Name: proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00
Duration: 14 min 48 s
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这项工作得到了MIUR（米雷尔卡大学部长，PRIN 2017至MG）和POR卡拉布里亚FESR 2014-2020，行动1.2.2，"INNOPROST"的支持。

这项研究得到了卡坦扎罗麦格纳格雷西亚大学机构伦理委员会的批准，RP 41/2018。从所有登记在研究中的患者那里获得书面知情同意。
1. 样品准备
<ol><li>离心机 EPS 尿样在收集后的 2 小时内在 2，100 x g 下收集，在室温下 （RT） 10 分钟。将超自然人储存在-80°C，直到使用。</li>
</ol>2. 样品解冻
<ol><li>将样品从消化前一天的-80°C转移到-20°C。</li>
	<li>在样品处理之前，在 4 °C 下将样品转移 15-20 分钟，然后在 RT 传输。</li>
</ol>3. 试剂准备法斯普
<ol><li>同日，准备以下解决方案：尿素缓冲器、尿素缓冲液中的 50 m 碘乙酰胺 （IAA）、50m 双碳酸氢铵和 500 m 二硫酸酯 （DTT）。</li>
	<li>准备尿素缓冲器（尿素 8 M， 100 mM 特里斯-HCl pH 8）： 10 mL， 重 4，800 毫克尿素，并在添加 1 mL 1 M 特里斯 pH 8 后将其溶解在适当量的 HPLC 水中。每个样品需要800微升的尿素。</li>
	<li>准备 500 mM 二甲基二醇 （DTT）：在 500 μL 的 HPLC 水中溶解 38.5 毫克 DTT。对于每个样本，需要 66.7μL 的 DTT。</li>
	<li>在尿素缓冲区中准备 50 mM IAA：在 1 mL 尿素缓冲区中溶解 9.25 毫克 IAA。对于每个样本，需要 50 μL 的 IAA。</li>
	<li>准备50m三聚苯甲酸氢钠（TEAB）。将 150 μL 的 1 M TEAB 添加到 2.85 mL 的 HPLC 水中。对于每个样本，需要 460 μL 的 TEAB。</li>
	<li>在 HPLC 水中准备一种尝试素 （100 ng/μL） 的解决方案。此解决方案可存储在 -80 °C，并在使用前立即解冻。对于每个样本，需要 2 μL （200 ng）。</li>
</ol>4. FASP 的蛋白质消化
<ol><li>稀释每个 EPS 尿液样本的 500 μL，其中 66.7 μL 为 10% （w/v） 硫酸钠 （SDS），66.7 μL 的 500 mM DTT 和 33.3 μL 的 1 M Tris pH 8，以溶解蛋白质并减少脱硫债券。在 95 °C 下孵化 10 分钟，轻轻摇晃。</li>
	<li>在滤光单元（10 kDa）和离心机中加入300微升稀释的EPS-尿液样本，在14，000 x 克 处加入20分钟。</li>
	<li>在滤清器中加入 200 μL 尿素缓冲器，在 14，000 x g 下将离心机加到 15 分钟内。重复此步骤，然后丢弃流过。</li>
	<li>在 6，000 x g 下加入 50μL 的 IAA 溶液和离心机，25 分钟。</li>
	<li>在 14，000 x g 下加入 200 μL 尿素缓冲器和离心机 20 分钟。重复此步骤，然后丢弃流过。</li>
	<li>在 14，000 x g 下加入 200 μL 的 50 mM 碳酸氢铵缓冲区 （TEAB） 和离心机，20 分钟。重复此步骤。</li>
	<li>将滤芯单元传输到新的收集管中。</li>
	<li>加入 60 μL 的 50 m TEAB 缓冲器和 200 ng 的 trypsin，并在 37 °C 的热混合器中在一夜之间孵化样品。 注意：为了避免样品在夜间孵化过程中蒸发，用一层铝箔包裹每个滤光片单元，然后用一层半膜包裹。</li>
	<li>试穿素孵化后，加入140μL的水，以14，000 x g的离心机25分钟收集消化量（180-200微L）。</li>
</ol>5. 为 SCX 纯化准备试剂
<ol><li>准备 1 mL 洗涤 1 （0.5% 用于微酸 （FA） 和 20% 丙酮三酯 （ACN））， 如下所示： 添加 50 μL 的 10% FA 和 200 μL 的 100% ACN 至 750 μL 的 HLPC 水。对于每个样品，需要 100 μL 的洗涤 1。</li>
	<li>准备 1.5 mL 的洗涤 2 （0.5% FA 和 80% 的 ACN） 如下： 添加 75 μL 的 10% FA 和 1.2 mL 的 100% ACN 到 225 μL 的 HPLC 水。对于每个样品190μL的洗涤2是必要的。</li>
	<li>准备 100 μL 的洗脱溶液（500 mM 醋酸铵 （AA） 和 20% 的 ACN）：加入 25 μL 的 2M AA 和 20 μL 的 100% ACN 到 55 μL 的 HPLC 水。</li>
