Name: proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 til MG) og af POR Calabria FESR 2014-2020, aktion 1.2.2, "INNOPROST".

Undersøgelsen blev godkendt af Det Institutionelle Etiske Udvalg på Magna Graecia University of Catanzaro, RP 41/2018. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter, der var indskrevet i undersøgelsen.
1. Prøveforberedelse
<ol><li>Centrifuge EPS-urinprøver inden for 2 timer efter indsamling ved 2.100 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten opbevares ved -80 °C, indtil den er i brug.</li>
</ol>2. Prøve optøning
<ol><li>Prøven overføres fra -80 °C til -20 °C dagen før fordøjelsen.</li>
	<li>Inden prøvebehandlingen overføres prøven i 15-20 minutter ved 4 °C og derefter ved RT.</li>
</ol>3. Forberedelse af reagens til FASP
<ol><li>Samme dag fremstilles følgende opløsninger: urinstofbuffer, 50 mM iodoacetamid (IAA) i urinstofbuffer, 50 mM triethylammoniumbicarbonat og 500 mM dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>Forbered urinstofbuffer (urinstof 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): For 10 mL vejes 4.800 mg urinstof og opløses i den passende mængde HPLC-vand efter tilsætning af 1 mL 1 M Tris pH 8. Der kræves et volumen på 800 μL urinstof for hver prøve.</li>
	<li>Forbered 500 mM dithiothreitol (DTT): 38,5 mg DTT opløses i 500 μL HPLC-vand. For hver prøve er der behov for 66,7 μL DTT.</li>
	<li>Forbered 50 mM IAS i urinstofbuffer: 9,25 mg IAS opløses i 1 mL urinstofbuffer. For hver prøve er der behov for 50 μL IAS.</li>
	<li>Forbered 50 mM triethylammonium bicarbonat (TEAB). Der tilsættes 150 μL 1 M TEAB til 2,85 mL HPLC-vand. For hver prøve er der behov for 460 μL TEAB.</li>
	<li>Der fremstilles en opløsning af trypsin (100 ng/μL) i HPLC-vand. Denne opløsning kan opbevares ved -80 °C og optøs umiddelbart før brug. For hver prøve er der behov for 2 μL (200 ng).</li>
</ol>4. Protein fordøjelsen af FASP
<ol><li>500 μL af hver EPS-urinprøve fortyndes med 66,7 μL på 10% (w/v) natrium-dodecylsulfat (SDS), 66,7 μL på 500 mM DTT og 33,3 μL 1 M Tris pH 8 for at opløse proteiner og reducere disulfidbindinger. Inkuber 10 minutter ved 95 °C med skånsom omrystning.</li>
	<li>Der tilsættes 300 μL fortyndet EPS-urinprøve på filterenheden (10 kDa) og centrifuge ved 14.000 x g i 20 minutter.</li>
	<li>Der tilsættes 200 μL urinstofbuffer til filteret og centrifuge ved 14.000 x g i 15 minutter. Gentag dette trin, og kassér derefter flow-through.</li>
	<li>Der tilsættes 50 μL IAS-opløsning og centrifuge ved 6.000 x g i 25 minutter.</li>
	<li>Der tilsættes 200 μL urinstofbuffer og centrifuge ved 14.000 x g i 20 minutter. Gentag dette trin, og kassér derefter flow-through.</li>
	<li>Der tilsættes 200 μL på 50 mM triethylammoniumbicarbonatbuffer (TEAB) og centrifuge ved 14.000 x g i 20 minutter. Gentag dette trin.</li>
	<li>Overfør filterenheden til et nyt opsamlingsrør.</li>
	<li>Der tilsættes 60 μL 50 mM TEAB-buffer og 200 ng trypsin, og prøven inkuberes i en termoblander ved 37 °C natten over. BEMÆRK: For at undgå prøvefordampning under inkubation natten over, skal hver filterenhed pakkes ind med et lag aluminiumsfolie og derefter et lag parafilm.</li>
	<li>Efter trypsininkubation tilsættes 140 μL vand og centrifuge hætteglasset ved 14.000 x g i 25 minutter for at opsamle fordøjevolumenet (180-200 μL).</li>
</ol>5. Reagensforberedelse til SCX-rensning
<ol><li>Der fremstilles 1 ml vask 1 (0,5% myresyre (FA) og 20% acetonær (ACN)) som følger: Der tilsættes 50 μL 10% FA og 200 μL på 100% ACN til 750 μL HLPC vand. For hver prøve er der behov for 100 μL vask 1.</li>
	<li>Der fremstilles 1,5 mL vask 2 (0,5% FA og 80% acn) som følger: Der tilsættes 75 μL 10 % FA og 1,2 mL på 100 % ACN til 225 μL HPLC-vand. For hver prøve er der behov for 190 μL vask 2.</li>
	<li>Der fremstilles 100 μL elutingopløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% ACN): Der tilsættes 25 μL 2 M AA og 20 μL på 100% ACN til 55 μL HPLC-vand.</li>
	<li>Forbered stadietip på følgende måde.<ol>
<li>Der pakkes en 200 μL pipettespids med et lag SCX-harpiks ved hjælp af en stump sprøjtenål (måler 16). Sæt StageTip i et mikrocentrifugelåg, der tidligere er gennemboret for at imødekomme mikrokolonnen.</li>
		<li>Læg låget på en mikrocentrifuge på 2 mL, hvorfra det oprindelige låg blev fjernet. Mikro-SPE centrifugalanordningen, der lige er samlet, skal passe ind i en centrifuge på bænken. Da perforerede låg er kedelige at forberede, kan de bruges flere gange.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. SCX-rensning
<ol><li>30 μL af hver prøve fortyndes til 120 μL ved hjælp af vask 2.</li>
