Name: proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00
Duration: 14 min 48 s
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この研究は、MIUR(リセルカ大学大臣、PRIN 2017からMG)とPORカラブリアFESR 2014-2020、アクション1.2.2、「INNOPROST」によって支援されました。

この研究は、マグナ・グレシア大学カタンツァーロ大学の制度倫理委員会(RP 41/2018)によって承認されました。書面によるインフォームド・コンセントは、研究に登録されたすべての患者から得られた。
1. サンプル準備
<ol><li>遠心分離機EPS尿サンプルは、2,100 x g で2時間の回収で、室温(RT)で10分間採取した。上清は使用するまで-80°Cで保管してください。</li>
</ol>2. サンプルの解凍
<ol><li>サンプルを-80°Cから-20°Cに、消化の前日に移します。</li>
	<li>サンプル処理の前に、サンプルを4°Cで15~20分間、RTで転送します。</li>
</ol>3. FASP用試薬の準備
<ol><li>同日、尿素バッファー、50 mM ヨードロセトアセトアミド(IAA)、50 mMトリエチルランモニウム重炭酸塩、500 mMジチオスライトール(DTT)の溶液を準備します。</li>
	<li>尿素バッファー(尿素8 M、100 mM Tris-HCl pH 8):10mLの場合、尿素の4,800mgの重量を量り、1 MトリスpH8の1mLを添加した後、適切な量のHPLC水に溶解します。各サンプルに800 μLの尿素が必要です。</li>
	<li>500 mM ジチオトレイトール (DTT): 38.5 mg の DTT を 500 μL の HPLC 水に溶解します。各サンプルに対して、66.7 μL の DTT が必要です。</li>
	<li>尿素バッファーに50 mM IAAを調製:尿素バッファーの1 mLにIAAの9.25 mgを溶解します。各サンプルに対して、IAAの50 μLが必要です。</li>
	<li>50 mM トリエチルランモニウム重炭酸 (TEAB) を準備します。1 M TEABの150 μLを2.85 mLのHPLC水に加えます。各サンプルに460 μLのTEABが必要です。</li>
	<li>HPLC水中のトリプシン(100 ng/μL)の溶液を調製します。この溶液は-80°Cで保存し、使用前にすぐに解凍することができます。各サンプルに対して、2 μL (200 ng) が必要です。</li>
</ol>4. FASPによるタンパク質消化
<ol><li>各EPS尿サンプルの500μLを10%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、66.7 μLの500mM DTT、33.3 μLの1 M Tris pH 8で希釈してタンパク質を溶解し、ジスルフィド結合を減少させます。95°Cで10分間、穏やかな揺れをしてインキュベートします。</li>
	<li>フィルターユニット(10 kDa)に300μLの希釈EPS尿サンプルを加え、遠心分離機を14,000 x g で20分間加えます。</li>
	<li>200 μL の尿素バッファーをフィルターに加え、遠心分離機を 14,000 x g で 15 分間追加します。この手順を繰り返し、フロースルーを破棄します。</li>
	<li>IAA溶液50μL、6,000 x g で25分間遠心分離機を加えます。</li>
	<li>20分間、尿素バッファーと遠心分離機を14,000 x g で200 μL加えます。この手順を繰り返し、フロースルーを破棄します。</li>
	<li>50 mM のトリエチルランモニウムのバッファー (TEAB) と遠心分離機を 14,000 x g で 20 分間加えます。この手順を繰り返します。</li>
	<li>フィルターユニットを新しいコレクションチューブに移します。</li>
	<li>50 mM TEAB バッファーの 60 μL と 200 ng のトリプシンを加え、一晩で 37 °C のサーモミキサーでサンプルをインキュベートします。 注:一晩のインキュベーション中にサンプルの蒸発を避けるために、各フィルタユニットをアルミニウム箔の層でラップし、次にパラフィルムの層をラップします。</li>
	<li>トリプシンインキュベーションの後、140 μLの水と遠心分離機を14,000 x gで25分間加えて、消化量(180~200 μL)を収集します。</li>
</ol>5. SCX精製のための試薬の準備
<ol><li>1 mL の洗浄 1 (0.5% ギ酸 (FA) および 20% アセトニトリル (ACN)) を次のように準備します: 10% FA の 50 μL と 100% ACN の 200 μL を HLPC 水の 750 μL に加えます。各サンプルに対して、100 μLの洗浄 1 が必要です。</li>
	<li>1.5 mLの洗浄2(0.5%FAおよびACNの80%)を、10%FAの75 μL、100%ACNの1.2 mLを加えて225μLのHPLC水を225μLにします。各サンプル190 μLの洗浄2が必要です。</li>
	<li>溶出液(500 mM酢酸アンモニウム(AA)とACNの20%)100μLを調製:2MAAの25μLと100%のACNの20μLを加えて55μLのHPLC水に加えます。</li>