	<li>准备阶段提普如下。<ol>
<li>使用钝端注射器针（仪表 16）用一层 SCX 树脂包装 200 μL 移液器尖端。将舞台提普插入以前被刺穿的微中柱盖中，以适应微孔。</li>
		<li>将盖子组装到 2 mL 微中心上，从该中心移除原始盖子。刚刚组装的微型 SPE 离心设备应安装在台式离心机中。由于穿孔盖准备乏味，因此可以多次使用。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. SCX 纯化
<ol><li>使用洗涤 2 将每个样品的 30 μL 稀释到 120 μL。</li>
	<li>在提取树脂和离心机顶部添加 50μL 的洗涤 1，在 400 x g 上加 2 分钟，从而对阶段Tip进行条件调理。由于流量阻力取决于提取树脂包装到移液器尖端的力度，离心机速度可能需要调整，以获得 20-30 μL/min 的流速。在样品装载和清洗过程中，尽量不要让尖端干燥。</li>
	<li>用 50μL 的洗涤 2 和离心机在 400 x g 下平衡舞台Tip 2 分钟。</li>
	<li>使用较低的自旋速度加载稀释样品 （120 μL）。</li>
	<li>用 50μL 的洗涤 2 和离心机在 400 x g 下清洗舞台Tip 2 分钟。重复使用50μL的洗涤1。 注意：在此清洗后，树脂必须完全干燥。</li>
	<li>使用较低的自旋速度缓慢地使用 7μL 的高脱溶液（500 mM 醋酸铵 （AA） 和 20% 的 ACN）的 Elute 肽混合物。</li>
	<li>加入 27 μL 的 0.1% FA 以稀释 AA 并获取 LC-MS/MS 初步注射样本。最终稀释到 34 μL 将导致尿液和肽溶液之间的 1：1 体积比（1 μL 的纯化消化将对应于原始尿样 1 μL）。</li>
</ol>7. 使用DDA分析按外部标准进行蛋白质定量 （图2）
<ol><li>通过在LC-MS/MS中注入2μL的肽消化液，并以以下校准曲线对由此产生的总肽面积进行插值，确定样品中的蛋白质含量：</li>
	<li>使用 HeLa 消化库存（1 ng/μL、2.5 ng/μL、7.5 ng/μL、25 ng/μL、75 ng/μL）编写五种不同的 HeLa 消化解决方案（1ng/μL）。</li>
	<li>将每个 Hela 溶液注入重复 （2 μL）中。</li>
	<li>设置 LC-MS/MS 方法。<ol>
<li>在15厘米、75微米（i.d）柱上注入5种 HeLa 肽混合物中的 2μL，并通过 75 分钟的线性梯度分别注入肽，流速为 230 nL/分钟，其中 75 μm i.d 列中含有 3μm C18 二氧化硅颗粒。使用由移动阶段 A（0.1% FA、2% ACN）和移动 B（0.1% FA 和 80% ACN）构成的二元梯度。</li>
		<li>通过在 60 分钟内将移动 B 阶段内容从 6% 增加到 42%，并在额外的 8 分钟内从 42% 增加到 100%， 实现梯度提升。保持 5 分钟 100% B，然后在两分钟内返回到 0% B。</li>
		<li>使用前 12 种方法在 DDA 模式下操作，并将 MS 全扫描范围设置为 350-1800 m/z、分辨率 70，000、ACG 目标 1e6 和最大注射时间 50 ms。将前体离子隔离的质量窗口设置为 1.6 m/z、分辨率 35，000、ACG 目标 1e5、最大喷射时间 120 ms、HCD 碎片在 25 NCE（标准化碰撞能量）和动态排除 15 秒。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用Sequest作为搜索引擎分析原始文件，将人类单体完整蛋白质序列作为数据库。在此处介绍的实验中，该数据库于 2016 年 3 月下载，包含 42.013 个序列。<ol>
<li>使用以下设置： MS 容差 15 ppm ， MS / MS 容差 0 . 02 Da ，通过设置两个错过的位点，尝试普辛作为酶。将莱辛、塞林、三氯苯、酪氨酸（+57.021）的碳水化合物甲基化和蛋氨酸的氧化作为动态修饰，将半胱氨酸的碳水化合物甲基化（+57.021）作为静态修饰。使用假发现率 （FDR） 的截止点将肽和蛋白质识别到 0.01，并通过渗透器过滤掉。</li>
		<li>计算所有 MS1 肽信号的峰值区域。计算肽的总面积。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用用于 HeLa 样品的相同 LC-MS/MS 方法，注入从 EPS-尿液样本中获得的 2μL 肽混合物，并使用用于 HeLa 数据处理的相同参数分析原始文件。</li>
	<li>通过总结所有已识别肽的区域值并插值外部标准曲线来计算肽信号的总强度。这将提供EPS-尿液蛋白消化中肽含量的可接受估计。</li>
</ol>8. C18 阶段提程序的试剂准备
<ol><li>准备 500 μL 溶液 A （0.1% 三氟乙酸 （TFA）， 50% ACN）： 加入 250 μL 的 100% ACN 和 10 μL 的 5% TFA 到 240 μL 的 HPLC 水。</li>
