principe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prostate-enriched+proteins+by+in-depth+proteomic+analyses+of+expressed+prostatic+secretions+in+urine.">Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine.</a> Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics+identifies+liquid-biopsy+signatures+for+extracapsular+prostate+cancer.">Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer.</a> Nature Communications. 7, 1-10 (2016).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+collection+and+protein+properties+of+expressed+prostatic+secretions+as+a+source+for+biomarkers+of+prostatic+disease.">Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease.</a> Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).</li><li>Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+based+clinical+proteomics:+Applications+to+cancer+research.">Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research.</a> Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).</li><li>Berger, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MStern+blotting-high+throughput+polyvinylidene+fluoride+(PVDF)+membrane-based+proteomic+sample+preparation+for+96-well+plates.">MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).</li><li>Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(STrap)+sample+preparation+method+for+bottom-up+proteomics+analysis.">Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis.</a> Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+Proteomics:+Evaluation+of+Different+Sample+Preparation+Workflows+for+Quantitative,+Reproducible,+and+Improved+Depth+of+Analysis.">Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+and+annotation+of+human+normal+urinary+proteome.">A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+Filter+Aided+Sample+Preparation+(FASP)+and+Multienzyme+Digestion+FASP+Protocols.">Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+sample+preparation+in+96-well+filter+plates+for+quantitative+clinical+proteomics.">Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+A+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).</li><li>Liu, Y., H&#252;ttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+protein+maps+for+biomarker+discovery+and+clinical+research.">Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).</li><li>Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+LC-MS/MS+analysis:+Implication+for+proteomics+experiments.">Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments.</a> Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).</li><li>Muntel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Urinary+Protein+Biomarker+Discovery+by+Data-Independent+Acquisition+on+a+Quadrupole-Orbitrap+Mass+Spectrometer.">Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Differentially+Expressed+Proteins+in+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions+of+Men+with+Organ-confined+Versus+Extracapsular+Prostate+Cancer.">Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).</li><li>Decramer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+in+clinical+proteomics.">Urine in clinical proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).</li><li>Thongboonkerd, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+points+in+urinary+proteomics.">Practical points in urinary proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).</li><li>Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics.">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions.">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li></ol>

جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود تضارب في المصالح.

في هذا العمل، يتم تقديم استراتيجية لتحليل عينات البول EPS. بروتوكول FASP هو الخيار المثالي لعلم البروتيوميات البولية لأنه يسمح بتركيز العينة قبل الهضم الأنزيمي. في الواقع، باستخدام سير العمل هذا، يمكن تحميل عدة مئات من ميكرولترات البول على مرشح واحد ومعالجتها. وعلاوة على ذلك، يوفر الهضم على مرشح الحرية النسبية في اختيار ظروف التشبع. في عملنا، يتم تحقيق تشبع البروتين عن طريق تمييع عينات البول في العازلة التي تحتوي على تريس، SDS وDTT (التركيز النهائي: 50 mM تريس، 1٪ SDS، 50 mM DTT). يتم تشوهات البروتينات بكفاءة مباشرة بعد إذابة العينة ، من أجل تجنب التدهور غير المرغوب فيه عن طريق البروتياز النشط. وقد تم تحسين البروتوكول الأصلي FASP بزيادة حجم يغسل من 100 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر. وبهذه الطريقة، يتم تحقيق إزالة أفضل للمخلفات، وخاصة المنظفات من المرشح.
بعد الهضم الأنزيمي، وتقدير البروتين حسب المعيار الخارجي باستخدام LC-MS/MS سريع، يتم تنفيذ طريقة تعتمد على البيانات قبل الخطوات الأخيرة من البروتوكول، والتي تشمل تنقية StageTip مزدوجة وتحليل LC-MS/MS في وضع DIA، على مواد البدء المتساوية لجميع العينات (2 ميكروغرام).