	<li>次のようにステージヒントを準備します。<ol>
<li>鈍い終わりのスポイト針(ゲージ16)を使用して、SCX樹脂の層と200 μLピペットチップをパックします。マイクロコラムを収容するために、以前にピアスされたマイクロ遠心蓋に StageTip を挿入します。</li>
		<li>元の蓋を取り外した2 mLマイクロ遠心分離機に蓋を組み立てます。組み立てたばかりのマイクロSPE遠心装置は、ベンチトップ遠心分離機に収まる必要があります。穿穿蓋は準備に面倒なので、複数回利用することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. SCX精製
<ol><li>洗浄2を使用して、各サンプルの30 μLを120 μLに希釈します。</li>
	<li>抽出樹脂の上に50μLの洗浄1を加え、遠心分離機を400xgで2分間加えて、ステージチップを調整します。流れ抵抗は抽出樹脂がピペットチップにどれだけ強く詰め込まれたかによって決まるので、20-30 μL/minの流量を得るために遠心速度を調節する必要がある。サンプルのロードと洗浄中にチップを乾燥させないようにしてください。</li>
	<li>50 μLの洗浄 2 と遠心分離機を 400 x g で 2 分間平衡させます。</li>
	<li>低いスピン速度を使用して、希釈したサンプル(120 μL)をロードします。</li>
	<li>50 μLの洗浄2と遠心分離機を400 x g で2分間洗浄します。50 μLの洗浄 1 を繰り返します。 注:この洗浄後、樹脂は完全に乾燥している必要があります。</li>
	<li>7 μLの溶出溶液(500 mM酢酸アンモニウム(AA)およびACNの20%)を用いたエルルートペプチド混合物は、低速スピン速度を使用してゆっくりと使用した。</li>
	<li>0.1%FAの27 μLを加え、AAを希釈し、LC-MS/MS予備注入用のサンプルを得ます。最終的に34 μLに希釈すると、尿とペプチド溶液の間に1:1の体積比が生じてしまいます(精製された消化物の1 μLは、元の尿サンプルの1 μLに相当します)。</li>
</ol>7. DDA分析を用いた外部標準によるタンパク質定量 (図 2)
<ol><li>得られたペプチドダイジェストの2 μLをLC-MS/MSに注入し、結果として得られた総ペプチド領域を次のように構築した検量線で補間することによって、サンプル中のタンパク質量を決定します。</li>
	<li>HeLaダイジェストストック(100 μg/μL)を使用して、5種類のHeLaダイジェストソリューション(1 ng/μL、2.5 ng/μL、7.5 ng/μL、25 ng/μL、75 ng/μL)を用意します。</li>
	<li>各Hela溶液を重複(2μL)で注入します。</li>
	<li>LC-MS/MS メソッドを設定します。<ol>
<li>5つのHeLaペプチド混合物のうち2μLを注入し、3μm C18シリカ粒子を詰めた15cm、75μm i.dカラムで230 nL/分の流量で75分間の線形勾配を通して別々のペプチドを注入します。移動相A(FA0.1%、ACN2%)と移動相B(0.1%FAおよびACNの80%)によって構成されるバイナリ勾配を使用する。</li>
		<li>移動相B含有量を60分で6%から42%、さらに8分間で42%から100%に増加させることで、勾配溶出を行います。5分間100%Bを維持し、2分で0%Bに戻します。</li>
		<li>トップ12方式を使用してDDAモードで動作し、MSフルスキャン範囲を350-1800 m/z、解像度70,000、ACGターゲット1e6、最大射出時間50msに設定します。前駆体イオン分離のマスウィンドウを1.6 m/z、解像度35,000、ACGターゲット1e5、最大射出時間120ms、HCDフラグメンテーション25 NCE(正規化衝突エネルギー)、動的排除15秒に設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>検索エンジンとしてセクエストを使用して生のファイルを分析し、データベースとして、HUMANユニプロト完全タンパク質配列を使用します。ここで紹介した実験では、データベースは2016年3月にダウンロードされ、42.013のシーケンスが含まれていました。<ol>
<li>以下の設定を使用してください:MS耐性15ppm、MS / MS耐性0.02 Da、2つの切断部位を設定することにより、酵素としてトリプシン。リジン、セリン、スレオニン、チロシン(+57.021)のカルバミドメチル化、メチオニンの酸化を動的修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化(+57.021)を静的修飾として設定します。ペプチドおよびタンパク質同定に対する偽発見率(FDR)のカットオフを0.01に使用し、パーコレータでフィルタリングします。</li>
		<li>すべてのMS1ペプチド信号のピーク面積を計算します。ペプチドの総面積を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HELaサンプルに使用したのと同じLC-MS/MS法を用いて、EPS-尿サンプルから得られた2μLのペプチド混合物を注入し、HeLaデータ処理に使用したのと同じパラメータを使用して生ファイルを分析します。</li>