	<li>Trintippet konditioneres ved at tilsætte 50 μL vask 1 oven på udsugningsharpiksen og centrifuge ved 400 x g i 2 minutter. Da strømningsmodstanden afhænger af, hvor stærkt udsugningsharpiksen blev pakket ind i pipettespidsen, kan centrifugehastigheden skulle justeres for at opnå en strømningshastighed på 20-30 μL/min. Lad ikke spidsen være tør under prøveindlæsning og vask.</li>
	<li>StageTip'et skal ligestilles med 50 μL vask 2 og centrifuge ved 400 x g i 2 minutter.</li>
	<li>Den fortyndede prøve (120 μL) indlæses med en lavere spinhastighed.</li>
	<li>Trintippet vaskes med 50 μL vask 2 og centrifuge ved 400 x g i 2 minutter. Gentag med 50 μL vask 1. BEMÆRK: Efter denne vask skal harpiksen være helt tør.</li>
	<li>Elute peptidblanding med 7 μL eluatopløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% af ACN) langsomt ved hjælp af en lavere spinhastighed.</li>
	<li>Der tilsættes 27 μL 0,1 % FA for at fortynde AA og for at få en prøve til forudgående LC-MS/MS-injektion. Den endelige fortynding til 34 μL vil resultere i et volumenforhold på 1:1 mellem urin og peptidopløsning (1 μL renset fordøje vil svare til 1 μL original urinprøve).</li>
</ol>7. Proteinkvantificering efter ekstern standard ved hjælp af DDA-analyse (figur 2)
<ol><li>Proteinmængden bestemmes i prøverne ved at injicere 2 μL af den resulterende peptidoversigt i LC-MS/MS og interpolere det resulterende samlede peptidområde med en kalibreringskurve bygget på følgende måde:</li>
	<li>Der fremstilles fem forskellige HeLa-fordøjeopløsninger (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) ved hjælp af en HeLa-digestsbestand (100 μg/μL).</li>
	<li>Hver Hela-opløsning injiceres i to eksemplarer (2 μL).</li>
	<li>Angiv LC-MS/MS-metoden.<ol>
<li>2 μL af de fem HeLa peptidblandinger indsprøjtes og adskil peptider gennem en lineær gradient på 75 minutter med en strømningshastighed på 230 nL/minut på en 15 cm, 75 μm i.d kolonne pakket med 3 μm C18 silicapartikler. Brug en binær gradient, der består af mobil fase A (0,1% FA, 2% ACN) og mobil fase B (0,1% FA og 80% af ACN).</li>
		<li>Udfør graduering ved at øge mobil fase B-indhold fra 6% til 42% på 60 minutter og fra 42% til 100% på yderligere 8 minutter. Vedligehold i 5 minutter 100% B og derefter flytte tilbage til 0% B i to minutter.</li>
		<li>Operere i DDA-tilstand ved hjælp af en top-12-metode og indstille MS fuld scanning rækkevidde på 350-1800 m / z,opløsning 70.000, ACG mål 1e6 og maksimal injektion tid 50 ms. Sæt massevinduet for prækursor ionisolering til 1,6 m/z, opløsning 35.000, ACG-mål 1e5, maksimal injektionstid 120 ms, HCD-fragmentering ved 25 NCE (normaliseret kollisionsenergi) og dynamisk udelukkelse 15 sekunder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser rå filer ved hjælp af Sequest som søgemaskine, og HUMAN Uniprot Complete proteinsekvensen som databasen. I de eksperimenter, der præsenteres her, blev databasen downloadet i marts 2016 og indeholdt 42.013 sekvenser.<ol>
<li>Brug følgende indstillinger: MS tolerance 15 ppm, MS/MS tolerance 0.02 Da, trypsin som enzym ved at indstille to glemte kavalergangssteder. Karburamidomethylering af lysin, serin, threonine, tyrosin (+57.021) og oxidation af methioniner som dynamiske modifikationer og karbamidthylering af cysteiner (+57.021) som statiske modifikationer. Brug cut-off af falske opdagelse sats (FDR) for peptider og proteiner identifikation til 0,01 og filtrere ud af percolator.</li>
		<li>Beregn toparealet for alle MS1-peptidsignaler. Beregn det samlede areal af peptider.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der injiceres 2 μL peptidblandinger fra EPS-urinprøver ved hjælp af samme LC-MS/MS-metode, der anvendes til HeLa-prøverne, og den rå fil analyseres ved hjælp af de samme parametre, der anvendes til HeLa-databehandling.</li>
	<li>Beregn den samlede intensitet af peptidsignaler ved at opsummere områdeværdier for alle identificerede peptider og interpolere den eksterne standardkurve. Dette vil give et acceptabelt skøn over peptidmængden i eps-urinproteinoversigten.</li>
</ol>8. Forberedelse af reagens til C18 StageTip-protokollen
<ol><li>500 μL opløsning A (0,1% trifluoreddikesyre (TFA), 50% ACN: Der tilsættes 250 μL på 100% ACN og 10 μL 5% TFA til 240 μL HPLC-vand.</li>
	<li>2 ml opløsning B (0,1 % TFA): Der tilsættes 40 μL TFA på 5% til 1960 μL HPLC-vand.</li>
	<li>Der fremstilles 100 μL elutingopløsning (0,1% FA, 50% ACN): Der tilsættes 1 μL 10% FA og 50 μL på 100% ACN til 49 μL HPLC-vand.</li>
	<li>Forbered stadietip som tidligere beskrevet. I dette tilfælde bruges C18-udpakningsdisketter.</li>
</ol>9. SCX/C18 StageTip-protokol
BEMÆRK: Rense EPS-urin fordøjer ved C18 StageTip protokol til at fjerne salte.