ويرتبط براعة FASP مع نهج DIA، وهي طريقة حساسة توفير عدد قليل من القيم المفقودة17. في عملنا، تم تحديد 2387 بروتينا وقياسها كميا، مما مكن من رسم ملف تعريف بروتيومي مفصل لبول EPS. كان تحديد 2387 بروتينا وتحديدها كميا ممكنا من خلال إنشاء مكتبة طيفية غنية ، تم الحصول عليها عن طريق تجزئة الببتيدات ذات درجة الحموضة العالية ، وعن طريق طريقة DIA الخاصة بنا ، الموجهة إلى مجموعة واسعة من السلائف m / z. هذا سير العمل حددت أكثر من 80٪ من البروتينات الموجودة سابقا في التحليل المباشر EPS، مما يدل على أن جزءا كبيرا من البروتيوم EPS-البولية مشتق في الواقع من إفرازات البروستاتا أعرب، وبالتالي هو مصدر غني من البروتينات أنسجة البروستاتا محددة26.
في الختام، لدينا تصميم تجريبي الأزواج براعة FASP مع حساسية DIA من أجل الحصول على خريطة غنية من البروتيوم البولية. يوصى بهذه الاستراتيجية لتحليل عينات البول EPS، ولكن يمكن توسيع نطاق استخدامها إلى البروتيوميات البولية بشكل عام، أو حتى لأنواع العينات الأخرى.

التطور المستمر للتكنولوجيات بروتيوميك وعود أن يكون لها تأثير كبير في المساعدة على تشخيص المرض والتنبؤ بالاستجابة للعلاج من خلال توفير خرائط عالية الدقة من التأثيرات الجزيئية الرئيسية الموجودة في مجموعة واسعة من العينات مثل الأنسجة والفلوريدات الحيوية. من وجهة نظر تحليلية ، يقدم البول العديد من المزايا مثل سهولة جمع البروتيوم والاستقرار الكبير فيما يتعلق بالآخرين بيوفلويدس1. تحليل بروتيوميك البول هو من مصلحة خاصة في دراسات اكتشاف العلامات الحيوية على سرطان المسالك البولية، لأنه يسمح أخذ العينات غير الباضعة على مقربة من الأنسجة ذات الأهمية2. على وجه الخصوص ، عينة يبدو أنها واعدة لدراسة الأمراض المرتبطة بالبروستاتا هي EPS-urine3،4 (أي عينة البول التي تم جمعها بعد فحص المستقيم الرقمي (DRE)). هذه العملية الأخيرة قبل جمع العينات يثري البول مع بروتينات البروستاتا محددة. EPS-البول هو مرشح جيد للتحقيق في الاضطرابات المتعلقة غدة البروستاتا5 بما في ذلك سرطان البروستاتا (PCa)، منذ من خلال DRE، يمكن سكب البروتينات التي يفرزها الورم في عينة البول، مما يزيد من فرصة الكشف عن البروتينات سرطان الأنسجة الخاصة.
يلعب قياس الطيف الكتلي دورا حاسما في السماح بالكشف عن المؤشرات الحيوية المحتملة للبروتين وتحديد كميتها. على مدى العقدين الماضيين، سمحت البروتوكولات القائمة على التصلب المتعدد للتحليل البروتيني بالكشف عن عدد متزايد من البروتينات في تشغيل LC-MS/MS واحد بفضل التحسينات المستمرة في أجهزة التصلب المتعدد وفي برنامج تحليل البيانات6.
MS القائم على إعداد عينة بروتيوميك عموما ينطوي على الهضم الأنزيمي من خليط البروتين، والتي يمكن تحقيقها من خلال مجموعة واسعة من البروتوكولات مثل: الهضم في الحل، MStern النشاف7،تعليق محاصرة (S-فخ)8،الصلبة مرحلة تعزيز إعداد العينة (SP3)9،في المرحلة الهضم10 ومرشح إعداد العينة بمساعدة (FASP)11. يمكن استخدام جميع البروتوكولات لعلم البروتيومات البولية، على الرغم من أن النتائج قد تختلف فيما يتعلق بعدد البروتينات والببتيدات المحددة ومن حيث القابلية للاستنساخ12.