	<li>同定されたすべてのペプチドの面積値を合計してペプチドシグナルの総強度を計算し、外部標準曲線を補間します。これにより、EPS-尿タンパク質消化に存在するペプチド量の許容可能な推定値が得られます。</li>
</ol>8. C18ステージチッププロトコル用試薬の準備
<ol><li>500 μLの溶液A(0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)、50%ACN)を調製:100%ACNの250 μLと5%TFAの10 μLを加えて240 μLのHPLC水を240 μLにします。</li>
	<li>2 mLの溶液B(0.1%TFA)を準備する:5%TFAの40 μLを1960 μLのHPLC水に加えます。</li>
	<li>溶出液(0.1%FA、50%ACN)の100 μLを調製:10%FAの1μLおよび100%ACNの50 μLを加えて49 μLのHPLC水を49 μLに加えます。</li>
	<li>前に説明したようにステージヒントを準備します。この場合、C18 抽出ディスクが使用されます。</li>
</ol>9. SCX/C18 ステージチッププロトコル
注:塩を除去するためにC18ステージチッププロトコルによってEPS尿消化を浄化します。
<ol><li>2 μgのペプチドから始める(予備注入で定量化される)。洗浄2 SCXで4倍の消化液を希釈し、上述の通り進行する(「SCX精製」セクションで)。7 μLの溶出溶液(500 mM酢酸アンモニウム(AA)およびACNの20%)でペプチド混合物をゆっくりと低いスピン速度(5 μL/min流量)で溶出させます。</li>
	<li>3%未満のpHと5%未満の有機溶媒濃度を達成するために、トリフルオロ酢酸(TFA)の0.1%の150 μLでSCX溶離液を酸性化します。</li>
	<li>C18ステージチップに50 μLの溶液Aと遠心分離機を400 x g で2分間条件を付けます。C18ステージチップを50 μLの溶液Bと遠心分離機を400 x g で2分間平衡化します。</li>
	<li>低いスピン速度を使用して、サンプルをゆっくりとステージチップにロードします。</li>
	<li>50 μLの溶液Bと遠心分離機でC18ステージチップを洗浄します。</li>
	<li>より低いスピン速度を使用して、10 μLの溶出液でペプチド混合物をゆっくりと溶出させます。</li>
	<li>30°Cで30°Cで溶出物(10μL)を真空遠心分離機で3分間乾燥させます。0.1%FAの47 μLを加え、期待されるペプチド濃度は40 ng / μLになります。</li>
</ol>10. DIA分析 (図 3)
<ol><li>nanoLC分離:3μm C18シリカ粒子を詰めた15cm、75 μm IDカラム上の流速230 nL/minで140分間の線形勾配を使用してペプチド混合物を分離します。<ol>
<li>230 nL/分流量で勾配溶出を行い、90分で移動相B含有量を3%から25%に、30分で25%から40%、最後に8分で40%から100%に上昇させます。</li>
		<li>100%Bで10分後、15分間、移動相Aでカラムを平衡化する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>質量分析パラメータ: 以下のスキャンサイクルを採用した方法を用いてDIA分析を実行する:(i)17,500の解像度で完全スキャンMSイベント(AGC目標1e6、 最大射出時間 50 ms)に続いて、(ii) 20 m/z分離幅で 20 ウィンドウ、(ii) 50 m/z分離幅で 5 ウィンドウ、200 m/z 分離幅で 1 ウィンドウ、1200 m/zで DIA のスキャン範囲を終了する。 DIA スキャンは、解像度 35,000 (AGC ターゲット 5e5、最大射出時間 120 ms および 25 NCE) で実行します。</li>
</ol>11. ライブラリ生成のための高-pH逆転相C18分画
注:次の手順でDIA分析のためのデータ依存ライブラリを構築するために、10 μgより高い量のEPS-尿代表サンプルをプールします。
<ol><li>ペプチド混合物(11 μg)をTFAの0.2%で酸性化し、得られた溶液を2層の抽出ディスクを詰めたC18 StageTipにロードして、より高い容量を可能にします。1つのマイクロディスクの積載容量(16ゲージの注射針から)は5-10 μgの範囲であると推定しました。</li>
	<li>条件及びC18精製のために既に記載されているように定常相を平衡化する。</li>
	<li>水酸化アンモニウムの0.2%、10mM TEAB、およびACNのv/v濃度を増加させる(4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%、32%、40%、32%、40%、32%、40%、80%を含む溶出液を使用して、高pH逆転相C18から段階的に溶出(n=10)によるペプチド分画(n=10)を行う。</li>
	<li>DIA法と同じクロマトグラフィーパラメータを使用して10分の1を分析します。予備分析に以前採用した設定を使用して、DDAモードで質量分析計を操作します(「DDA分析を用いた外部標準によるタンパク質定量」を参照)。</li>
</ol>12. データ分析
<ol><li>DIA分析専用ソフトウェアで高逆転相C18分画のDDA LC-MS/MS実験から得られたタンパク質同定結果をインポートして、スペクトルライブラリを生成します。</li>
	<li>識別と定量に使用するフラグメントイオンの最小数と最大数をそれぞれ3と6に設定します。取得した結果を Q 値 0.01 でフィルター処理します。</li>