	<li>准备 2 mL 的解决方案 B（0.1% TFA）：将 40 μL 的 5% TFA 添加到 1960 μL 的 HPLC 水中。</li>
	<li>准备 100 μL 的洗脱溶液（0.1% FA，50% ACN）：加入 1 μL 的 10% FA 和 50 μL 的 100% ACN 到 49 μL 的 HPLC 水。</li>
	<li>如前所述准备阶段提普斯。在这种情况下，使用 C18 提取盘。</li>
</ol>9. SCX/C18 阶段提程序
注意：通过 C18 阶段提示协议净化 EPS 尿消化以去除盐分。
<ol><li>从2微克肽开始（初步注射量化）。在洗涤 2 SCX 中稀释消化溶液 4 倍，然后按照上述情况进行（在"SCX 净化"部分）。使用较低的自旋速度（5μL/分钟流速），缓慢地使用 7μL 的高脱溶液（500 mM 醋酸铵 （AA） 和 20% 的 ACN）将肽混合物洗脱。</li>
	<li>用 150 μL 的三氟乙酸 （TFA） 酸化 SCX 提升，以实现低于 3 的 pH 和低于 5% 的有机溶剂浓度。</li>
	<li>将 C18 阶段Tip 与 50μL 的溶液 A 和离心机在 400 x g 下调节 2 分钟。平衡 C18 阶段Tip，50μL 的溶液 B 和离心机在 400 x g 下 2 分钟。</li>
	<li>使用较低的旋转速度缓慢地将样品加载到舞台尖端。</li>
	<li>用 50μL 的溶液 B 和离心机清洗 C18 阶段芯片。</li>
	<li>使用较低的自旋速度，用 10μL 的洗脱溶液慢慢稀释肽混合物。</li>
	<li>在真空离心机中以30°C将高清（10°C）干燥3分钟。添加 47 μL 的 0.1% FA.预期肽浓度为 40 ng/ μL。</li>
</ol>10. DIA 分析 （图 3）
<ol><li>nanoLC 分离：使用 140 分钟的线性梯度分离肽混合物，流速为 230 nL/min，在 15 厘米、75μm ID 柱上，该柱内装有 3 μm C18 二氧化硅颗粒。<ol>
<li>以 230 nL/分钟的流速执行梯度弹性，并在 90 分钟内将移动 B 阶段内容从 3% 增加到 25%，然后在 30 分钟内从 25% 增加到 40%，最后在 8 分钟内从 40% 增加到 100%。</li>
		<li>100% B 的 10 分钟后，将列与移动阶段 A 等于 15 分钟。</li>
	</ol>
</li>
	<li>质谱参数：使用采用以下扫描周期的方法执行 DIA 分析：（i） 分辨率为 17，500 的完整扫描 MS 事件（AGC 目标 1e6， 最大注射时间 50 ms）， 其次是 （ii） 20 个窗口，隔离宽度为 20 米/z， 起点为 m/z 350，（ii） 5 个窗口为 50 m/z 隔离宽度，（iv） 1 窗口为 200 m/z 隔离宽度，结束 DIA 扫描范围为 1200 m/z。以分辨率 35，000（AGC 目标 5e5、最大注射时间 120 ms 和 25 NCE）执行 DIA 扫描。</li>
</ol>11. 高 pH 逆转阶段 C18 分馏为库生成
注：池 EPS-尿液代表样品的量大于 10 μg，以便通过以下程序构建一个数据依赖库，用于 DIA 分析：
<ol><li>将肽混合物（11μg）酸化0.2%的TFA，并将由此产生的溶液加载到装有两层提取盘的C18 StageTip上，以增加容量。我们估计单个微盘（从16个仪表注射器针）的装载能力在5-10微克范围内。</li>
	<li>C18 净化所述的条件和均衡的静止阶段。</li>
	<li>使用含有 0.2% 氢氧化铵、10 m TEAB 的 elution 溶液，从高 pH 逆转阶段 C18 逐步进行肽分馏 （n=10），并增加 ACN 的 v/v 浓度（4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%、32%、40%、80%）。</li>
	<li>使用 DIA 方法的相同色谱参数分析 10 个分数。使用先前用于初步分析的设置在 DDA 模式下操作质谱仪（参见"使用 DDA 分析按外部标准进行蛋白质定量"）。</li>
</ol>12. 数据分析
<ol><li>通过导入专用于 DIA 分析的软件中高反转阶段 C18 分馏的 DDA LC-MS/MS 实验中获得的蛋白质识别结果，生成光谱库。</li>
	<li>将用于识别和量化的碎片离子的最小和最大数量分别设置为 3 和 6。将获得的结果按 0.01 的 Q 值筛选。</li>
	<li>导入 DIA 原始文件并关联到每个原始文件，与创建光谱库所用的相同的 FASTA 文件。</li>
	<li>将用于蛋白质定量的独特肽的最小和最大数量分别设置为 1 和 10。</li>
	<li>通过总结片段离子峰值区域来计算每个蛋白质的强度。</li>
	<li>生成具有每个样本中量化蛋白质强度的基质。</li>
</ol>

