Name: proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 to MG) og av POR Calabria FESR 2014-2020, aksjon 1.2.2, "INNOPROST".

Studien ble godkjent av Institutional Ethical Committee ved Magna Graecia University of Catanzaro, RP 41/2018. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som deltok i studien.
1. Prøvepreparering
<ol><li>Sentrifuger EPS-urinprøver innen 2 timer ved innsamling ved 2100 x g i 10 minutter ved romtemperatur (RT). Oppbevar supernatanten ved -80 °C til bruk.</li>
</ol>2. Prøve tining
<ol><li>Overfør prøven fra -80 °C til -20 °C dagen før fordøyelsen.</li>
	<li>Før prøvebehandling, overfør prøven i 15-20 minutter ved 4 °C og deretter ved RT.</li>
</ol>3. Reagensforberedelse for FASP
<ol><li>På samme dag, forberede følgende løsninger: urea buffer, 50 mM iodoacetamid (IAA) i urea buffer, 50 mM triethylammonium bikarbonat og 500 mM dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>Forbered ureabuffer (urea 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): For 10 ml, vei 4800 mg urea og oppløs den i riktig mengde HPLC-vann etter tilsetning av 1 ml 1 M Tris pH 8. Et volum på 800 μL urea er nødvendig for hver prøve.</li>
	<li>Forbered 500 mM dithiothreitol (DTT): løs opp 38,5 mg DTT i 500 μL HPLC-vann. For hver prøve er det nødvendig med 66,7 μL DTT.</li>
	<li>Forbered 50 mM IAA i Urea Buffer: løs opp 9,25 mg IAA i 1 ml ureabuffer. For hver prøve er det nødvendig med 50 μL IAA.</li>
	<li>Forbered 50 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB). Tilsett 150 μL 1 M TEAB til 2,85 ml HPLC-vann. For hver prøve er det nødvendig med 460 μL TEAB.</li>
	<li>Forbered en løsning av trypsin (100 ng/μL) i HPLC-vann. Denne oppløsningen kan oppbevares ved -80 °C og tines umiddelbart før bruk. For hver prøve er det nødvendig med 2 μL (200 ng).</li>
</ol>4. Protein fordøyelse av FASP
<ol><li>Fortynn 500 μL av hver EPS-urinprøve med 66,7 μL 10 % (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), 66,7 μL 500 mM DTT og 33,3 μL 1 M Tris pH 8 for å løse proteiner og redusere disfiledebindinger. Inkuber 10 minutter ved 95 °C med skånsom risting.</li>
	<li>Tilsett 300 μL fortynnet EPS-urinprøve på filterenheten (10 kDa) og sentrifuge ved 14 000 x g i 20 minutter.</li>
	<li>Tilsett 200 μL ureabuffer i filteret og sentrifugen ved 14 000 x g i 15 minutter. Gjenta dette trinnet, og kast deretter gjennomstrømningen.</li>
	<li>Tilsett 50 μL IAA-oppløsning og sentrifuge ved 6000 x g i 25 minutter.</li>
	<li>Tilsett 200 μL ureabuffer og sentrifuge ved 14 000 x g i 20 minutter. Gjenta dette trinnet, og kast deretter gjennomstrømningen.</li>
	<li>Tilsett 200 μL 50 mM trietylammoniumbikarbonatbuffer (TEAB) og sentrifuge ved 14 000 x g i 20 minutter. Gjenta dette trinnet.</li>
	<li>Overfør filterenheten til et nytt oppsamlingsrør.</li>
	<li>Tilsett 60 μL 50 mM TEAB buffer og 200 ng trypsin og inkuber prøven i en termoblander ved 37 °C over natten. MERK: For å unngå prøvefordampning under inkubering over natten, pakk hver filterenhet med et lag aluminiumsfolie og deretter et lag med parafilm.</li>
	<li>Etter trypsininkubasjon, tilsett 140 μL vann og sentrifuger hetteglasset ved 14.000 x g i 25 minutter for å samle volumet av fordøyelse (180-200 μL).</li>
</ol>5. Reagenspreparat for SCX-rensing
<ol><li>Forbered 1 ml vask 1 (0,5% maursyre (FA) og 20% acetonitril (ACN)) som følger: Tilsett 50 μL 10% FA og 200 μL 100% ACN til 750 μL HLPC vann. For hver prøve er det nødvendig med 100 μL vask 1.</li>
	<li>Forbered 1,5 ml vask 2 (0,5% FA og 80% ACN) som følger: Tilsett 75 μL 10 % FA og 1,2 ml 100 % ACN til 225 μL HPLC-vann. For hver prøve er det nødvendig med 190 μL vask 2.</li>
	<li>Forbered 100 μL elutingsløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% ACN): tilsett 25 μL 2 M AA og 20 μL 100% ACN til 55 μL HPLC-vann.</li>
	<li>Forbered trinntips på følgende måte.<ol>
<li>Pakk en 200 μL pipettespiss med et lag SCX-harpiks med en stump sprøytenål (måler 16). Sett StageTip inn i et mikrocentrifugelokk som tidligere er gjennomboret for å imøtekomme mikrokolumnen.</li>
		<li>Monter lokket på en 2 ml mikrosenter som det originale lokket ble fjernet fra. Micro-SPE sentrifugalenheten som nettopp er montert, skal passe inn i en sentrifuge på benken. Siden perforerte lokk er kjedelige å forberede, kan de brukes flere ganger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. SCX rensing