<ol><li>Start fra 2 μg peptider (som kvantificeret ved den foreløbige injektion). Fortynd fordøjeopløsningen 4 gange i vask 2 SCX og fortsæt som beskrevet ovenfor (i afsnit "SCX-rensning"). Peptidblandingen elueres med 7 μL eluatopløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% af ACN) langsomt ved hjælp af en lavere spinhastighed (5 μL/min strømningshastighed).</li>
	<li>Scx-eluatet syrnes med 150 μL på 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) for at opnå en pH-grænse på under 3 og en koncentration af organisk opløsningsmiddel på under 5%.</li>
	<li>C18-trintippet konditioneres med 50 μL opløsning A og centrifuge ved 400 x g i 2 minutter. Ekvilibrere C18 StageTip med 50 μL opløsning B og centrifuge ved 400 x g i 2 minutter.</li>
	<li>Indlæs prøven på scenespidsen langsomt ved hjælp af en lavere spinhastighed.</li>
	<li>C18 StageTip vaskes med 50 μL opløsning B og centrifuge.</li>
	<li>Eluer langsomt peptidblandingen med 10 μL elueringsopløsning ved hjælp af en lavere spinhastighed.</li>
	<li>Eluatet tørres (10 μL) ved 30 °C i en vakuumcentrifuge i 3 minutter. Der tilsættes 47 μL på 0,1% FA. Den forventede peptidkoncentration vil være 40 ng/ μL. Analyser ved LC-MS/MS i DIA-tilstand.</li>
</ol>10. Dia-analyse (figur 3)
<ol><li>nanoLC-adskillelse: Adskil peptidblandingen ved hjælp af en lineær hældning på 140 minutter med en strømningshastighed på 230 nL/min. på en 15 cm, 75 μm ID-kolonne fyldt med 3 μm C18 silicapartikler.<ol>
<li>Udfør graduering ved 230 nL/minut flow og øge mobil fase B-indhold fra 3% til 25% på 90 minutter, derefter fra 25% til 40% på 30 minutter og endelig fra 40% til 100% på 8 minutter.</li>
		<li>Efter 10 minutter ved 100% B, ekvilibrere kolonnen med mobil fase A i 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Massespektrometriske parametre: Udfør DIA-analyse ved hjælp af en metode, der anvender følgende scanningscyklus: (i) en MS-hændelse med fuld scanning med en opløsning på 17.500 (AGC-mål 1e6 50 ms) efterfulgt af ii) 20 vinduer ved 20 m/z isolationsbredde, startende fra m/z 350, (ii) 5 vinduer ved 50 m/z isolationsbredde og iv) 1 vindue ved 200 m/z isolationsbredde, hvilket afslutter scanningsområdet for DIA ved 1200 m/z. Udfør DIA-scanninger ved opløsning 35.000 (AGC-mål 5e5, maksimal injektionstid 120 ms og 25 IOU).</li>
</ol>11. Høj pH-bakfase C18-fraktionering til biblioteksgenerering
BEMÆRK: Puljeprøver af EPS-urin i en mængde på over 10 μg med henblik på at opbygge et dataafhængigt bibliotek til DIA-analyse efter følgende procedure:
<ol><li>Peptidblandingen (11 μg) syrnes med 0,2 % af TFA, og den resulterende opløsning belastes på et C18-trinstip, der er fyldt med to lag ekstraktionsskiper for at muliggøre højere kapacitet. Vi anslog lastekapaciteten på en enkelt mikrodisk (fra en 16-gauge sprøjtenål) til at være i området 5-10 μg.</li>
	<li>Tilstand og ekvilibreret stationær fase som allerede beskrevet for C18-rensning.</li>
	<li>Der udføres peptidfraktionering ved trinvis udhuling (n=10) fra høj pH-omvendt fase C18 ved hjælp af elueringsopløsninger, der indeholder 0,2% af ammoniumhydroxid 10 mM TEAB og stigende v/v-koncentrationer af ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%).</li>
	<li>Analyser de 10 brøker ved hjælp af de samme kromatografiske parametre i DIA-metoden. Massespektrometeret anvendes i DDA-tilstand ved hjælp af de indstillinger, der tidligere er valgt til den foreløbige analyse (se "Proteinkvantificering efter ekstern standard ved hjælp af DDA-analyse").</li>
</ol>12. Dataanalyse
<ol><li>Generer spektralbiblioteket ved at importere de proteinidentifikationsresultater, der er opnået fra DDA LC-MS/MS-eksperimenterne med højbakkede fase C18-fraktionering i en software dedikeret til DIA-analyse.</li>
	<li>Det mindste og maksimale antal fragmenter, der anvendes til identifikation og kvantificering, fastsættes til henholdsvis 3 og 6. Filtrer de opnåede resultater med en Q-værdi på 0,01.</li>
	<li>Importer DIA-raw-filer, og knyt den samme FASTA-fil, der bruges til at oprette spektralbiblioteket, til hver rå fil.</li>
	<li>Det mindste og maksimale antal unikke peptider, der anvendes til proteinkvantificering, fastsættes til henholdsvis 1 og 10.</li>
	<li>Beregne intensiteten for hvert protein ved at opsummere fragmention peak area.</li>
	<li>Der genereres en matrix med intensiteten af de kvantificerede proteiner i hver prøve.</li>
</ol>

<ol>
	<li>H&#252;ttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).</li><li>Roobol, M. J., Carlsson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+stratification+in+prostate+cancer+screening.">Risk stratification in prostate cancer screening.</a> Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).</li><li>Principe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prostate-enriched+proteins+by+in-depth+proteomic+analyses+of+expressed+prostatic+secretions+in+urine.">Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine.</a> Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics+identifies+liquid-biopsy+signatures+for+extracapsular+prostate+cancer.">Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer.</a> Nature Communications. 7, 1-10 (2016).