	<li>DIA RAW ファイルをインポートし、各 raw ファイルに、スペクトル ライブラリの作成に使用したのと同じ FASTA ファイルを関連付けます。</li>
	<li>タンパク質定量に使用する固有のペプチドの最小数と最大数をそれぞれ 1 と 10 に設定します。</li>
	<li>フラグメントイオンピーク領域を合計して、各タンパク質の強度を計算します。</li>
	<li>各サンプルの定量化されたタンパク質の強度を持つマトリックスを生成します。</li>
</ol>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+A+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).</li><li>Liu, Y., H&#252;ttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+protein+maps+for+biomarker+discovery+and+clinical+research.">Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).</li><li>Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+LC-MS/MS+analysis:+Implication+for+proteomics+experiments.">Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments.</a> Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).</li><li>Muntel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Urinary+Protein+Biomarker+Discovery+by+Data-Independent+Acquisition+on+a+Quadrupole-Orbitrap+Mass+Spectrometer.">Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Differentially+Expressed+Proteins+in+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions+of+Men+with+Organ-confined+Versus+Extracapsular+Prostate+Cancer.">Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).</li><li>Decramer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+in+clinical+proteomics.">Urine in clinical proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).</li><li>Thongboonkerd, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+points+in+urinary+proteomics.">Practical points in urinary proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).</li><li>Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics.">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions.">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li></ol>

すべての著者は利益相反を宣言しません。

本研究では、EPS-尿サンプルを分析する戦略を提示する。FASPプロトコルは酵素消化の前にサンプル濃度を可能にするので尿プロテオミクスのための理想的な選択である。実際、このワークフローを使用すると、数百マイクロリットルの尿を単一のフィルターにロードして処理することができます。さらに、オンフィルター消化は変性条件の選択において相対的な自由を提供する。我々の研究では、トリス、SDSおよびDTTを含む緩衝液内の尿サンプルを希釈することによってタンパク質変性を達成する(最終濃度:50 mMトリス、1%SDS、50 mM DTT)。タンパク質は、サンプルを解凍した直後に効率よく変性し、活性プロテアーゼによる不要な分解を避けるためである。元のFASPプロトコルは、100 μLから200 μLに、ワッシュの量を増やすことで改善されました。このようにして、残留物、特にフィルターからの洗剤のより良い除去が達成される。
酵素消化後、高速LC-MS/MSを用いた外部標準によるタンパク質推定は、全サンプル(2μg)の等しい出発物質(2μg)で、DIAモードでの二重ステージチップ精製およびLC-MS/MS分析を含むプロトコルの最後のステップの前に、データ依存的な方法を実行する。