<ol><li>Fortynn 30 μL av hver prøve til 120 μL ved hjelp av vask 2.</li>
	<li>Kondisjoner StageTip ved å tilsette 50 μL vask 1 på toppen av ekstraksjonsharpiksen og sentrifugen ved 400 x g i 2 minutter. Siden strømningsmotstanden avhenger av hvor sterkt ekstraksjonsharpiksen ble pakket inn i pipettespissen, kan sentrifugeringshastigheten måtte justeres for å oppnå en strømningshastighet på 20-30 μL / min. Prøv å ikke la spissen være tørr under prøvelasting og vasking.</li>
	<li>Likevekt StageTip med 50 μL vask 2 og sentrifuger ved 400 x g i 2 minutter.</li>
	<li>Last den fortynnede prøven (120 μL) med lavere spinnhastighet.</li>
	<li>Vask StageTip med 50 μL vask 2 og sentrifuger ved 400 x g i 2 minutter. Gjenta med 50 μL vask 1. MERK: Etter denne vasken må harpiksen være helt tørr.</li>
	<li>Elute peptidblanding med 7 μL eluate oppløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% av ACN) langsomt ved hjelp av lavere spinnhastighet.</li>
	<li>Tilsett 27 μL 0,1 % FA for å fortynne AA og for å få en prøve for LC-MS/MS foreløpig injeksjon. Den endelige fortynning til 34 μL vil resultere i et 1: 1 volumetrisk forhold mellom urin og peptidoppløsning (1 μL renset fordøye vil tilsvare 1 μL original urinprøve).</li>
</ol>7. Protein kvantifisering etter ekstern standard ved hjelp av DDA analyse (Figur 2)
<ol><li>Bestem proteinmengden i prøver ved å injisere 2 μL av det resulterende peptidsammendraget i LC-MS/MS og interpolere det resulterende totale peptidområdet med en kalibreringskurve bygget som følger:</li>
	<li>Forbered fem forskjellige HeLa-fordøyeløsninger (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) ved hjelp av en HeLa-sammendragslager (100 μg/μL).</li>
	<li>Injiser hver Hela-løsning i duplikat (2 μL).</li>
	<li>Angi LC-MS/MS-metoden.<ol>
<li>Injiser 2 μL av de fem HeLa peptidblandingene og separer peptider gjennom en lineær gradient på 75 minutter med en strømningshastighet på 230 nL/minutt på en 15 cm, 75 μm i.d kolonne fullpakket med 3 μm C18 silikapartikler. Bruk en binær gradering som utgjøres av mobil fase A (0,1 % AKTIVA, 2 % ACN) og mobil fase B (0,1 % AKTIVA og 80 % av ACN).</li>
		<li>Utfør gradient elution ved å øke mobil fase B-innhold fra 6% til 42% på 60 minutter og fra 42% til 100% i ytterligere 8 minutter. Vedlikehold i 5 minutter 100 % B, og flytt deretter tilbake til 0 % B på to minutter.</li>
		<li>Bruk i DDA-modus ved hjelp av en topp-12-metode og sett MS full skanneområde til 350-1800 m / z, oppløsning 70,000, ACG-mål 1e6 og maksimal injeksjonstid 50 ms. Sett massevinduet for forløperionisolasjon på 1,6 m/z, oppløsning 35 000, ACG-mål 1e5, maksimal injeksjonstid 120 ms, HCD-fragmentering ved 25 NCE (normalisert kollisjonsenergi) og dynamisk ekskludering 15 sekunder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser råfiler ved hjelp av Sequest som søkemotor, og HUMAN Uniprot Complete proteinsekvens som database. I eksperimentene som presenteres her, ble databasen lastet ned i mars 2016 og inneholdt 42.013 sekvenser.<ol>
<li>Bruk følgende innstillinger: MS-toleranse 15 ppm, MS/MS-toleranse 0,02 Da, trypsin som enzym ved å angi to tapte spaltingssteder. Sett karbiamidometylering av lysin, serin, treonin, tyrosin (+57.021) og oksidasjon av metioniner som dynamiske modifikasjoner og karbamidometylering av cysteiner (+57.021) som statiske modifikasjoner. Bruk avskjæringen av falsk oppdagelsesrate (FDR) for peptider og proteinidentifikasjon til 0,01 og filtrer ut med trakter.</li>
		<li>Beregn toppområdet for alle MS1 peptidsignaler. Beregn det totale arealet av peptidene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injiser 2 μL peptidblandinger hentet fra EPS-urinprøver ved hjelp av samme LC-MS/MS-metode som brukes til HeLa-prøvene, og analyser råfilen ved hjelp av de samme parameterne som brukes for HeLa-databehandling.</li>
	<li>Beregn total intensitet av peptidsignaler ved å summere arealverdier for alle identifiserte peptider og interpolere den eksterne standardkurven. Dette vil gi en akseptabel estimering av peptidmengden som er tilstede i EPS-urinproteinfordøyelsen.</li>
</ol>8. Reagensforberedelse for C18 StageTip-protokollen
<ol><li>Forbered 500 μL oppløsning A (0,1% trifluoroedsyre (TFA), 50% ACN): tilsett 250 μL 100% ACN og 10 μL 5% TFA til 240 μL HPLC-vann.</li>