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+collection+and+protein+properties+of+expressed+prostatic+secretions+as+a+source+for+biomarkers+of+prostatic+disease.">Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease.</a> Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).</li><li>Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+based+clinical+proteomics:+Applications+to+cancer+research.">Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research.</a> Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).</li><li>Berger, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MStern+blotting-high+throughput+polyvinylidene+fluoride+(PVDF)+membrane-based+proteomic+sample+preparation+for+96-well+plates.">MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).</li><li>Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(STrap)+sample+preparation+method+for+bottom-up+proteomics+analysis.">Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis.</a> Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+Proteomics:+Evaluation+of+Different+Sample+Preparation+Workflows+for+Quantitative,+Reproducible,+and+Improved+Depth+of+Analysis.">Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+and+annotation+of+human+normal+urinary+proteome.">A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+Filter+Aided+Sample+Preparation+(FASP)+and+Multienzyme+Digestion+FASP+Protocols.">Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+sample+preparation+in+96-well+filter+plates+for+quantitative+clinical+proteomics.">Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+A+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).</li><li>Liu, Y., H&#252;ttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+protein+maps+for+biomarker+discovery+and+clinical+research.">Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).</li><li>Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+LC-MS/MS+analysis:+Implication+for+proteomics+experiments.">Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments.</a> Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).</li><li>Muntel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Urinary+Protein+Biomarker+Discovery+by+Data-Independent+Acquisition+on+a+Quadrupole-Orbitrap+Mass+Spectrometer.">Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Differentially+Expressed+Proteins+in+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions+of+Men+with+Organ-confined+Versus+Extracapsular+Prostate+Cancer.">Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).</li><li>Decramer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+in+clinical+proteomics.">Urine in clinical proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).</li><li>Thongboonkerd, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+points+in+urinary+proteomics.">Practical points in urinary proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).</li><li>Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics.">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions.">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li></ol>

Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.

I dette arbejde præsenteres en strategi for analyse af EPS-urinprøver. FASP-protokollen er et ideelt valg til urin proteomics, fordi den tillader prøvekoncentration før enzymatisk fordøjelse. Faktisk kan flere hundrede mikroliter urin indlæses på et enkelt filter og behandles ved hjælp af denne arbejdsgang. Desuden giver fordøjelsen på filter relativ frihed i valget af denatureringsforhold. I vores arbejde opnås protein denaturering ved at fortynde urinprøver i en buffer, der indeholder Tris, SDS og DTT (endelig koncentration: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Proteiner denatureres effektivt umiddelbart efter optøning af prøven for at undgå uønsket nedbrydning ved hjælp af aktive proteaser. Den oprindelige FASP-protokol er blevet forbedret ved at øge mængden af vaske fra 100 μL til 200 μL. På denne måde opnås bedre fjernelse af rester, især rengøringsmidler fra filteret.
Efter enzymatisk fordøjelse, proteinestimering efter ekstern standard ved hjælp af en hurtig LC-MS/MS, udføres dataafhængig metode før protokollens sidste trin, som omfatter dobbelt stagetip-rensning og LC-MS/MS-analyse i DIA-tilstand, på lige udgangsmateriale for alle prøver (2 μg).
Alsidigheden af FASP er forbundet med DIA-tilgangen, en følsom metode, der giver et lavt antal manglende værdier17. I vores arbejde blev 2387 proteiner identificeret og kvantificeret, hvilket gjorde det muligt at tegne en detaljeret proteomic profil af EPS-urin. Identifikation og kvantificering af 2387 proteiner var mulig gennem generering af et rigt spektralbibliotek, opnået via høj pH-omvendt fraktionering af peptider og ved vores DIA-metode rettet mod et bredt m / z prækursorområde. Denne arbejdsgang identificerede over 80% af proteiner, der tidligere blev fundet i direkte EPS-analyse, hvilket viser, at en betydelig brøkdel af EPS-urin proteome faktisk stammer fra udtrykte prostatiske sekreter, og er således en rig kilde til prostatavævsspecifikke proteiner26.
Afslutningsvis parrer vores eksperimentelle design FASP's alsidighed med DIA's følsomhed for at opnå et rigt kort over urinproteomet. Denne strategi anbefales til analyse af EPS-urinprøver, men dens anvendelse kan udvides til urin proteomics generelt eller endda til andre prøvetyper.