<ol>
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所有作者均声明没有利益冲突。

在这项工作中，提出了分析EPS尿液样本的策略。FASP 协议是泌尿蛋白质组学的理想选择，因为它允许在酶消化之前进行样品浓度。事实上，使用此工作流，可以在单个过滤器上加载数百微升尿液并进行处理。此外，过滤消化在选择变性条件时具有相对的自由度。在我们的工作中，蛋白质变性是通过在含有三分、SDS 和 DTT 的缓冲器中稀释尿液样本（最终浓度：50 mM 三重奏、1% SDS、50 mM DTT）实现的。蛋白质在解冻样品后立即有效变性，以避免活性蛋白酶导致不必要的降解。通过将洗涤量从 100 μL 增加到 200 μL，改进了原来的 FASP 协议。这样，可以更好地去除残留物，特别是过滤器中的洗涤剂。
酶消化后，使用快速LC-MS/MS按外部标准估算蛋白质，在协议的最后一步之前执行数据依赖方法，其中包括在DIA模式下的双阶段提普纯化和LC-MS/MS分析，所有样品（2 μg）的启动材料相同。
FASP 的多功能性与 DIA 方法相关联，DIA 方法是一种敏感方法，提供少量缺失值17。在我们的工作中，识别和量化了 2387 种蛋白质，从而绘制出 EPS 尿液的详细蛋白质组学轮廓。通过生成丰富的光谱库，通过肽的高pH逆转分馏和我们的DIA方法，针对宽m/z前体范围，可以识别和量化2387种蛋白质。该工作流程确定了超过80%的蛋白质以前在直接EPS分析中发现，表明相当一部分EPS-泌尿蛋白组确实来自表达的前列腺分泌物，因此是前列腺组织特异性蛋白质的丰富来源26。
总之，我们的实验设计将FASP的多功能性与DIA的灵敏度结合在一起，以获得丰富的泌尿蛋白原体图。建议采用此策略分析 EPS 尿液样本，但其使用可扩展到一般泌尿蛋白质组学，甚至扩展到其他样本类型。