	<li>Forbered 2 ml løsning B (0,1 % TFA): Tilsett 40 μL 5 % TFA til 1960 μL HPLC-vann.</li>
	<li>Forbered 100 μL eluting løsning (0,1% FA, 50% ACN): tilsett 1 μL 10% FA og 50 μL 100% ACN til 49 μL HPLC vann.</li>
	<li>Forbered trinntips som beskrevet tidligere. I dette tilfellet brukes C18-ekstraksjonsdisker.</li>
</ol>9. SCX/C18 StageTip-protokoll
MERK: Rens EPS-urinfordøyd etter C18 StageTip-protokollen for å fjerne salter.
<ol><li>Start fra 2 μg peptider (som kvantifisert av den foreløpige injeksjonen). Fortynn fordøyelsesoppløsningen 4 ganger i vask 2 SCX og fortsett som beskrevet ovenfor (i avsnittet "SCX rensing"). Elute peptidblandingen med 7 μL eluateoppløsning (500 mM ammoniumacetat (AA) og 20% av ACN) langsomt ved hjelp av en lavere spinnhastighet (5 μL / min strømningshastighet).</li>
	<li>Acidifiser SCX-eluatet med 150 μL 0,1% trifluoroeddiksyre (TFA) for å oppnå en pH lavere enn 3 og en konsentrasjon av organisk løsningsmiddel under 5%.</li>
	<li>Kondisjoner C18 StageTip med 50 μL oppløsning A og sentrifuge ved 400 x g i 2 minutter. Likevekt C18 StageTip med 50 μL oppløsning B og sentrifugering ved 400 x g i 2 minutter.</li>
	<li>Last prøven på scenespissen langsomt ved hjelp av en lavere spinnhastighet.</li>
	<li>Vask C18 StageTip med 50 μL oppløsning B og sentrifuge.</li>
	<li>Eliut peptidblandingen langsomt med 10 μL elutionløsning ved hjelp av lavere spinnhastighet.</li>
	<li>Tørk eluatet (10 μL) ved 30 °C i en vakuumsentrifuge i 3 minutter. Tilsett 47 μL 0,1% FA. Forventet peptidkonsentrasjon vil være 40 ng / μL. Analyser av LC-MS / MS i DIA-modus.</li>
</ol>10. DIA-analyse (figur 3)
<ol><li>nanoLC-separasjon: Skill peptidblandingen ved hjelp av en lineær gradient på 140 minutter med en strømningshastighet på 230 nL/min på en 15 cm, 75 μm ID-kolonne fullpakket med 3 μm C18 silikapartikler.<ol>
<li>Utfør gradient elution med 230 nL / minutt strømningshastighet og øk mobil fase B-innhold fra 3% til 25% på 90 minutter, deretter fra 25% til 40% på 30 minutter og til slutt fra 40% til 100% på 8 minutter.</li>
		<li>Etter 10 minutter ved 100% B, likevekt kolonnen med mobil fase A i 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Massespektrometriske parametere: Utfør DIA-analyse ved hjelp av en metode som bruker følgende skannesyklus: (i) en MS-hendelse med full skanning med en oppløsning på 17 500 (AGC-mål 1e6, maksimal injeksjonstid 50 ms) etterfulgt av (ii) 20 vinduer med 20 m/z isolasjonsbredde, fra m/z 350, (ii) 5 vinduer med 50 m/z isolasjonsbredde og (iv) 1 vindu ved 200 m/z isolasjonsbredde, og avslutter skanneområdet til DIA ved 1200 m/z. Utfør DIA-skanninger med oppløsning 35 000 (AGC-mål 5e5, maksimal injeksjonstid 120 ms og 25 NCE).</li>
</ol>11. Høy-pH reversert fase C18 fraksjonering for bibliotekgenerering
MERK: Pool EPS-urin representative prøver i en mengde høyere enn 10 μg for å bygge et dataavhengig bibliotek for DIA-analyse ved hjelp av følgende prosedyre:
<ol><li>Forsure peptidblandingen (11 μg) med 0,2% av TFA og last den resulterende løsningen på en C18 StageTip fullpakket med to lag ekstraksjonsskiver for å tillate høyere kapasitet. Vi anslo lastekapasiteten til en enkelt mikrodisk (fra en 16 gauge sprøytenål) å være i 5-10 μg-området.</li>
	<li>Tilstand og likevekt stasjonær fase som allerede beskrevet for C18 rensing.</li>
	<li>Utfør peptidfraksjonering trinnvis elution (n = 10) fra høy pH reversert fase C18 ved hjelp av elutionløsninger som inneholder 0,2% ammoniumhydroksid, 10 mM TEAB og økende v/v-konsentrasjoner av ACN (4 %, 8 %, 12 %, 16 %, 20 %, 24 %, 28 %, 32 %, 40 %, 80 %).</li>
	<li>Analyser de 10 fraksjonene ved hjelp av de samme kromatografiske parametrene til DIA-metoden. Bruk massespektrometeret i DDA-modus ved hjelp av innstillingene som tidligere ble vedtatt for den foreløpige analysen (se "Protein kvantifisering etter ekstern standard ved hjelp av DDA-analyse").</li>
</ol>12. Dataanalyse
<ol><li>Generer spektralbiblioteket ved å importere proteinidentifikasjonsresultatene hentet fra DDA LC-MS/MS-eksperimenter med høy reversert fase C18-fraksjonering i en programvare dedikert til DIA-analyse.</li>
	<li>Sett minimum og maksimum antall fragmentioner som brukes til identifisering og kvantifisering til henholdsvis 3 og 6. Filtrer de oppnådde resultatene med en Q-verdi på 0,01.</li>