FASPの多様性はDIAアプローチに関連しており、欠損値17の数が少ないデリケートな方法である。我々の研究では、2387個のタンパク質を同定して定量化し、EPS尿の詳細なプロテオミクスプロファイルを描くことを可能にした。2387タンパク質の同定と定量は、ペプチドの高pH逆分画 を介して 得られた豊富なスペクトルライブラリの生成と、当社のDIA法によって、広い m/ z 前駆体範囲で指向することによって可能であった。このワークフローは、直接EPS分析で以前に見つかったタンパク質の80%以上を同定し、EPS尿プロテオームのかなりの部分が実際に発現した前立腺分泌物に由来し、したがって前立腺組織特異的タンパク質26の豊富な供給源であることを実証する。
結論として、当社の実験設計は、尿プロテオームの豊富な地図を得るために、DIAの感度とFASPの汎用性を組み合わします。この戦略はEPS-尿サンプルの分析に推奨されるが、その使用は一般的に尿プロテオミクス、あるいは他のサンプルタイプに拡張することができる。

プロテオミクス技術の絶え間ない進化は、組織や生体液などの多種多様なサンプルに存在する主要な分子エフェクターの高解像度マップを提供することにより、疾患診断と治療への応答予測を支援する上でかなりの影響を与えることを約束します。分析的な観点から、尿は、他の生物流体1に対するプロテオームの採取の容易さおよび主要な安定性などのいくつかの利点を提供する。尿のプロテオミクス分析は、泌尿器科癌に関するバイオマーカー発見研究において特に興味深い、目的の組織に近接した非侵襲的なサンプリングを可能にするので2。特に、前立腺関連病理の研究に有望と思われるサンプルは、EPS-尿3,4(すなわち、デジタル直腸検査(DRE)後に採取された尿サンプル)である。サンプル採取前のこの後者の操作は、前立腺特異的タンパク質で尿を豊かにする。EPS-尿は、前立腺癌(PCa)を含む前立腺5に関連する障害を調査する良い候補であり、DREを介して、腫瘍によって分泌されるタンパク質を尿サンプルに注ぎ込むことができるので、癌組織特異的なタンパク質を検出する可能性が高まる。
潜在的なタンパク質バイオマーカーの検出と定量化を可能にする上で重要な役割は、質量分析(MS)によって果たされます。過去20年間にわたり、プロテオミクス分析用のMSベースのプロトコルは、MS計測およびデータ解析ソフトウェア6の継続的な改善のおかげで、単一のLC-MS/MSランで検出されるタンパク質の数を増やしてきました。
MSベースのプロテオームサンプル調製物は、一般に、タンパク質混合物の酵素消化を伴い、これは、例えば、インソリューション消化、MSternブロッティング7、懸濁液トラップ(Sトラップ)8、固相強化サンプル調製(SP3)9、ステージチップ内消化10およびフィルター助成(FASP)11のような多種多様なプロトコルを介して達成することができる。すべてのプロトコルは、尿プロテオミクスに使用することができ、たとえ結果が同定されたタンパク質およびペプチドの数に関して、そして再現性12の点で変化するかもしれない。
この研究では、FASPプロトコルによるEPS尿の分析に焦点を当てた。FASPプロトコルは、もともと組織や細胞培養から抽出されたタンパク質を分析するために設計されたが、その使用は、尿13などの他のサンプルタイプの分析に拡大された。単純なインソリューション内消化に関してFASPはより柔軟なプロテオームアプローチ14であり、酵素消化前のタンパク質混合物から洗浄剤および塩などの他の汚染物質を効果的に除去することを達成することにより、最適なタンパク質可溶化条件の選択を可能にする。また、FASPの追加の特徴は、試料濃度の手段を提供するということである。これは、比較的大きなサンプル量(数百マイクロリットル)から開始することができるので、尿プロテオーム分析のために特に興味深いものです。FASPプロトコルの可能性を考慮して、いくつかの研究は、実験変動を低減し、並列16でサンプルの高い数を処理することを目的として、ワークフロー自動化に注目している。
このワークフローでは、FASPの後に、高いプロテオームカバレッジ、良好な定量精度、欠損値の発生率が低いデータ非依存分析(DIA)でLC-MS/MSの取得が続いています。DIA アプローチは、MS/MS イベントに対してすべてのイオンを選択する方法で、データ依存分析 (DDA) で発生する場合に、最も強度の高いイオンのみが断片化される場合とは異なります。質量分析計は、DIAモードで動作し、 全体のm / z 前駆体範囲をカバーする異なる分離幅でスキャンサイクルを実行します。このアプローチは、1単位時間当たりの多数のペプチドを再現的に検出することを可能にし、サンプル17のプロテオミクススナップショットを提供する。さらに、DIAによって生成されたデータは、もう一つの興味深い特徴 を 有する:後処理分析18の可能性。DIA の MS/MS スペクトルは、各 m/z ウィンドウ19内のいくつかの前駆体イオンの共分離に起因するため、DIA データは DDA で得られるものよりも複雑です。複合MS/MSスペクトルを別個の特異的なペプチド信号に分けるのは、スペクトルライブラリとデータ分析専用ソフトウェアの2つの基本要素を使用することによって達成されます。スペクトルライブラリはデータ依存的な実験によって生成され、通常はプロテオームのカバレッジを最大化するためにペプチド分画を含み、検討中のサンプルで検出可能な何千もの実験的に決定された前駆体イオンおよびMS/MSスペクトルのリストを提供する。データ解析ソフトウェアは、代わりにスペクトルライブラリに含まれる情報を使用して、ペプチドの検出と定量を可能にする特定の抽出イオンクロマトグラムを生成することによってDIAデータを解釈します。ライブラリフリーのDIAデータ分析は実現可能になりましたが、ライブラリベースのDIAはプロテオームカバレッジ20の面でより良い結果を提供します。