وفي هذا العمل، تركز اهتمامنا على تحليل بول EPS بواسطة بروتوكول FASP. تم تصميم بروتوكول FASP في الأصل لتحليل البروتينات المستخرجة من الأنسجة وثقافات الخلايا ، ولكن تم توسيع استخدامه بعد ذلك إلى تحليل أنواع العينات الأخرى ، مثل البول13. فيما يتعلق مباشرة في حل الهضم FASP هو نهج أكثر مرونة بروتيوميك14، لأنه من خلال تحقيق إزالة فعالة من المنظفات وغيرها من الملوثات مثل الأملاح من خليط البروتين قبل الهضم الأنزيمي15، فإنه يسمح باختيار ظروف التشحيم البروتين الأمثل. وعلاوة على ذلك، هناك خاصية إضافية ل FASP وهي أنها توفر وسيلة لتركيز العينة. هذا هو ذات أهمية خاصة لتحليل بروتيوميك البولية، لأنه يسمح للبدء من أحجام عينة كبيرة نسبيا (مئات من microliters). وفي ضوء إمكانات بروتوكول نظام الدراسة المتعلقة بالمعاملات المناخية، ركزت عدة دراسات الاهتمام على أتمتة سير العمل، بهدف الحد من التباين التجريبي ومعالجة عدد مرتفع من العينات بالتوازي مع16عينة.
في سير العمل لدينا، ويتبع FASP من قبل LC-MS / MS اكتساب في تحليل البيانات المستقلة (DIA)، الذي يوفر تغطية البروتيوم عالية، والدقة الكمية الجيدة وانخفاض معدل الإصابة بالقيم المفقودة. أسلوب DIA هو أسلوب حساس حيث يتم تحديد كافة الأيونات لأحداث MS/MS، عكس ما يحدث في تحليل البيانات المعتمدة (DDA) حيث يتم تجزئة الأيونات ذات الكثافة الأعلى فقط. يقوم مطياف الكتلة، الذي يعمل في وضع DIA، بإجراء دورات المسح الضوئي بعرض عزل مختلف يغطي مجموعة السلائف m/z بأكملها. هذا النهج يسمح للكشف عن عدد كبير من الببتيدات في وقت الوحدة ، وتوفير لقطة بروتيوميكس من العينة17. وعلاوة على ذلك، البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة DIA لها سمة أخرى مثيرة للاهتمام: إمكانية التحليل الخلفي18. بيانات DIA أكثر تعقيدا من تلك التي تم الحصول عليها من قبل DDA، لأن أطياف MS/MS في DIA ناتجة عن العزل المشترك للعديد من أيونات السلائف داخل كل نافذة m/z 19. يتم فصل أطياف MS/MS المركبة إلى إشارات ببتيد متميزة ومحددة باستخدام عنصرين أساسيين: مكتبة طيفية وبرنامج مخصص لتحليل البيانات. يتم إنشاء المكتبة الطيفية من خلال تجربة تعتمد على البيانات ، وعادة ما تنطوي على تجزئة الببتيد لتحقيق أقصى قدر من تغطية البروتيوم ، والتي توفر قائمة بالآلاف من أيونات السلائف المحددة تجريبيا وأطياف MS / MS من الببتيدات التي يمكن اكتشافها في العينة قيد النظر. وبدلا من ذلك، يستخدم برنامج تحليل البيانات المعلومات الواردة في المكتبة الطيفية لتفسير بيانات DIA من خلال توليد كروماتوجرامات أيونية مستخرجة محددة تسمح باكتشاف الببتيد وتحديد كميتها. في حين أن تحليل بيانات DIA الخالي من المكتبة أصبح ممكنا الآن ، إلا أن DIA المستندة إلى المكتبة لا تزال توفر نتائج أفضل من حيث تغطية البروتيوم20.