蛋白质组技术的不断演变有望通过提供组织和生物流体等各种样本中主要分子效应器的高分辨率地图，对帮助疾病诊断和治疗反应预测产生相当大的影响。从分析的角度来看，尿液提供了几个优点，如易于收集和主要稳定的蛋白体与其他生物流体1。尿液蛋白质组学分析对泌尿癌的生物标志物发现研究特别感兴趣，因为它允许在靠近感兴趣的组织2附近进行非侵入性采样。特别是，似乎对研究前列腺相关病理学有希望的样本是EPS-尿液3，4（即数字直肠检查（DRE）后收集的尿样）。在采集样本之前，后一种操作会用前列腺特异性蛋白质丰富尿液。EPS-尿液是研究前列腺5（包括前列腺癌）相关疾病的一个很好的候选者，因为通过D蕾，肿瘤分泌的蛋白质可以倒入尿样中，增加检测癌症组织特异性蛋白质的机会。
质谱仪（MS）在允许检测和量化潜在蛋白质生物标志物方面发挥着关键作用。在过去的二十年中，基于MS的蛋白质组学分析协议允许在单个LC-MS/MS运行中检测到越来越多的蛋白质，这要归功于MS仪器和数据分析软件6的不断改进。
基于MS的蛋白质组学样品制备通常涉及蛋白质混合物的酶消化，可以通过多种协议实现，如：溶液消化、MStern 印迹7、悬架诱捕 （S 陷阱）8、固相增强样品制备 （SP3）9、阶段内提普消化10 和过滤辅助样品制备 （FASP）11。所有协议可用于泌尿蛋白质组学，即使结果可能因已识别的蛋白质和肽的数量和可重复性12而有所不同。
在这项工作中，我们的注意力集中在FASP协议对EPS尿液的分析上。FASP协议最初旨在分析从组织和细胞培养物中提取的蛋白质，但随后将其用于分析其他样本类型，如尿液13。关于直接溶液内消化FASP是一种更灵活的蛋白质组学方法14，因为通过在酶消化15之前有效地去除洗涤剂和其他污染物，如盐从蛋白质混合物中去除，它允许选择最佳的蛋白质溶解条件。此外，FASP的另一个特点是，它提供了样品浓度的手段。这对泌尿蛋白质组学分析特别感兴趣，因为它允许从相对较大的样本量（数百微升）开始。鉴于FASP协议的潜力，一些研究将注意力集中在工作流程自动化上，目的是减少实验变异性，并同时处理大量样品。
在我们的工作流程中，FASP 之后是数据独立分析 （DIA） 中的 LC-MS/MS 采集，它提供高蛋白体覆盖、良好的定量精度和低缺失值的发生率。DIA 方法是一种敏感方法，所有离子都选择用于 MS/MS 事件，与数据依赖分析 （DDA） 中发生的情况相反，其中只有强度最高的离子是零散的。质谱仪以DIA模式运行，执行扫描周期，扫描宽度不同，覆盖整个m/z前体范围。这种方法允许每单位时间可重复检测大量肽，从而提供样本17的蛋白质组学快照。此外，DIA生成的数据还有另一个有趣的特点：后分析的可能性18。DIA 数据比 DDA 获得的数据更为复杂，因为 DIA 中的 MS/MS 光谱是由于每个m/z窗口19内多个前体离子的共同隔离造成的。使用两个基本元素（光谱库和用于数据分析的专用软件）将复合 MS/MS 光谱分解为独特和特定的肽信号。光谱库由数据依赖实验生成，通常涉及肽分馏，以最大限度地扩大蛋白组覆盖范围，该实验提供了数千个实验确定的前体离子和MS/MS肽光谱的列表，这些肽在样品中被检测到。相反，数据分析软件使用光谱库中包含的信息来解释 DIA 数据，通过生成特定提取的离子色谱图，从而允许肽检测和量化。虽然图书馆免费DIA数据分析现在可行，但基于库的DIA在蛋白体覆盖率20方面仍然提供更好的结果。
此处描述的样品制备协议（图 1）包括以下步骤：离心步骤（去除细胞碎片）、FASP 消化、阶段提普纯化21、蛋白质定量和 DIA 分析。该协议设计用于前列腺癌生物标志物发现背景下的EPS-尿液分析，但可用于任何尿样的蛋白质组分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