ここで説明するサンプル調製プロトコル(図1)は、遠心分離工程(細胞デブリを除去する)、FASP消化、ステージチップ精製21、タンパク質の定量化およびDIA分析のステップから構成される。このプロトコルは、前立腺癌バイオマーカー発見の文脈でEPS尿の分析のために設計されていますが、任意の尿サンプルのプロテオミクス分析に適用することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

フィルター支援サンプルプロトコル(FASP)は、希釈されたサンプルを濃縮し、多種多様な洗剤と互換性があるため、プロテオミクスサンプル調製に広く使用されています。FASPのようなボトムアッププロテオミクスワークフローは、深いプロテオームカバレッジと欠損値の発生率の低さを可能にするスキャン方法であるデータ非依存分析(DIA)モードで実行されるLC-MS/MS法にますます依存しています。 
本レポートでは、尿プロテオームマッピング用のFASPプロトコル、二重ステージチップ精製ステップ、およびDIAモードのLC-MS/MSを組み合わせたワークフローの詳細を提供します。モデルサンプルとして、前立腺癌バイオマーカー発見研究に関心のあるデジタル直腸検査(DRE)後に採取したサンプルである前立腺分泌(EPS)-尿を分析した。

尿プロテオーム分析のためのこのプロトコルには、FASP消化、外部標準キャリブレーションによるタンパク質量の推定、二重段階先端精製(SCXおよびC18)、およびDIAモードでのLC-MS/MS分析のステップが含まれます。
タンパク質消化後、得られたペプチドのステージチップSCX精製後に予備注射が行われる。LC-MS/MS生ファイルは、同定されたペプチドの数、同定されたタンパク質の数および検出されたペプチドの面積を得るために処理される。同定されたすべてのペプチドを合計して得られた全領域は、外部標準への補間を介してタンパク質含有量を推定するために使用される:5つの異なる量(それぞれ2、5、5、50、150 ng)で注入されたHeLaタンパク質ダイジェスト。この研究で分析した6つのサンプルのタンパク質量は、サンプルごとに変化し、平均値は78 ng/μLでした。
タンパク質推定後、DIA分析の前に、各サンプルから2μgの消化されたタンパク質をシーケンシャルSCXとC18ステージチップで精製します。DIA データを検索するためのスペクトルライブラリは、代表的なサンプル(例えば、サンプルプール)の高pH逆相分画とDDA LC-MS/MS分析の後に作成されます。上記のパラメータを用いて、検討中の6個のEPS-尿サンプル中の2387個のタンパク質基を累積して同定し、定量した(補足表1および図4)。
同定および定量化されたタンパク質のリストの関連性を定性的観点から評価するために、得られたマトリックスを、より侵襲的な処置で採取したサンプルであるdirect-EPS22で以前に同定された624個のタンパク質のリストと比較し、興味深い候補前立腺癌バイオマーカーの供給源であることが証明された。合計で、624個のタンパク質のうち508個が、EPS尿に関するFASP/DIAプロトコルによって正常に検出されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> 図1:プロテオミクスワークフロー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> 図2:外部標準(HeLa digest)に基づくタンパク質定量の実験計画の表現を、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> 図3:DIA分析の主要なステップ:(i) 高pH逆転相分画とDDA分析によるスペクトルライブラリの詳細化、(ii)SPECtronautによるDIAアプローチを用いたサンプル分析、(iii)データ分析 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> 図4: 検出されたEPS尿タンパク質のランク付けプロット選択されたいくつかのヒットには、ラベルが付けらされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:スペクトロノーにおける6個のEPS-尿サンプルにおける定量タンパク質の代表表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

ここでは、タンパク質消化、ペプチド精製、データ独立獲得分析に関する詳細情報を含む最適化されたオンフィルター消化プロトコルを提示します。この戦略は、発現した前立腺分泌尿サンプルの分析に適用され、高いプロテオームカバレッジと尿プロテオームの低欠損値ラベルフリープロファイリングを可能にします。

FASP消化とデータ非依存分析によるEPS-尿のプロテオミクスプロファイル

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