بروتوكول إعداد العينة هنا وصف(الشكل 1)يتكون من الخطوات التالية: خطوة الطرد المركزي (لإزالة حطام الخلية)، FASP الهضم، StageTip تنقية21،كمية من البروتينات وتحليل DIA. وقد تم تصميم هذا البروتوكول لتحليل EPS البول في سياق اكتشاف العلامات الحيوية لسرطان البروستاتا، ولكن يمكن تطبيقه على التحليل البروتيني لأي عينة البول.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

يستخدم بروتوكول العينة بمساعدة المرشح (FASP) على نطاق واسع لإعداد عينات البروتيوميات لأنه يسمح بتركيز العينات المخففة وهو متوافق مع مجموعة واسعة من المنظفات. تعتمد سير عمل البروتيوميات من أسفل إلى أعلى مثل FASP بشكل متزايد على أساليب LC-MS/MS التي يتم إجراؤها في وضع التحليل المستقل للبيانات (DIA) ، وهي طريقة مسح تسمح بتغطية البروتيوم العميقة وانخفاض معدل حدوث القيم المفقودة. 
في هذا التقرير، سنقدم تفاصيل سير العمل الذي يجمع بين بروتوكول FASP، وخطوة تنقية مزدوجة StageTip وLC-MS/MS في وضع DIA لرسم خرائط البروتيوم البولي. كعينة نموذجية، قمنا بتحليل الإفرازات البروستاتا المعبر عنها (EPS) - البول، وهي عينة تم جمعها بعد فحص المستقيم الرقمي (DRE)، والتي هي ذات أهمية في دراسات اكتشاف العلامات الحيوية لسرطان البروستاتا.

يتضمن هذا البروتوكول للتحليل البروتيوميكي البولي الخطوات التالية: هضم FASP ، وتقدير كمية البروتين عن طريق المعايرة القياسية الخارجية ، وتنقية StageTip المزدوجة (SCX و C18)، وتحليل LC-MS / MS في وضع DIA.
بعد هضم البروتين، يتم إجراء الحقن الأولية بعد تنقية StageTip SCX للببتيدات الناتجة. تتم معالجة ملفات LC-MS/MS الخام للحصول على عدد الببتيدات المحددة وعدد البروتينات المحددة ومنطقة الببتيدات المكتشفة. يتم استخدام المساحة الإجمالية التي تم الحصول عليها من خلال تلخيص جميع الببتيدات المحددة لتقدير محتوى البروتين عن طريق الاستيفاء إلى معيار خارجي: هضم بروتين HeLa يتم حقنه بخمس كميات مختلفة (2، 5، 15، 50، 150 نانوغرام، على التوالي). تنوعت كمية البروتين للعينات الست التي تم تحليلها في هذه الدراسة من عينة إلى عينة، مما يدل على متوسط قيمة 78 نانوغرام/ميكرولتر.
بعد تقدير البروتين، يتم تنقية 2 ميكروغرام من البروتينات المهضومة من كل عينة من قبل SCX المتتالية وC18 StageTip قبل تحليل DIA. يتم إنشاء المكتبة الطيفية للبحث في بيانات DIA بعد الكسر المنعكس عالي الأسي رقم الحموضة وتحليل DDA LC-MS/MS لعينة تمثيلية (على سبيل المثال، تجمع عينات). باستخدام المعلمات المذكورة أعلاه، قمنا بتحديد وقياس كمية، تراكميا، 2387 مجموعة بروتين في عينات البول EPS الست قيد النظر(الجدول التكميلي 1 والشكل 4).