Den konstante udvikling af proteomic teknologier lover at have en betydelig indvirkning på at hjælpe sygdom diagnose og forudsigelse af reaktion på behandling ved at give høj opløsning kort over centrale molekylære effektorer til stede i en bred vifte af prøver såsom væv og biofluider. Fra et analytisk synspunkt tilbyder urin flere fordele såsom let indsamling og stor stabilitet i proteomet med hensyn til andre biofluider1. Proteomic analyse af urin er af særlig interesse i biomarkør opdagelse undersøgelser af urologiske kræftformer, da det giver mulighed for noninvasive prøveudtagning i nærheden af væv af interesse2. Især en prøve, der synes at være lovende for at studere prostata-relaterede patologier er EPS-urin3,4 (dvs. en urinprøve indsamlet efter en digital rektal eksamen (DRE)). Sidstnævnte operation forud for prøveopsamling beriger urinen med prostataspecifikke proteiner. EPS-urin er en god kandidat til at undersøge lidelser relateret til prostata5, herunder prostatakræft (PCa), da gennem DRE, proteiner udskilles af tumoren kan hældes i urinprøven, øge chancen for at opdage kræft væv-specifikke proteiner.
Massespektrometrien (MS) spiller en afgørende rolle med hensyn til at muliggøre detektion og kvantificering af potentielle proteinbiomarkører. I løbet af de sidste to årtier har MS-baserede protokoller til proteomic analyse gjort det muligt at opdage et stadigt stigende antal proteiner i en enkelt LC-MS/MS-kørsel takket være løbende forbedringer i MS-instrumentering og i dataanalysesoftware6.
Ms-baseret proteomic prøveforberedelse indebærer generelt enzymatisk fordøjelse af proteinblandingen, som kan opnås via en lang række protokoller såsom: fordøjelse i opløsning, MStern blotting7, suspensionsfangst (S-fælde)8, massivt faseforbedret prøveforberedelse (SP3)9, in-StageTip fordøjelse10 og filtreret hjælpeprøveforberedelse (FASP)11. Alle protokoller kan anvendes til urin proteomics, selv om resultaterne kan variere med hensyn til antallet af identificerede proteiner og peptider og med hensyn til reproducerbarhed12.
I dette arbejde var vores opmærksomhed fokuseret på analysen af EPS-urin ved FASP-protokollen. FASP-protokollen blev oprindeligt designet til at analysere proteiner udvundet fra væv og cellekulturer, men dens anvendelse blev derefter udvidet til analyse af andre prøvetyper, såsom urin13. Med hensyn til ligetil in-solution fordøjelse FASP er en mere fleksibel proteomic tilgang14, da det ved at opnå effektiv fjernelse af rengøringsmidler og andre forurenende stoffer som salte fra proteinblandingen før enzymatisk fordøjelse15giver mulighed for valg af optimale proteinopløselighedsforhold. Desuden er et yderligere kendetegn ved FASP, at det giver mulighed for at udtage prøver. Dette er af særlig interesse for urin proteomic analyse, fordi det gør det muligt at starte fra relativt store prøvemængder (hundredvis af mikroliter). I lyset af FASP-protokollens potentiale har flere undersøgelser fokuseret opmærksomheden på automatisering af arbejdsgange med det formål at reducere eksperimentel variation og behandle et forhøjet antal prøver parallelt16.
I vores arbejdsgang efterfølges FASP af LC-MS/MS-erhvervelse i datauafhængig analyse (DIA), som giver høj proteomdækning, god kvantitativ præcision og lav forekomst af manglende værdier. DIA-tilgangen er en følsom metode, hvor alle ioner vælges til MS/MS-hændelser, modsat hvad der sker i dataafhængig analyse (DDA), hvor kun ioner med den højeste intensitet er fragmenteret. Massespektrometeret, der kører i DIA-tilstand, udfører scanningscyklusser med forskellig isolationsbredde, der dækker hele m/z-prækursorområdet. Denne fremgangsmåde gør det muligt reproducerbart at detektere et stort antal peptider pr. enhedstid, hvilket giver et proteomics øjebliksbillede af prøven17. Desuden har data genereret af DIA en anden interessant egenskab: muligheden for en efterfølgende analyse18. DIA-data er mere komplekse end dem, DDA har opnået, fordi MS/MS-spektre i DIA skyldes, at flere prækursorioner er i samisolation inden for hvert m/z vindue19. Disentangling af de sammensatte MS/MS-spektre i forskellige og specifikke peptidsignaler opnås ved hjælp af to grundlæggende elementer: et spektralbibliotek og en dedikeret software til dataanalyse. Spektralbiblioteket genereres af et dataafhængigt eksperiment, der normalt involverer peptidfraktionering for at maksimere proteomedækningen, som giver en liste over tusindvis af eksperimentelt bestemte prækursorioner og MS/MS-spektre af peptider, der kan påvises i den pågældende prøve. Dataanalysesoftwaren bruger i stedet oplysningerne i spektralbiblioteket til at fortolke DIA-dataene ved at generere specifikke udvundne ionkromatogrammer, som muliggør peptiddetektering og kvantificering. Mens biblioteksfri DIA-dataanalyse nu er mulig, giver biblioteksbaseret DIA stadig bedre resultater med hensyn til proteome-dækning20.
Prøveforberedelsesprotokollen her beskrevet (figur 1) består af følgende trin: et centrifugeringstrin (for at fjerne cellerester), FASP-fordøjelse, StageTip-rensning21, kvantificering af proteiner og DIA-analyse. Denne protokol er designet til analyse af EPS-urin i forbindelse med prostatakræft biomarkør opdagelse, men det kan anvendes til proteomic analyse af enhver urinprøve.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

Den filterstøttede prøveprotokol (FASP) anvendes i vid udstrækning til proteomics prøveforberedelse, fordi den gør det muligt at koncentrere fortyndede prøver, og den er kompatibel med en lang række vaske- og rengøringsmidler. Bottom-up proteomics-arbejdsprocesser som FASP er i stigende grad afhængige af LC-MS/MS-metoder, der udføres i data-uafhængig analysetilstand (DIA), en scanningsmetode, der giver mulighed for dyb proteomdækning og lav forekomst af manglende værdier. 