过滤器辅助样品协议 （FASP） 广泛用于蛋白质组学样品制备，因为它允许浓缩稀释样品，并且它与各种洗涤剂兼容。自下而上的蛋白质组学工作流（如 FASP）越来越依赖于在数据独立分析 （DIA） 模式下执行的 LC-MS/MS 方法，这是一种允许深度蛋白质组覆盖和低缺失值发生率的扫描方法。 
在本报告中，我们将提供工作流程的详细信息，该工作流结合了 FASP 协议、双阶段Tip 净化步骤和 LC-MS/MS 在 DIA 模式下进行尿生殖器映射。作为模型样本，我们分析了表达的前列腺分泌物（EPS）-尿液，这是在数字直肠检查（DRE）后收集的样本，对前列腺癌生物标志物发现研究感兴趣。

尿蛋白质组分析协议包括以下步骤：FASP消化、通过外部标准校准估计蛋白质量、双阶段Tip纯化（SCX 和 C18）以及 DIA 模式下的 LC-MS/MS 分析。
蛋白质消化后，在阶段Tip SCX纯化产生的肽后进行初步注射。LC-MS/MS 原始文件经过处理，以获得已识别的肽数量、已识别的蛋白质数量和检测到肽的区域。通过总结所有已识别肽获得的总面积用于通过插值到外部标准来估计蛋白质含量：分别以五种不同量（2、5、15、50、150 ng）注射的 HeLa 蛋白质摘要。本研究中分析的六个样本的蛋白质含量因样本而异，平均值为 78 ng/μL。
在蛋白质估计后，通过连续 SCX 和 C18 阶段Tip 在 DIA 分析之前，通过连续 SCX 和 C18 阶段Tip 对每个样本中的 2 μg 消化蛋白质进行纯化。用于搜索 DIA 数据的光谱库是在对代表性样本（例如样本池）进行高 pH 反向相分馏和 DDA LC-MS/MS 分析后创建的。利用上述参数，我们已累计识别和量化了所考虑的六个EPS尿液样本中的2387个蛋白质组（补充表1和图4）。
为了从定性的角度评估已识别和量化蛋白质清单的相关性，所获得的基质与之前在直接EPS22中发现的624种蛋白质的清单进行了比较，该样本是在更具侵入性的程序中收集的，已被证明是有趣的候选前列腺癌生物标志物的来源。总共有 624 种蛋白质中的 508 种通过我们的 EPS-尿液 FASP/DIA 协议成功检测到。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> 图1：蛋白质组工作流。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> 图2：基于外部标准（HeLa摘要）的蛋白质定量实验设计的代表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的更大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> 图3：DIA分析的关键步骤：（ 一） 通过高pH反向相分馏和DDA分析对光谱库进行细化：（二） 使用DIA方法进行样本分析：（三） 光谱库的数据分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> 图4：检测到的EPS-泌尿蛋白的排名图。一些选定的点击被标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
补充表1：光谱中六个EPS-尿液样本中量化蛋白质的代表表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">请单击此处下载此表。</a>

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Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

在这里，我们提出了一个优化的过滤消化协议，并提供了以下详细信息：蛋白质消化、肽纯化和数据独立获取分析。该策略应用于对表达的前列腺分泌物-尿液样本的分析，并允许高蛋白体覆盖率和低缺失值无标签尿素分析。