	<li>Importer DIA raw-filer og knytt til hver RAW-fil den samme FASTA-filen som brukes til å opprette spektralbiblioteket.</li>
	<li>Sett minimum og maksimum antall unike peptider som brukes til protein kvantifisering til henholdsvis 1 og 10.</li>
	<li>Beregn intensiteten for hvert protein ved å summere fragmentiontoppområdet.</li>
	<li>Generer en matrise med intensiteten av de kvantifiserte proteinene i hver prøve.</li>
</ol>

<ol>
	<li>H&#252;ttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).</li><li>Roobol, M. J., Carlsson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+stratification+in+prostate+cancer+screening.">Risk stratification in prostate cancer screening.</a> Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).</li><li>Principe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prostate-enriched+proteins+by+in-depth+proteomic+analyses+of+expressed+prostatic+secretions+in+urine.">Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine.</a> Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics+identifies+liquid-biopsy+signatures+for+extracapsular+prostate+cancer.">Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer.</a> Nature Communications. 7, 1-10 (2016).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+collection+and+protein+properties+of+expressed+prostatic+secretions+as+a+source+for+biomarkers+of+prostatic+disease.">Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease.</a> Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).</li><li>Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+based+clinical+proteomics:+Applications+to+cancer+research.">Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research.</a> Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).</li><li>Berger, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MStern+blotting-high+throughput+polyvinylidene+fluoride+(PVDF)+membrane-based+proteomic+sample+preparation+for+96-well+plates.">MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).</li><li>Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(STrap)+sample+preparation+method+for+bottom-up+proteomics+analysis.">Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis.</a> Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+Proteomics:+Evaluation+of+Different+Sample+Preparation+Workflows+for+Quantitative,+Reproducible,+and+Improved+Depth+of+Analysis.">Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+and+annotation+of+human+normal+urinary+proteome.">A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+Filter+Aided+Sample+Preparation+(FASP)+and+Multienzyme+Digestion+FASP+Protocols.">Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+sample+preparation+in+96-well+filter+plates+for+quantitative+clinical+proteomics.">Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+A+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).</li><li>Liu, Y., H&#252;ttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+protein+maps+for+biomarker+discovery+and+clinical+research.">Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).</li><li>Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+LC-MS/MS+analysis:+Implication+for+proteomics+experiments.">Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments.</a> Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).</li><li>Muntel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Urinary+Protein+Biomarker+Discovery+by+Data-Independent+Acquisition+on+a+Quadrupole-Orbitrap+Mass+Spectrometer.">Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Differentially+Expressed+Proteins+in+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions+of+Men+with+Organ-confined+Versus+Extracapsular+Prostate+Cancer.">Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).</li><li>Decramer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+in+clinical+proteomics.">Urine in clinical proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).</li><li>Thongboonkerd, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+points+in+urinary+proteomics.">Practical points in urinary proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).</li><li>Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics.">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions.">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li></ol>

Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.