I denne rapport vil vi give oplysninger om en arbejdsproces, der kombinerer en FASP-protokol, et dobbelt trin til rensning af trin til trin for trin til rensning af trin i stagetip og LC-MS/MS i DIA-tilstand til tilknytning af urinproteome. Som modelprøve analyserede vi udtrykte prostatiske sekreter (EPS)-urin, en prøve indsamlet efter en digital rektal eksamen (DRE), som er af interesse i prostatakræft biomarkør opdagelsesundersøgelser.

Denne protokol for urin proteomic analyse omfatter følgende trin: FASP fordøjelse, estimering af proteinmængde via ekstern standard kalibrering, dobbelt StageTip rensning (SCX og C18), og LC-MS /MS analyse i DIA-tilstand.
Efter protein fordøjelsen, indledende injektioner udføres efter StageTip SCX rensning af de resulterende peptider. LC-MS/MS rå filer behandles for at opnå antallet af identificerede peptider, antallet af identificerede proteiner og området for påviste peptider. Det samlede areal, der opnås ved at opsummere alle identificerede peptider, anvendes til at estimere proteinindholdet via interpolation til en ekstern standard: en HeLa-protein fordøje injiceret i fem forskellige mængder (henholdsvis 2, 5, 15, 50, 150 ng). Proteinmængden for de seks prøver, der blev analyseret i denne undersøgelse, varierede fra prøve til prøve og viste en gennemsnitlig værdi på 78 ng/μL.
Efter proteinestimering renses 2 μg fordøjede proteiner fra hver prøve ved sekventiel SCX- og C18-stadietip før DIA-analyse. Spektralbiblioteket til søgning i DIA-data oprettes efter høj pH-fraktionering i omvendt fase og DDA LC-MS/MS-analyse af en repræsentativ stikprøve (f.eks. en prøvepulje). Ved hjælp af de parametre, der er beskrevet ovenfor, har vi identificeret og kvantificeret kumulativt 2387 proteingrupper i de seks pågældende EPS-urinprøver(supplerende tabel 1 og figur 4).
For at vurdere relevansen af listen over identificerede og kvantificerede proteiner ud fra et kvalitativt synspunkt blev den opnåede matrix sammenlignet med en liste over 624 proteiner, der tidligere var identificeret i direkte EPS22, en prøve indsamlet i en mere invasiv procedure, som har vist sig at være en kilde til interessante kandidat prostatakræftbiomarkører. I alt blev 508 ud af 624 proteiner med succes opdaget af vores FASP / DIA-protokol om EPS-urin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> Figur 1: Proteomic arbejdsproces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> Figur 2: Repræsentation af vores eksperimentelle design til proteinkvantificering baseret på ekstern standard (HeLa digest). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> Figur 3: Nøgletrin i DIA-analysen: i) udarbejdelse af spektralbiblioteket gennem høj pH-bakfasefraktion og DDA-analyse, ii) stikprøveanalyse ved hjælp af DIA-metoden, iii) dataanalyse foretaget af Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> Figur 4: Rangeret område for de påviste EPS-urinproteiner. Et par udvalgte hits er mærket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende tabel 1: Repræsentativ tabel over kvantificerede proteiner i seks EPS-urinprøver i Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">Klik her for at hente denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Her præsenterer vi en optimeret in-filter fordøjelsesprotokol med detaljerede oplysninger om følgende: protein fordøjelse, peptidrensning og data uafhængig erhvervelse analyse. Denne strategi anvendes til analyse af udtrykte prostatiske sekreter-urinprøver og giver mulighed for høj proteom dækning og lav manglende værdi etiket-fri profilering af urin proteome.