من أجل تقييم من وجهة نظر نوعية أهمية قائمة البروتينات المحددة والمحددة كميا ، تمت مقارنة المصفوفة التي تم الحصول عليها بقائمة من 624 بروتينا تم تحديدها سابقا في DIRECT- EPS22، وهي عينة تم جمعها في إجراء أكثر توغلا ، والتي أثبتت أنها مصدر مؤشرات بيولوجية لسرطان البروستاتا مرشح مثير للاهتمام. في المجموع، تم الكشف بنجاح عن 508 من أصل 624 بروتينا من خلال بروتوكول FASP/DIA الخاص بنا على بول EPS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> الشكل 1: سير العمل Proteomic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> الشكل 2:تمثيل تصميمنا التجريبي لتحديد كمية البروتين على أساس المعيار الخارجي (هلا هضم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> الشكل 3:الخطوات الرئيسية لتحليل DIA: '1' وضع المكتبة الطيفية من خلال الكسر المنعكس بدرجة الحموضة العالية وتحليل DDA، '2' تحليل العينة باستخدام نهج DIA، '3' تحليل البيانات بواسطة سبكترونوت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> الشكل 4: مؤامرة المرتبة للبروتينات المبامسالك البولية EPS الكشف عنها. يتم وضع علامة على عدد قليل من الزيارات المختارة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول التكميلي 1: جدول تمثيلي للبروتينات الكمية في ست عينات من البول EPS في سبكترونوت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

هنا، نقدم بروتوكول هضم محسن على فلتر مع معلومات مفصلة حول ما يلي: هضم البروتين، وتنقية الببتيد وتحليل اقتناء البيانات المستقلة. يتم تطبيق هذه الاستراتيجية على تحليل عينات إفرازات البول البروستاتا المعبر عنها وتسمح بتغطية عالية للبروتيوم وتنميط خالي من التسمية منخفض القيمة المفقودة للبروتيوم البولي.

بروتيوميك لمحة عن EPS البول من خلال FASP الهضم وتحليل البيانات المستقلة

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

بروتوكول FASP هو نهج مثير للاهتمام لعلم البروتيوميات البولية بسبب توافقه مع المخازن المؤقتة بشدة وبسبب قدرته على تركيز العينة على الفلتر ، وهو أمر بالغ الأهمية لعينات البروتين المخفف. يسمح لنا بروتوكول FASP إلى جانب قياس الطيف الكتلي للتحليل المستقل للبيانات بتحقيق تغطية البروتيوم العميقة في البول EPS ، وهو البول الذي يتم جمعه بعد فحص المستقيم الرقمي. نحن نطبق حاليا الطريقة التي أنت على وشك رؤيتها في جهد اكتشاف العلامات الحيوية حول سرطان البروستاتا.وسوف تظهر الإجراء من قبل ليسيا بريستاغاياكومو، باولا موريلي وكاترينا غابرييل. عينات الطرد المركزي EPS البول في غضون ساعتين من جمع لمدة 10 دقائق في 2, 100 RCF في درجة حرارة الغرفة. ثم، تخزين المضادات الفائقة في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.رمي العينات على الجليد، أو في أربع درجات. لتسريع الإجراء، يمكنك نقل العينات من ناقص 80 إلى ناقص 20 في اليوم السابق للهضم. كحلول المخزون، وسوف تحتاج 500 ملليمولار DTT، 10٪ SDS، واحد الأضراس تريس العازلة في رقم الحموضة ثمانية.تمييع 500 ميكرولتر من كل عينة من عينات البول EPS مع 67 ميكرولتر من SDS، 67 ميكرولتر من DTT و 33 ميكرولتر من العازلة تريس. احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع اهتزاز لطيف. تجميع وحدة تصفية الطرد المركزي مع 10،000 دالتون الوزن الجزيئي قطع.