FASPプロトコルは、強く変性バッファーとの相溶性と、希釈されたタンパク質サンプルに不可欠なフィルターにサンプルを集中させる能力のために、尿プロテオミクスにとって興味深いアプローチです。FASPプロトコルとデータ独立分析質量分析法を組み合わせることで、デジタル直腸検査後に採取された尿であるEPS-尿中の深いプロテオームカバレッジを達成することができます。私たちは現在、前立腺癌に関するバイオマーカー発見の取り組みで見ようとしている方法を適用しています。手順は、リシア・プレスタジアコモ、パオラ・モレリ、カテリーナ・ガブリエレによって示されます。遠心分離機EPS尿サンプルは、2、100 RCFで室温で10分間採取後2時間以内に行った。その後、使用するまでマイナス80度で上清を保存します。サンプルを氷の上に、または4度で投げます。手順を加速するには、消化の前日にマイナス80からマイナス20にサンプルを転送することができます。ストックソリューションとして、500ミリモルDTT、10%SDS、pH 8で1モルトリスバッファが必要です。SDSの67マイクロリットル、DTTの67マイクロリットルおよび33マイクロリットルのTrisの緩衝液の各EPS尿サンプルの500マイクロリットルを薄くする。摂氏95度で10分間、穏やかな揺れでインキュベートします。遠心フィルターユニットを10,000ダルトンの分子量を遮断して組み立てます。次に、300マイクロリットルの希釈EPS尿サンプルをフィルターに加えます。遠心分離機は約20分間14,000gで行う。ろ過がスムーズに進行しているかどうかを確認するため、15分ほど経過後に一時的に中断することができます。ソリューション全体がフィルターを通過するまで続行します。その後、14,000 gで200マイクロリットルの尿素バッファーと遠心分離機を15分間加えます。この手順をもう一度繰り返します。フロースルーがフィルターに触れる間、フロースルーをピペッティングしてコレクションのエッペンドルフを空にします。タンパク質はフィルター上で安全です。システインアルキル化の場合は、使用直前にヨウドアセトアミド溶液を調製する。数エペンドルフバイアルで約10ミリグラムのヨウドアセトアミドの重量を量り、1mlあたり9.25ミリグラムの濃度、またはモルモル換算で尿素緩衝液に溶解する50ミリモル。各フィルターに50マイクロリットルのヨウアドアセトアミド溶液を加え、6,000 gで遠心分離機を25分間加えます。遠心速度が低いほど、フィルターが乾燥して実行されません。タンパク質アルキル化後、尿素バッファーと遠心分離機の2つの連続した200マイクロリットルのアリコートを14,000 gで20分間洗浄します。フロースルーを破棄します。20ミリモル3エチルアンモニウム重炭酸塩バッファーと遠心分離機の200マイクロリットルを14,000 gで20分間加えます。この手順を繰り返します。最後の炭酸水素塩洗浄を完了した後、フィルターユニットを新しい回収チューブに移します。次いで、50ミリモルTEABバッファーの60マイクロリットルを加えます。トリプシン1マイクロリットル当たり200ナノグラムの濃度でトリプシン溶液を1マイクロリットル加えます。あるいは、エペンドルフ・バイアル内のすべてのサンプルの消化バッファーを準備し、各フィルターに61マイクロリットルの消化バッファーを分配することができます。一晩のインキュベーション中にサンプルの蒸発を避けるために ThermoMixer を使用している場合は、各フィルターユニットをアルミニウム箔の層でラップし、次にパラフィルムの層でラップします。一晩で37度でサンプルをインキュベートします。翌朝、非常に短いスピンのためにベンチトップ遠心分離機にフィルタを転送します。回転した後、エペンドルフの蓋を開け、140マイクロリットルの水を加えます。ペプチドを収集するために、バイアルを14,000gで25分間遠心分離する。収集された体積は約190マイクロリットルでなければなりません。SDSの微量を消化から取り除くためには、LC-MS-MSより前のペプチドの強いカチオン交換精製が推奨される。ピンセットやハサミのような鋭利なツールでエペンドルフの蓋を突き刺してマイクロコラムホルダーを準備します。ホールダーは遠心分離の間マイクロコラムを収容する。準備が面倒なので、ホルダーは複数回利用できます。鈍い針とを使用して、適切な抽出ディスクのプラークを取り除く。抽出ディスクは、吸着粒子を含む軟質高分子材料である。この場合、吸着剤はカチオン交換性の強い粒子からなされる。プラークを200マイクロリットルのピペットチップに収容します。ピストンを使用して、先端の端に向かってプラグを押します。小さなディスクはしっかりと押す必要がありますが、過度の強度を避けてください。チップをホルダーに挿入し、元の蓋を取り外した2ミリリットルのエペンドルフ・バイアルを使用してスピンマイクロカラムを組み立てます。ゲージ16針からのプラグは、約5マイクログラムのペプチドの積載能力を有する。マイクロコラムに2回連続するステーブルを入ります。適切な速度は、ディスクをピペットチップにどれだけ強く押し込むかによって異なります。毎分20~30マイクロリットルの流量を達成することを目指します。洗浄時やサンプルのロード中にチップを乾燥させないようにしてください。洗浄液2でサンプルを5倍に希釈し、その結果を溶液に遅い速度でロードします。毎分約15〜20マイクロリットルの流量を目指します。必要に応じて、フロースルーを破棄します。残留洗剤を洗い流す。次いで、ペプチド溶出前にディスクを乾燥させておく。マイクロカラムをきれいな1.5エペンドルフチューブに移し、すぐに溶出管を加えます。これは、20%アセトニトリルを含む500ミリモル酢酸アンモニウム溶液の7マイクロリットルになります。有機溶媒の割合を下げるために0.1%のギク酸の27マイクロリットルで溶出液を希釈し、その後得られた溶液の2マイクロリットルをLC-MS-MSに注入し、データ依存モードで検出します。このプロトコルで使用される LC-MS セットアップの詳細については、ビデオの後半で説明します。