通过 FASP 消化和数据独立分析，EPS-尿液的蛋白质配置文件

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

FASP 协议是尿生殖器的有趣方法，因为它与强变性缓冲器兼容，并且能够将样品集中在过滤器上，而过滤器对于稀释后的蛋白质样本至关重要。FASP 协议与数据独立分析质谱法相结合，使我们能够在 EPS 尿液中实现深质子覆盖，EPS 尿液是在数字直肠检查后收集的尿液。我们目前正在应用您即将在前列腺癌生物标志物发现中看到的方法。手术将由莉西亚·普雷斯塔贾科莫、保拉·莫雷利和卡特琳娜·加布里埃展示。离心机 EPS 尿样在收集后的两个小时内在室温下 2，100 RCF 收集 10 分钟。然后，将超自然药物存放在零下80摄氏度，直到使用。把样品扔到冰上，或者四度。为了加快程序，您可以在消化前一天将样品从负 80 转移到负 20。作为库存解决方案，您将需要 500 毫升 DTT、10% SDS、一个 pH8 的摩尔 Tris 缓冲器。稀释每个 EPS 尿液样本中的 500 微升，其中 67 微升 SDS、67 微升 DTT 和 33 微升 Tris 缓冲器。在95摄氏度的孵化10分钟，轻轻摇晃。用 10，000 道尔顿分子量切断离心滤光单元组装。然后，在过滤器中加入 300 微升稀释的 EPS 尿液样本。离心机在14，000克约20分钟。您可以在 15 分钟左右后暂时中断手术，以检查过滤是否顺利进行。继续，直到整个解决方案通过过滤器。然后，在14，000克的尿素缓冲器和离心机中加入200微升，15分钟。第二次重复此步骤。当流过即将触摸过滤器时，通过管道排出流过来清空收集的 Eppendorf。蛋白质在过滤器上是安全的。对于半胱氨酸烷基化，请在使用前立即准备一个碘乙酰胺溶液。在Ependorf小瓶中称重约10毫克的碘乙酰胺，并溶解在尿素缓冲中，浓度为每毫升9.25毫克，或用摩尔度术语，50毫摩尔溶解。在每个过滤器中加入 50 微升碘乙酰胺溶液，在 6，000 克的离心机中加入 25 分钟。较低的离心速度将允许过滤器不干。蛋白质碱化后，用连续两个200微升尿素缓冲液和离心机在14，000克下清洗过滤器20分钟。丢弃流经。在 14，000 克的 14，000 克中加入 200 微升 50 毫升三乙基碳酸氢铵缓冲器和离心机 20 分钟。重复此步骤。在完全完成最后一次碳酸氢碳酸酯洗涤后，将滤芯单元转移到新的收集管中。然后，加入 60 微升 50 毫升 TEAB 缓冲器。在每微升试穿素浓度为200纳米的特异素溶液中加入一微升。或者，您还可以为 Eppendorf 小瓶中的所有样品准备消化缓冲，并将消化缓冲液的 61 微升分配到每个过滤器。如果您使用热混合器，以避免在夜间孵化过程中样品蒸发，则用一层铝箔包裹每个滤光单元，然后用一层胶片包裹每个滤光片。在37度一夜之间孵化样品。第二天早上，将过滤器转移到台式顶部离心机，进行很短的旋转。旋转后，打开埃彭多夫盖，加入140微升水。将小瓶以14，000克为下心，25分钟，以收集肽。收集的体积应约为 190 微升。为了去除摘要中的 SDS 痕迹，建议在 LC-MS-MS 之前对肽进行强结节交换纯化。通过用锋利的工具（如一把钳子或剪刀）刺穿 Eppendorf 盖子来准备微孔架。支架将在离心过程中容纳微缩。由于它们准备乏味，持有人可以多次使用。使用钝针和针头，取出适当提取盘的斑块。提取盘是含有吸收颗粒的软聚合物材料。在这种情况下，果冻是由具有强结化交换特性的粒子制成的。将斑块放入 200 微升移液器尖端。使用活塞将插头推到尖端。小圆盘应该紧紧推，但要避免过度的强度。将尖端插入支架，然后使用两毫升 Eppendorf 小瓶组装旋转微胶，从该小瓶中取出原始盖子。仪表16针的插头的装载能力约为5微克肽。用连续两次洗涤来调节微缩。适当的速度将取决于您将光盘推入移液器尖端的力度。目标是实现每分钟 20 到 30 微升的流速率。尽量不要在洗涤和样品装载过程中使尖端干涸。将样品稀释五折，在洗涤溶液中二，以较慢的速度将结果加载到溶液中。目标是每分钟约 15 至 20 微升的流量。如果需要，丢弃流经。洗去残留的洗涤剂。然后，让光盘在肽提取前晾干。将微胶转移到干净的 1.5 埃彭多夫管中，并立即添加 eluent。这将是含有20%丙酮三酯的500毫升醋酸铵溶液中的7微升。用 27 微升 0.1% 的分酸稀释提升液，以降低有机溶剂的百分比，然后在 LC-MS-MS 中注入两个微升溶液，在数据依赖模式下进行检测。有关本协议中使用的 LC-MS 设置的详细信息，将在稍后的视频中给出。执行数据库搜索和肽错误集成后，计算总体峰值区域。