I dette arbeidet presenteres en strategi for å analysere EPS-urinprøver. FASP-protokollen er et ideelt valg for urinproteomikk fordi den tillater prøvekonsentrasjon før enzymatisk fordøyelse. Faktisk, ved hjelp av denne arbeidsflyten, kan flere hundre mikroliter urin lastes på et enkelt filter og behandles. Videre gir fordøyelsen på filteret relativ frihet i valg av denatureringsforhold. I vårt arbeid oppnås protein denaturering ved å fortynne urinprøver i en buffer som inneholder Tris, SDS og DTT (sluttkonsentrasjon: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Proteiner denatureres effektivt umiddelbart etter opptining av prøven, for å unngå uønsket nedbrytning ved aktive proteaser. Den opprinnelige FASP-protokollen er forbedret ved å øke volumet av vasker fra 100 μL til 200 μL. På denne måten oppnås bedre fjerning av rester, spesielt vaskemidler fra filteret.
Etter enzymatisk fordøyelse utføres proteinestimering etter ekstern standard ved hjelp av en rask LC-MS/MS, dataavhengig metode før de siste trinnene i protokollen, som består av dobbel StageTip-rensing og LC-MS/MS-analyse i DIA-modus, på likt startmateriale for alle prøver (2 μg).
Allsidigheten til FASP er knyttet til DIA-tilnærmingen, en sensitiv metode som gir et lavt antall manglende verdier17. I vårt arbeid ble 2387 proteiner identifisert og kvantifisert, slik at en detaljert proteomisk profil av EPS-urin kunne trekkes. Identifisering og kvantifisering av 2387 proteiner var mulig gjennom generering av et rikt spektralbibliotek, oppnådd via høy-pH reversert fraksjonering av peptider, og ved vår DIA-metode, rettet mot et bredt m / z forløperområde. Denne arbeidsflyten identifiserte over 80% av proteiner som tidligere ble funnet i direkte EPS-analyse, og viste at en betydelig brøkdel av EPS-urinproteomet faktisk er avledet fra uttrykte prostatiske sekreter, og er dermed en rik kilde til prostatavevsspesifikke proteiner26.
Til slutt parer vår eksperimentelle design allsidigheten til FASP med følsomheten til DIA for å få et rikt kart over urinproteomet. Denne strategien anbefales for å analysere EPS-urinprøver, men bruken kan utvides til urinproteomikk generelt, eller til og med til andre prøvetyper.

Den konstante utviklingen av proteomiske teknologier lover å ha en betydelig innvirkning på å hjelpe sykdomsdiagnose og prediksjon av respons på behandling ved å gi høyoppløselige kart over viktige molekylære effektorer tilstede i et bredt utvalg av prøver som vev og biofluider. Fra et analytisk synspunkt tilbyr urin flere fordeler som enkel innsamling og stor stabilitet av proteomet med hensyn til andre biofluider1. Proteomisk analyse av urin er av spesiell interesse for biomarkøroppdagelsesstudier på urologiske kreftformer, siden det tillater ikke-invasiv prøvetaking i nærheten av vev av interesse2. Spesielt er en prøve som ser ut til å være lovende for å studere prostatarelaterte patologier EPS-urin3,4 (dvs. en urinprøve samlet inn etter en digital rektal eksamen (DRE)). Denne sistnevnte operasjonen før prøveinnsamling beriker urin med prostataspesifikke proteiner. EPS-urin er en god kandidat til å undersøke lidelser relatert til prostatakjertelen5 inkludert prostatakreft (PCa), siden gjennom DRE kan proteiner utskilt av svulsten helles i urinprøven, noe som øker sjansen for å oppdage kreftvevsspesifikke proteiner.
En avgjørende rolle i å tillate deteksjon og kvantifisering av potensielle proteinbiomarkører spilles av massespektrometri (MS). I løpet av de siste to tiårene har MS-baserte protokoller for proteomisk analyse gjort det mulig å oppdage et stadig økende antall proteiner i en enkelt LC-MS/MS-kjøring takket være kontinuerlige forbedringer i MS-instrumentering og i dataanalyseprogramvare6.
MS-basert proteomisk prøvepreparering innebærer generelt enzymatisk fordøyelse av proteinblandingen, som kan oppnås via et bredt spekter av protokoller som: fordøyelse i løsningen, MStern blotting7,suspensjonsfangst (S-felle)8, solidfaseforbedret prøvepreparering (SP3)9, in-StageTip fordøyelse10 og filterassistert prøvepreparering (FASP)11. Alle protokoller kan brukes til urinproteomikk, selv om resultatene kan variere med hensyn til antall identifiserte proteiner og peptider og når det gjelder reproduserbarhet12.