データベース検索とペプチド誤差の統合を行った後、全体のピーク面積を計算します。次に、それを外部標準曲線と比較して、FASP消化中のペプチド濃度を推定する。ペプチド量を推定した後、ここで説明するように2つの連続したステージチップ精製によって2マイクログラムのペプチドに対応するFASP消化の新しいアリコートを精製する。このプロトコルで使用される LC-MS セットアップは、分析列への直接注入に基づいています。トラッピング列を持つシステムを使用している場合は、オフライン C18 精製のステップを避けることができます。各クロマトグラフィー材料に専用の針とピストンを使用することを忘れないでください。10マイクロリットルの溶離したC18ステージ先端からペプチドを溶出させた後、真空遠心分離機中の溶出物を数分間蒸発させて、完全な蒸発を避けようと試みる。その後、0.1%のギ酸を47マイクロリットル加え、得られた溶液をLc-MS分析用のHPLCバイアルに入れる。ここで使用されるシステムは、トラッピング列を使用せずに列サンプルのロードに基づいています。分析カラムは、ポリアミドコーティングを除去した後、75マイクロメートルIDキャピラリーを引っ張って社内で作られています。得られた先端はセラミックカッターで優しく形作られてもよい。キャピラリーは、その後、パッキング爆弾に入れられ、C18 3マイクロメートル静止相粒子のmlイソプロパノールスラリーあたり50ミリグラムで梱包されます。窒素またはヘリウムの10から20の棒の間のガス圧力が必要である。マイクロリットル/分の流量で動作する代替または市販のクロマトグラフィーカラムを使用できます。Tピースにコラムを組み立てます。他の2つの端は高圧電源およびHPLCループに接続される。アイソクラティックフローでシステムを実行して、最適なスプレー電圧を評価します。次に、分析を開始します。表示されるように2時間の長いクロマトグラフィー勾配にわたってペプチドを分離します。データ取得は、迅速な完全な MS サービス スキャンの後に可変幅の前駆体ウィンドウで 26 MS-MS スキャンで構成されます。20 m/z 幅から始まり、350 ~ 750 トンプソンの m/z 範囲をカバーする最初の 20 のウィンドウ。次の 5 つのウィンドウの 50 m/z 幅に移動し、1 つの MS-MS スキャンで終わり、分離幅は 200 Thompson です。狭い幅は、ペプチド前駆体の存在の面でスペクトルのより人口の多い領域を占める。DIA 解析にはスペクトルライブラリが必要です。スペクトルライブラリを生成するために、同じクロマトグラフィー勾配を使用してDIAの取得に使用していたのと同じLC-MS-MSシステム上でいくつかのデータ依存実験を行うことができます。サンプル分画はプロテオームの被覆率を増加させます。ステージのヒントは、サンプルの分数に使用できます。強いカチネーション交換と基本的な逆相は、2つの有効な選択肢です。いくつかのFASPダイジェストのプールの10マイクログラムから始めます。0.2%TFA最終濃度を使用してサンプルを酸性化します。高容量C18ステージのヒントにペプチドをロードします。ペプチド量が多い場合は複数のディスクを使用してください。10マイクログラムの材料の場合は、2枚のディスクが推奨されます。先に説明したようにC18精製を行う。溶出コレクションのためにいくつかのバイアルを準備します。分数の数と同じ数。この場合、10分の一部が段階的な溶出によって生成される。最後の洗浄後、最初の溶出物を20マイクロリットル加えます。0.2%水酸化アンモニウム、10ミリモルTEAB、4%アセトニトリル。最初のエッペンドルフの最初の分数を完全に溶け出した後、ステージの先端を次のコレクションバイアルに移動します。溶出液として用いた20マイクロリットルのステップで希釈し、水酸化アンモニウムの0.2%、10ミリモルTEAB、そしてアセトニトリルの量を増加させる。サンプルを分数し、各分数に関するデータ依存実験を実行した後、MS-MSデータのデータベース検索によってスペクトルライブラリを生成します。その後、少なくとも3つの遷移によって割り当てられた1つのユニークなペプチドの最小値に基づいて、タンパク質定量のためのDIAデータ分析が可能なソフトウェアにライブラリがインポートされます。尿プロテオームの広い範囲をカバーすることを期待しています。この図は、5桁に及ぶ豊富な範囲にわたるタンパク質の同定と定量を示しています。ここで提示されたワークフローは、濃度の優位性とFASPプロトコルの汎用性とDIAスキャンモードの感度を組み合わせたものです。この組み合わせは、尿プロテオームの豊富な地図を提供します。当社の分析設定にはトラッピングカラムの使用が含まれていないため、FASPダイジェストは強いカチオン交換と逆相ステージのヒントの両方によって精製されました。トラップ列が分析列に直接接続されている場合、逆フェーズステージヒントステップを省略できます。このワークフローの使用はEPS尿サンプルを分析するために推奨されるが、それは使用は一般的に尿プロテオミクスに拡張することができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

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Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

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