Proteomic Profil af EPS-Urin gennem FASP Fordøjelse og data-uafhængig analyse

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

FASP-protokollen er en interessant tilgang til dine urin proteomics på grund af dens kompatibilitet med stærkt denatureringsbuffere og på grund af dens evne til at koncentrere prøven på filteret, hvilket er kritisk for en fortyndet proteinprøver. FASP-protokollen kombineret med data uafhængig analyse massespektrometri giver os mulighed for at opnå dyb proteom dækning i EPS-urin, som er urin indsamlet efter digital rektal eksamen. Vi anvender i øjeblikket den metode, du er ved at se i en biomarkør opdagelse indsats på prostatakræft.Proceduren vil blive vist af Licia Prestagiacomo, Paola Morelli og Caterina Gabriele. Centrifuge EPS-urinprøver inden for to timer efter indsamling i 10 minutter ved 2.100 RCF ved stuetemperatur. Opbevar derefter supernatanterne ved minus 80 grader celsius, indtil de bruges.Smid prøverne på is, eller ved fire grader. For at fremskynde proceduren kan du overføre prøverne fra minus 80 til minus 20 dagen før fordøjelsen. Som lagerløsninger skal du bruge 500 millimolar DTT, 10%SDS, en molar Tris buffer ved pH otte.Fortynd 500 mikroliter af hver EPS-urinprøve med 67 mikroliter SDS, 67 mikroliter DTT og 33 mikroliter Tris buffer. Inkuber ved 95 grader celsius i 10 minutter med blid rysten. Saml centrifugalfilterenheden med en 10.000 Dalton molekylær vægt afskåret.Derefter tilsættes 300 mikroliter fortyndet EPS-urinprøve til filteret. Centrifuge ved 14.000 g i ca. 20 minutter. Du kan midlertidigt afbryde proceduren efter ca. 15 minutter for at kontrollere, om filtreringen forløber problemfrit.Fortsæt, indtil hele opløsningen har passeret gennem filteret. Derefter tilsættes 200 mikroliter urinstofbuffer og centrifuge ved 14.000 g i 15 minutter. Gentag dette trin igen.Når gennemstrømningen er ved at berøre filteret, skal du tømme kollektionen Eppendorf ved at pipette flow-through ud. Proteiner er sikre på filteret. Til cysteinalkylering fremstilles en iodoacetamidopløsning umiddelbart før brug.Der afvejes ca. 10 mg iodoacetamid i et antal Eppendorf-hætteglas, og det opløses i urinstofbuffer i en koncentration på 9,25 mg pr. ml eller i molaritetsmæssig henseende 50 millimolar. Der tilsættes 50 mikroliter iodoacetamidopløsning til hvert filter og centrifuge ved 6.000 g i 25 minutter. Den lavere centrifugeringshastighed gør det muligt for filtrene ikke at løbe tør.Efter proteinalmylering vaskes filtrene med to på hinanden følgende 200 mikroliter aliquots af urinstofbuffer og centrifuge ved 14.000 g i 20 minutter. Kassér gennemstrømningen. Der tilsættes 200 mikroliter på 50 millimolar tre ethylammoniumbicarbonatbuffer og centrifuge ved 14.000 g i 20 minutter.Gentag dette trin. Når den sidste bicarbonatvask er færdig, skal filterenheden overføres til et nyt opsamlingsrør. Derefter tilsættes 60 mikroliter af 50 millimolar TEAB buffer.Der tilsættes en mikroliter trypsinopløsning i en koncentration på 200 nanogram pr. mikroliter trypsin. Alternativt kan du forberede fordøjelsesbufferen til alle prøver i et Eppendorf-hætteglas og distribuere 61 mikroliter af fordøjelsesbufferen til hvert filter. Hvis du bruger en ThermoMixer for at undgå prøvefordampning under inkubation natten over, skal du pakke hver filterenhed med et lag aluminiumsfolie og derefter et lag parafilm.Inkuber prøverne ved 37 grader natten over. Den følgende morgen overføres filtrene til en bænktopcentrifuge for et meget kort spin. Efter spinding skal du åbne Eppendorf-lågene og tilføje 140 mikroliter vand.Centrifuge hætteglassene ved 14.000 g i 25 minutter for at opsamle peptider. Det indsamlede volumen skal være omkring 190 mikroliter. For at fjerne spor af SDS fra fordøjet anbefales stærk kationbytningsrensning af peptider før LC-MS-MS.Forbered mikrokolumneholderne ved at gennembore Eppendorf-lågene med et skarpt værktøj som en pincet eller saks. Holderen vil rumme mikrokolonnen under centrifugering. Da de er kedelige at forberede, kan indehavere bruges flere gange.Ved hjælp af en stump og en nål skal du fjerne en mindeplade på den relevante ekstraktionsskive. Ekstraktionsskiver er bløde polymere materialer, der indeholder sorbentpartikler. I dette tilfælde er sorbent lavet af partikler med stærke kationbytteregenskaber.Indkvarter pladen i en 200 mikroliter pipette spids. Brug et stempel til at skubbe stikket mod enden af spidsen. Den lille skive skal skubbes fast, men undgå overdreven styrke.Sæt spidsen i holderen og saml spinmikrobiinen ved hjælp af et hætteglas med to milliliter Eppendorf, hvorfra det oprindelige låg blev fjernet. Stikket fra en måler 16 nål vil have en lasteevne på omkring fem mikrogram peptider. Konditioner mikrokolonnen med to på hinanden følgende vaske.Den korrekte hastighed afhænger af, hvor stærkt du skubber disken ind i pipettespidsen. Sigt efter at opnå en flowrate i størrelsesordenen 20 til 30 mikroliter i minuttet. Lad være med at få spidsen til at løbe tør under vask og under prøvebelastning.Prøven fortyndes fem gange i vaskeopløsning to, og resultaterne indlæses i opløsningen ved langsommere hastighed. Sigt efter en flowrate på ca. 15 til 20 mikroliter i minuttet. Hvis det er nødvendigt, skal du kassere flow-through.Vask restvaskemidler væk. Lad derefter skiven løbe tør før peptide eluering. Overfør mikroklumnen til et rent 1,5 Eppendorf-rør, og tilsæt straks elueringsrøret.Som vil være syv mikroliter af en 500 millimolar ammoniumacetatopløsning indeholdende 20%acetonitrile. Eluatet fortyndes med 27 mikroliter på 0,1 % myresyre for at sænke procentdelen af organisk opløsningsmiddel