I dette arbeidet var vår oppmerksomhet fokusert på analysen av EPS-urin av FASP-protokollen. FASP-protokollen ble opprinnelig designet for å analysere proteiner hentet fra vev og cellekulturer, men bruken ble deretter utvidet til analyse av andre prøvetyper, for eksempel urin13. Med hensyn til enkel fordøyelse i løsningen FASP er en mer fleksibel proteomisk tilnærming14, siden ved å oppnå effektiv fjerning av vaskemidler og andre forurensninger som salter fra proteinblandingen før enzymatisk fordøyelse15, tillater det valg av optimale proteinløsningsforhold. Videre er en ekstra egenskap ved FASP at den gir et middel for prøvekonsentrasjon. Dette er spesielt interessant for urinproteomisk analyse, fordi det gjør det mulig å starte fra relativt store prøvevolumer (hundrevis av mikroliter). I lys av potensialet i FASP-protokollen har flere studier fokusert oppmerksomheten på arbeidsflytautomatisering, med sikte på å redusere eksperimentell variasjon og behandle et forhøyet antall prøver parallelt16.
I arbeidsflyten vår etterfølges FASP av LC-MS/MS-anskaffelse i datauavhengig analyse (DIA), som gir høy proteomdekning, god kvantitativ presisjon og lav forekomst av manglende verdier. DIA-tilnærmingen er en sensitiv metode der alle ioner velges for MS/MS-hendelser, motsatt av hva som skjer i dataavhengig analyse (DDA) der bare ioner med høyest intensitet fragmenteres. Massespektrometeret, som opererer i DIA-modus, utfører skannesykluser med forskjellig isolasjonsbredde som dekker hele m / z forløperområdet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å reprodusere et høyt antall peptider per enhetstid, noe som gir et proteomisk øyeblikksbilde avprøven 17. Videre har data generert av DIA en annen interessant egenskap: muligheten for en posteriorianalyse 18. DIA-data er mer komplekse enn de som er innhentet av DDA, fordi MS/MS-spektra i DIA er et resultat av samtidig isolering av flere forløperioner i hvert m/z-vindu 19. Disentangling kompositt MS / MS spektra i distinkte og spesifikke peptid signaler oppnås ved hjelp av to grunnleggende elementer: et spektral bibliotek og en dedikert programvare for dataanalyse. Spektralbiblioteket genereres av et dataavhengig eksperiment, som vanligvis involverer peptidfraksjonering for å maksimere proteomdekningen, som gir en liste over tusenvis av eksperimentelt bestemte forløperioner og MS /MS-spektra av peptider som kan påvises i prøven som vurderes. Dataanalyseprogramvaren bruker i stedet informasjonen i spektralbiblioteket til å tolke DIA-dataene ved å generere spesifikke ekstraherte ionkromatogrammer som tillater peptiddeteksjon og kvantifisering. Selv om biblioteksfri DIA-dataanalyse nå er mulig, gir bibliotekbasert DIA fortsatt bedre resultater når det gjelder proteomdekning20.
Prøveprepareringsprotokollen her beskrevet (figur 1) består av følgende trinn: et sentrifugeringstrinn (for å fjerne celleavfall), FASP-fordøyelse, StageTip rensing21, kvantifisering av proteiner og DIA-analyse. Denne protokollen er designet for analyse av EPS-urin i sammenheng med biomarkøroppdagelse av prostatakreft, men den kan brukes til proteomisk analyse av enhver urinprøve.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

Filterassistert prøveprotokoll (FASP) er mye brukt til proteomics prøvepreparering fordi det gjør det mulig å konsentrere fortynnede prøver, og det er kompatibelt med et bredt utvalg av vaskemidler. Nedenfra-og-opp-proteomiske arbeidsflyter som FASP er i økende grad avhengige av LC-MS/MS-metoder utført i datauavhengig analysemodus (DIA), en skannemetode som tillater dyp proteomdekning og lav forekomst av manglende verdier. 
I denne rapporten vil vi gi detaljer om en arbeidsflyt som kombinerer en FASP-protokoll, et dobbelt StageTip-rensetrinn og LC-MS/MS i DIA-modus for urinproteomkartlegging. Som modellprøve analyserte vi uttrykte prostatiske sekreter (EPS)-urin, en prøve samlet inn etter en digital rektal eksamen (DRE), som er av interesse for oppdagelsesstudier av prostatakreftbiomarkør.

Denne protokollen for urinproteomisk analyse inkluderer følgende trinn: FASP-fordøyelse, estimering av proteinmengde via ekstern standardkalibrering, dobbel StageTip-rensing (SCX og C18) og LC-MS/MS-analyse i DIA-modus.