ثم، إضافة 300 ميكرولتر من عينة EPS البول المخفف إلى مرشح. جهاز طرد مركزي في 14، 000 غرام لمدة 20 دقيقة تقريبا. يمكنك مقاطعة الإجراء مؤقتا بعد 15 دقيقة أو نحو ذلك للتحقق مما إذا كان الترشيح يسير بسلاسة.استمر حتى يتم تمرير الحل بالكامل من خلال عامل التصفية. ثم أضف 200 ميكرولتر من عازل اليوريا والطرد المركزي عند 14,000 غرام لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرة ثانية.عندما تدفق من خلال على وشك لمس مرشح، إفراغ مجموعة Eppendorf عن طريق الأنابيب من خلال تدفق. البروتينات آمنة على الفلتر. بالنسبة للكيستين الألكيل، قم بإعداد محلول iodoacetamide قبل الاستخدام مباشرة.تزن حوالي 10 ملليغرام من iodoacetamide في عدد Eppendorf قارورة وحله في العازلة اليوريا بتركيز 9.25 ملليغرام لكل مل، أو من حيث الضرس، 50 ملليمولار. إضافة 50 ميكرولتر من محلول iodoacetamide لكل فلتر وطارد مركزي في 6,000 غرام لمدة 25 دقيقة. سرعة الطرد المركزي أقل سوف تسمح للمرشحات لا لتشغيل الجافة.بعد الألكيل البروتين، وغسل المرشحات مع اثنين على التوالي 200 ميكرولتر aliquots من العازلة اليوريا والطرد المركزي في 14، 000 غرام لمدة 20 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. إضافة 200 ميكرولتر من 50 ملليمولار ثلاثة إيثيل الأمونيوم بيكربونات العازلة والطرد المركزي في 14,000 غرام لمدة 20 دقيقة.كرر هذه الخطوة. بعد الانتهاء من غسل بيكربونات الماضي، نقل وحدة التصفية إلى أنبوب جمع جديدة. ثم، إضافة 60 ميكرولتر من 50 ملليمولار TEAB العازلة.إضافة ميكرولتر واحد من محلول تريبسين بتركيز 200 نانوغرام لكل ميكرولتر من التريبسين. بدلا من ذلك، يمكنك تحضير المخزن المؤقت للهضم لجميع العينات في قارورة Eppendorf وتوزيع 61 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم لكل فلتر. إذا كنت تستخدم ThermoMixer من أجل تجنب تبخر العينة أثناء الحضانة بين عشية وضحاها ، فقم بتغليف كل وحدة تصفية بطبقة من رقائق الألومنيوم ، ثم طبقة من البارافيلم.احتضان العينات في 37 درجة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، نقل المرشحات إلى جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء لتدور قصيرة جدا. بعد الغزل، افتح أغطية Eppendorf وأضف 140 ميكرولتر من الماء.طرد مركزي قنينات في 14, 000 غرام لمدة 25 دقيقة, من أجل جمع الببتيدات. وينبغي أن يكون حجم جمع حوالي 190 ميكرولتر. من أجل إزالة آثار SDS من الهضم ، يوصى بتنقية تبادل cation قوي للببتيدات قبل LC-MS-MS.إعداد أصحاب microcolumn عن طريق ثقب أغطية Eppendorf مع أداة حادة مثل زوج من ملاقط أو مقص. سيستوعب الحامل الميكروفون أثناء الطرد المركزي. نظرا لأنها مملة لإعداد ، يمكن استخدام أصحاب عدة مرات.باستخدام حاد وإبرة، وإزالة لوحة من قرص الاستخراج المناسبة. أقراص الاستخراج هي مواد بوليمرية ناعمة تحتوي على جزيئات ماصة. في هذه الحالة، يرصد ماصة من الجسيمات مع خصائص تبادل cation قوية.استيعاب اللوحة في تلميح ماصة 200 ميكرولتر. باستخدام المكبس دفع المكونات نحو نهاية الطرف. وينبغي دفع القرص الصغير بقوة ، ولكن تجنب القوة المفرطة.