然后，将其与外部标准曲线进行比较，以估计 FASP 摘要中的肽浓度。在估计肽量后，通过此处描述的连续两个阶段Tip净化，净化与两微克肽相对应的FASP消化液的新别素。本协议中使用的 LC-MS 设置基于直接注入分析列。如果您使用的系统带有诱捕列，则可以避免离线 C18 净化的步骤。记得使用专用针头和活塞为每个色谱材料。用10微升的椭圆从C18阶段尖端中提取肽后，在真空离心机中部分蒸发液化几分钟，试图避免完全蒸发。然后，加入 47 微升 0.1% 的分酸，并将由此产生的溶液放在 HPLC 小瓶中，用于 LC-MS 分析。此处使用的系统基于直接基于列样本加载，而不使用陷印柱。分析柱是内部制作的，在去除一块聚酰胺涂层后，通过拉动 75 微米 ID 毛细管。由此产生的尖端可能用陶瓷切割机轻轻塑造。然后，毛细亚被放入包装炸弹中，并装上每毫升50毫克的C18三微米静止相粒子的异丙丙醇浆。需要10到20巴氮或氦气压力。您可以使用以每分钟流速低于微升速率运行的替代色谱或商业色谱列。将列组装在 T 件上。其他两端连接到高压电源和 HPLC 循环。通过在等式流中运行系统来评估最佳喷电压。然后，开始分析。将肽分离超过两小时长的色谱梯度，如所示。数据采集将包括快速全MS服务扫描，然后对可变宽度的前体窗口进行26次MS-MS扫描。从 20 米/z 宽度开始，前 20 个窗口的覆盖范围从 350 到 750 汤普森。然后移动到50米/z宽度的以下五个窗口，最后与一个MS-MS扫描结束，隔离宽度为200汤普森。就肽前体的存在而言，较窄的宽度占光谱中人口较多的区域。对于DIA分析，您需要一个光谱库。为了生成光谱库，您可以使用相同的色谱梯度对使用 DIA 获取的相同 LC-MS-MS 系统进行一些数据依赖实验。样本分馏将增加蛋白体覆盖范围。阶段提示可用于样本分馏。强大的交流和基本的反向阶段是两种有效的替代方案。从几个 FASP 摘要池的 10 微克开始。使用 0.2% TFA 最终浓度对样品进行酸化。将肽加载到大容量 C18 阶段提示上。在肽含量高的情况下使用多个光盘。对于 10 微克的材料，建议使用两张光盘。执行前述C18净化。准备几个小瓶，用于提升收藏。多达分数的数量。在这种情况下，10个分数是通过分步高卢产生的。上次洗完后，加入20微升的第一个洗涤器。0.2%氢氧化铵，10毫升TEAB，4%甲基三酯。在完全摆脱了第一个 Eppendorf 的第一个分数后，将舞台提示移动到下一个集合小瓶。稀释在20微升步骤使用作为弹性，0.2%氢氧化铵，10毫升TEAB，然后增加的甲酰胺量。在将样本分馏并按每个分数运行数据依赖实验后，通过对 MS-MS 数据的数据库搜索生成光谱库。然后，该库将导入一个软件，该软件能够根据至少三个过渡分配的一种独特的肽进行蛋白质定量分析。期望覆盖广泛的泌尿蛋白层。此图显示了蛋白质在丰度范围内的识别和定量，跨越五个数量级。此处介绍的工作流程将 FASP 协议的集中优势和多功能性与 DIA 扫描模式的灵敏度相结合。这种组合提供了丰富的尿蛋白组地图。由于我们的分析设置不包括使用诱捕列，FASP 摘要通过强 cation 交换和反向阶段提示进行了净化。当捕获列直接连接到分析列时，可以省略反向阶段阶段提示步骤。建议使用此工作流分析 EPS 尿液样本，但其使用范围一般可扩展到泌尿蛋白质组学。

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科研

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Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

BioID 细胞环境中特异蛋白复合物的分离-蛋白质组学分析

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Langendorff 灌注后离体小鼠心脏 Polysomes 的动态蛋白质组学及 miRNA 分析

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

台湾绿蜂胶的提取与分析

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

用奇米蛋白构建功能蛋白区的鉴定

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

从茶中提取的新建细胞悬浮培养基中六种系统杀虫剂的代谢研究(山茶西宁西斯L.叶

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...