Etter protein fordøyelsen utføres foreløpige injeksjoner etter StageTip SCX rensing av de resulterende peptidene. LC-MS / MS raw-filer behandles for å oppnå antall identifiserte peptider, antall identifiserte proteiner og området med påviste peptider. Det totale arealet oppnådd ved å summere alle identifiserte peptider brukes til å estimere proteininnhold via interpolering til en ekstern standard: et HeLa-proteinsammendrag injisert på fem forskjellige mengder (henholdsvis 2, 5, 15, 50, 150 ng). Proteinmengden for de seks prøvene som ble analysert i denne studien varierte fra prøve til prøve, og viste en gjennomsnittsverdi på 78 ng/μL.
Etter proteinestimering renses 2 μg fordøyde proteiner fra hver prøve av sekvensiell SCX og C18 StageTip før DIA-analyse. Spektralbiblioteket for søking av DIA-data opprettes etter høy-pH reversert fasefraksjonering og DDA LC-MS/MS-analyse av et representativt utvalg (f.eks. et utvalg). Ved hjelp av parametrene beskrevet ovenfor har vi identifisert og kvantifisert, kumulativt, 2387 proteingrupper i de seks EPS-urinprøvene som vurderes (Supplerende tabell 1 og figur 4).
For å evaluere fra et kvalitativt synspunkt relevansen av listen over identifiserte og kvantifiserte proteiner, ble den oppnådde matrisen sammenlignet med en liste over 624 proteiner som tidligere ble identifisert i direkte- EPS22, en prøve samlet inn i en mer invasiv prosedyre, som har vist seg å være en kilde til interessante kandidat prostatakreft biomarkører. Totalt ble 508 av 624 proteiner vellykket oppdaget av vår FASP / DIA-protokoll på EPS-urin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> Figur 1: Proteomisk arbeidsflyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> Figur 2: Representasjon av vårt eksperimentelle design for protein kvantifisering basert på ekstern standard (HeLa digest). Klikk her for å se en større versjon av denne <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> Figur 3: Viktige trinn iDIA-analyse: (i) utarbeidelse av spektralbiblioteket gjennom høy-pH reversert fasefraksjonering og DDA-analyse, (ii) prøveanalyse ved hjelp av DIA-tilnærmingen, (iii) dataanalyse av Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> Figur 4: Rangert plott for de påviste EPS-urinproteinene. Noen få utvalgte treff er merket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende tabell 1: Representativ tabell over kvantifiserte proteiner i seks EPS-urinprøver i Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Her presenterer vi en optimalisert fordøyelsesprotokoll på filteret med detaljert informasjon om følgende: protein fordøyelse, peptidrensing og datauavhengig anskaffelsesanalyse. Denne strategien brukes til analyse av uttrykte prostatiske sekreter-urinprøver og tillater høy proteomdekning og lav manglende verdi etikettfri profilering av urinproteomet.

Proteomisk profil av EPS-urin gjennom FASP fordøyelse og datauavhengig analyse

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

FASP-protokollen er en interessant tilnærming til urinproteomikken din på grunn av kompatibiliteten med sterkt denaturerende buffere og på grunn av dens evne til å konsentrere prøven på filteret, noe som er kritisk for fortynnede proteinprøver. FASP-protokollen kombinert med datauavhengig analyse massespektrometri gjør at vi kan oppnå dyp proteomdekning i EPS-urin, som er urin samlet inn etter digital rektal eksamen. Vi bruker for tiden metoden du er i ferd med å se i en biomarkøroppdagelsesinnsats på prostatakreft.Prosedyren vil bli vist av Licia Prestagiacomo, Paola Morelli og Caterina Gabriele. Sentrifuger EPS-urinprøver innen to timer etter innsamling i 10 minutter ved 2100 RCF ved romtemperatur. Oppbevar deretter supernatantene på minus 80 grader celsius til bruk.Kast prøvene på is, eller ved fire grader. For å akselerere prosedyren kan du overføre prøvene fra minus 80 til minus 20 på dagen før fordøyelsen. Som lagerløsninger trenger du 500 millimolar DTT, 10% SDS, en molar Tris buffer ved pH åtte.Fortynn 500 mikroliter av hver EPS-urinprøve med 67 mikroliter SDS, 67 mikroliter DTT og 33 mikroliter Tris-buffer. Inkuber ved 95 grader celsius i 10 minutter med mild risting. Monter sentrifugalfilterenheten med en 10 000 Dalton molekylvekt avskåret.Tilsett deretter 300 mikroliter