og derefter injicere to mikroliter af den resulterende opløsning i LC-MS-MS med påvisning i dataafhængig tilstand. Oplysninger om den LC-MS-opsætning, der bruges i denne protokol, vil blive givet senere i videoen.Når du har udført databasesøgning og peptidfejlintegration, skal du beregne det overordnede topområde. Sammenlign det derefter med en ekstern standardkurve for at estimere peptidkoncentrationen i FASP-digesten. Efter at have estimeret peptidmængden skal du rense en ny aliquot af FASP-fordøje svarende til to mikrogram peptider med to på hinanden følgende StageTip-rensninger som beskrevet her.Den LC-MS-opsætning, der bruges i denne protokol, er baseret på direkte injektion i analysekolonnen. Hvis du bruger et system med en diffuseringskolonne, kan du undgå trinnet i offline C18-rensning. Husk at bruge dedikerede nåle og stempler til hvert kromatografisk materiale.Efter eluting peptider fra C18 Stage Tip med 10 mikroliter eluent, delvist fordampe eluat i et vakuum centrifuge i et par minutter, forsøger at undgå fuld fordampning. Derefter tilsættes 47 mikroliter på 0,1% myresyre og placeres den resulterende opløsning i et HPLC-hætteglas til LC-MS-analyse. Det system, der bruges her, er baseret på direkte belastning af kolonneeksempler uden brug af en diffuseringskolonne.Analytiske kolonner er in-house lavet ved at trække en 75 mikrometer ID kapillær efter fjernelse af et stykke polyamid belægning. Den resulterende spids kan formes forsigtigt med en keramisk fræser. Kapillæren anbringes derefter i en pakkebombe og pakkes med en 50 mg/ml isopropanol gylle af C18 tre mikrometer stationære fasepartikler.Der er behov for et gastryk på mellem 10 og 20 stænger kvælstof eller helium. Du kan bruge alternative eller kommercielle kromatografisøjler, der kører ved submikrobielle kolonner pr. minutstrøm. Saml kolonnen på et T-stykke.De to andre ender er forbundet til højspændingsforsyningen og hplc-sløjfen. Vurder den optimale sprøjtespænding ved at køre systemet ved isokratisk flow. Start derefter din analyse.Adskil peptider over en to timer lang kromatografi gradient som vist. Dataindsamlingen vil bestå af en hurtig fuld MS-tjenestescanning efterfulgt af 26 MS-MS-scanninger på prækursorvinduer med variabel bredde. Starter i 20 m / z bredde, for de første 20 vinduer, som vil dække en m / z interval fra 350 til 750 Thompson.Derefter flyttes til en 50 m / z bredde for de følgende fem vinduer og slutter med en enkelt MS-MS scanning, der har en isolation bredde på 200 Thompson. Snævrere bredder tegner sig for en mere befolket region af spektret med hensyn til tilstedeværelsen af peptidprækursorer. Til DIA-analyse skal du bruge et spektralbibliotek.For at generere et spektralbibliotek kan du udføre nogle få dataafhængige eksperimenter på det samme LC-MS-MS-system, som du har brugt til anskaffelse af data ved hjælp af samme kromatografigradient. Prøvefraktionering vil øge proteomedækningen. Stage Tips kan bruges til prøve fraktionering.Stærk kation udveksling og grundlæggende omvendt fase er to gyldige alternativer. Start med de 10 mikrogram af en pulje af flere FASP fordøjer. Prøven forsures med en endelig koncentration på 0,2 %.Lad peptider på høj kapacitet C18 Stage Tips. Brug flere diske i tilfælde af høje peptidmængder. For 10 mikrogram materiale anbefales to skiver.Udfør C18-rensning som beskrevet tidligere. Forbered flere hætteglas til eluatsamling. Så mange som antallet af brøker.I dette tilfælde produceres 10 fraktioner ved trinvis udtrækning. Efter den sidste vask tilsættes 20 mikroliter af den første eluering. 0,2%ammoniumhydroxid, 10 millimolar TEAB, 4%acetonitrile.Efter fuldt ud at have udtring den første brøkdel i den første Eppendorf, skal du flytte Stage Tip til næste kollektionsglas. Fortyndes i 20 mikroliter trin ved hjælp af som eluent, 0,2% af ammoniumhydroxid, 10 millimolar TEAB, og derefter stigende mængde acetonontril. Når du har fraktioneret eksemplet og kørt dataafhængige eksperimenter på hver brøk, skal du generere spektralbiblioteket ved hjælp af databasesøgning af MS-MS-data.Biblioteket vil derefter blive importeret i en software, der er i stand til DIA dataanalyse for protein kvantificering baseret på mindst én unik peptid tildelt af mindst tre overgange. Forvent at dække en bred vifte af urin proteome. Dette tal viser identifikation og kvantificering af proteiner på tværs af en overflod rækkevidde, der spænder over fem størrelsesordener.Arbejdsgangen her præsenteret kombinerer koncentrationsfordelen og alsidigheden af FASP-protokollen med følsomheden af DIA-scanningstilstand. Denne kombination giver et rigt kort over urin proteome. Da vores analyseopsætning ikke omfatter brugen af en diffuseringskolonne, blev FASP-digesten renset af både stærk kationbytning og omvendte fasetrintips.Trinnet Forvendte fasetip for fase kan udelades, når en diffuseringskolonne er forbundet direkte til analysekolonnen. Brugen af denne arbejdsgang anbefales til analyse af EPS-urinprøver, men dets brug kan udvides til urin proteomics generelt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Udnytte en omfattende Immunoprecipitation berigelse System for at identificere en endogen posttranslationel modifikation profil for Target proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteom og miRNA analyse af Polysomes fra isolerede mus hjertet efter Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteom-analyse af menneskers makrofag polarisering Under en lav ilt miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Udvinding og analyse af taiwanske grønne Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...