أدخل الطرف في الحامل وتجميع ميكروكولون الدوران باستخدام قارورة إيبيندورف ملليلتر التي تمت إزالة الغطاء الأصلي منها. المكونات من إبرة قياس 16 سيكون لها قدرة التحميل من حوالي خمسة ميكروغرام من الببتيدات. شرط microcolumn مع اثنين من يغسل على التوالي.ستعتمد السرعة المناسبة على مدى قوة دفع القرص إلى طرف ماصة. تهدف إلى تحقيق معدل تدفق في ترتيب 20 إلى 30 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة. حاول ألا يجف الطرف أثناء الغسيل وأثناء تحميل العينة.تمييع العينة خمسة أضعاف في محلول الغسيل اثنين وتحميل النتائج في حل بسرعة أبطأ. تهدف إلى معدل تدفق من حوالي 15 إلى 20 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة. إذا لزم الأمر، تجاهل التدفق من خلال.غسل المنظفات المتبقية. ثم، والسماح للقرص لتشغيل الجافة قبل الببتيد elution. نقل microcolumn إلى أنبوب نظيف 1.5 Eppendorf وإضافة على الفور eluent.والتي ستكون سبعة ميكرولترات من محلول خلات الأمونيوم 500 ملليمولار التي تحتوي على 20٪ أسيتونيتريل. تمييع eluate مع 27 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ من أجل خفض النسبة المئوية للمذيبات العضوية ومن ثم حقن اثنين من microliters من الحل الناتج في LC-MS-MS مع الكشف في وضع البيانات تعتمد. سيتم إعطاء تفاصيل حول الإعداد LC-MS المستخدمة في هذا البروتوكول لاحقا في الفيديو.بعد إجراء البحث في قاعدة البيانات والتكامل خطأ الببتيد، حساب منطقة الذروة الشاملة. ثم قارنه بمنحنى معياري خارجي لتقدير تركيز الببتيد في هضم FASP. بعد تقدير كمية الببتيد ، قم بتنقية aliquot جديدة من هضم FASP المقابلة لاثنين من ميكروغرام من الببتيدات من قبل اثنين من تنقية StageTip متتالية كما هو موضح هنا.يستند إعداد LC-MS المستخدم في هذا البروتوكول إلى الحقن المباشر في العمود التحليلي. إذا كنت تستخدم نظاما يحتوي على عمود تعويض اللون، فيمكنك تجنب خطوة تنقية C18 دون اتصال. تذكر استخدام الإبر والمكابس المخصصة لكل مادة كروماتوغرافية.بعد التملط الببتيدات من تلميح المرحلة C18 مع 10 ميكرولتر من eluent، تتبخر جزئيا eluate في جهاز طرد مركزي فراغ لبضع دقائق، في محاولة لتجنب التبخر الكامل. ثم، إضافة 47 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪، ووضع الحل الناتج في قارورة HPLC لتحليل LC-MS. يستند النظام المستخدم هنا إلى تحميل عينة عمود مباشرة دون استخدام عمود تعويض اللون.يتم إجراء الأعمدة التحليلية في المنزل عن طريق سحب الشعرية معرف 75 ميكرومتر بعد إزالة قطعة من طلاء البولي أميد. قد تكون على شكل طرف الناتجة بلطف مع قطع السيراميك. ثم يتم وضع الشعرية في قنبلة التعبئة ومعبأة مع 50 ملليغرام لكل مل الطين isopropanol من C18 ثلاثة ميكرومترات جزيئات المرحلة الثابتة.هناك حاجة لضغط غاز يتراوح بين 10 و 20 قطعة من النيتروجين أو الهيليوم. يمكنك استخدام أعمدة كروماتوغرافية بديلة أو تجارية تعمل بمعدل تدفق شبه ميكروليتر في الدقيقة. تجميع العمود على قطعة تي.يتم توصيل طرفي الأخرى إلى إمدادات الطاقة الجهد العالي وحلقة HPLC. تقييم الجهد رذاذ الأمثل عن طريق تشغيل النظام في تدفق isocratic. ثم ابدأ تحليلك.فصل الببتيدات على مدى ساعتين طويلة تدرج اللوني كما هو معروض. ويتكون الحصول على البيانات من مسح سريع كامل لخدمة التصلب المتعدد يليه 26 مسح MS-MS على نوافذ السلائف ذات العرض المتغير. بدءا من عرض 20 م / ض ، لأول 20 النوافذ التي ستغطي مجموعة م / ض من 350 إلى 750 طومسون.ثم الانتقال إلى عرض 50 م / ض للنوافذ الخمس التالية وتنتهي مع مسح MS-MS واحد، وجود عرض العزل من 200 طومسون. وتمثل الأطراف ذات الأطراف الأوسع نطاقا منطقة أكثر كثافة سكانية من الطيف من حيث وجود سلائف الببتيد. لتحليل DIA سوف تحتاج إلى مكتبة الطيفية.لإنشاء مكتبة طيفية، يمكنك إجراء بعض التجارب المعتمدة على البيانات على نفس نظام LC-MS-MS الذي تستخدمه لاكتساب DIA باستخدام نفس تدرج اللوني. سوف زيادة عينة تجزئة تغطية البروتيوم. نصائح المرحلة يمكن استخدامها للكسر عينة.تبادل cation قوية ومرحلة عكسية أساسية هما بديلان صالحان. تبدأ مع 10 ميكروغرام من مجموعة من هضمات FASP عدة. تحمض العينة باستخدام تركيز نهائي 0.2٪TFA.تحميل الببتيدات على نصائح المرحلة C18 عالية السعة. استخدام أقراص متعددة في حالة وجود كميات الببتيد عالية. للحصول على 10 ميكروغرام من المواد ، ينصح قرصين.تنفيذ تنقية C18 كما هو موضح سابقا. إعداد عدة قوارير لجمع eluate. ما يصل إلى عدد الكسور.في هذه الحالة يتم إنتاج 10 كسور بواسطة الوضوء التدريجي. بعد الغسيل الأخير، أضف 20 ميكرولتر من أول إلونت. 0.2٪ هيدروكسيد الأمونيوم، 10 ملليمولار TEAB، 4٪ أسيتونيتريل.بعد التمليل الكامل للكسر الأول في Eppendorf الأول ، قم بنقل تلميح المرحلة إلى قارورة التجميع التالية. تمييع في 20 خطوات ميكرولتر باستخدام كما eluent, 0.2٪ من هيدروكسيد الأمونيوم, 10 ملليمولار TEAB, ومن ثم زيادة كمية الأسيتونتريل. بعد تجزئة العينة وتشغيل التجارب التابعة للبيانات على كل كسر، قم بإنشاء مكتبة طيفية بواسطة البحث في قاعدة البيانات لبيانات MS-MS.ثم سيتم استيراد المكتبة في برنامج قادر على تحليل بيانات DIA للقياس الكمي للبروتين على أساس حد أدنى من الببتيد الفريد المعين من قبل ما لا يقل عن ثلاثة انتقالات. نتوقع لتغطية مجموعة واسعة من البروتيوم البولية. ويبين هذا الرقم تحديد البروتينات وتحديد كميتها عبر نطاق وفرة، يمتد على مدى خمسة أوامر من الحجم.يجمع سير العمل المعروض هنا بين ميزة التركيز وبراعة بروتوكول FASP مع حساسية وضع المسح DIA. يوفر هذا المزيج خريطة غنية من البروتيوم البولي. منذ إعداد تحليلنا لا يشمل استخدام عمود محاصرة، تم تنقية هضم FASP من قبل كل من تبادل cation قوية وعكس المرحلة نصائح المرحلة.يمكن حذف خطوة نصائح المرحلة المعكوسة عند توصيل عمود تعويض اللون مباشرة بالعمود التحليلي. ينصح باستخدام سير العمل هذا لتحليل عينات البول EPS ولكن يمكن توسيع استخدامه إلى البروتيوميات البولية بشكل عام.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

استخراج وتحليل للتايوانيين دنج الأخضر

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

تحديد المناطق الوظيفية البروتين من خلال تشييد البروتين تشيميريك

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...