fortynnet EPS-urinprøve til filteret. Sentrifuge ved 14.000 g i ca. 20 minutter. Du kan avbryte prosedyren midlertidig etter 15 minutter eller så for å sjekke om filtreringen går jevnt.Fortsett til hele løsningen har gått gjennom filteret. Tilsett deretter 200 mikroliter ureabuffer og sentrifuge ved 14 000 g i 15 minutter. Gjenta dette trinnet en gang til.Når gjennomstrømningen er i ferd med å berøre filteret, tømmer du samlingen Eppendorf ved å pipette ut gjennomstrømningen. Proteiner er trygge på filteret. For cysteinalkylering, lag en iodoacetamidoppløsning umiddelbart før bruk.Vei ca 10 milligram iodoacetamid i et tall Eppendorf hetteglass og oppløs det i ureabuffer ved en konsentrasjon på 9,25 milligram per ml, eller i molaritetsbetingelser, 50 millimolar. Tilsett 50 mikroliter iodoacetamidoppløsning til hvert filter og sentrifuger ved 6000 g i 25 minutter. Den lavere sentrifugeringshastigheten gjør at filtrene ikke går tørre.Etter proteinalkylering, vask filtrene med to påfølgende 200 mikroliter aliquots av urea buffer og sentrifuge ved 14.000 g i 20 minutter. Kast gjennomstrømningen. Tilsett 200 mikroliter 50 millimolar tre etylammoniumbikarbonatbuffer og sentrifuger ved 14 000 g i 20 minutter.Gjenta dette trinnet. Etter å ha fullført den siste bikarbonatvasken, overfør filterenheten til et nytt oppsamlingsrør. Tilsett deretter 60 mikroliter 50 millimolar TEAB-buffer.Tilsett en mikroliter trypsinoppløsning i en konsentrasjon på 200 nanogram per mikroliter trypsin. Alternativt kan du forberede fordøyelsesbufferen for alle prøver i et Eppendorf-hetteglass og distribuere 61 mikroliter av fordøyelsesbufferen til hvert filter. Hvis du bruker en ThermoMixer for å unngå prøvefordampning under inkubering over natten, pakk inn hver filterenhet med et lag aluminiumsfolie, og deretter et lag med parafilm.Inkuber prøvene ved 37 grader over natten. Neste morgen overfører du filtrene til en benk topp sentrifuge for et veldig kort spinn. Etter spinning åpner du Eppendorf-lokkene og tilsetter 140 mikroliter vann.Sentrifuger hetteglassene på 14.000 g i 25 minutter, for å samle peptidene. Det innsamlede volumet skal være rundt 190 mikroliter. For å fjerne spor av SDS fra fordøyelsen, anbefales sterk kationutvekslingsrensing av peptidene før LC-MS-MS.Forbered mikrokolumnholderne ved å piercing Eppendorf lokk med et skarpt verktøy som et par pinsett eller saks. Holderen vil imøtekomme mikrokolumnen under sentrifugering. Siden de er kjedelige å forberede, kan holdere brukes flere ganger.Bruk en stump og en nål, fjern en plakett av riktig ekstraksjonsskive. Ekstraksjonsskiver er myke polymere materialer som inneholder sorbente partikler. I dette tilfellet er sorbenten laget av partikler med sterke kationutvekslingsegenskaper.Tilpass plakket i en pipettespiss på 200 mikroliter. Bruk et stempel til å skyve pluggen mot enden av spissen. Den lille platen skal skyves fast, men unngå overdreven styrke.Sett spissen inn i holderen og monter spin microcolumn med et to milliliter Eppendorf hetteglass som det opprinnelige lokket ble fjernet fra. Pluggen fra en måler 16 nål vil ha en lastekapasitet på omtrent fem mikrogram peptider. Kondisjoner mikrokolumnen med to påfølgende vasker.Riktig hastighet avhenger av hvor sterkt du skyver platen inn i pipettespissen. Ta sikte på å oppnå en strømning i rekkefølgen 20 til 30 mikroliter per minutt. Prøv å ikke la spissen gå tørr under vask og under prøvelasting.Fortynn prøven fem ganger i vaskeoppløsning to og last inn resultatene i oppløsning med lavere hastighet. Sikt på en strømningshastighet på ca. 15 til 20 mikroliter per minutt. Kast om nødvendig gjennomstrømningen.Vask bort gjenværende vaskemidler. La deretter platen gå tørr før peptidution. Overfør mikrokolonnen til et rent 1,5 Eppendorf-rør og tilsett straks eluenten.Som vil være syv mikroliter av en 500 millimolar ammoniumacetatoppløsning som inneholder 20% acetonitril. Fortynn eluatet med 27 mikroliter 0,1% maursyre for å redusere prosentandelen organisk løsningsmiddel og injiser deretter to mikroliter av den resulterende løsningen i LC-MS-MS med deteksjon i dataavhengig modus. Detaljer om LC-MS-oppsettet som brukes i denne protokollen, vil bli gitt senere i videoen.Når du har utført databasesøk og peptidfeilintegrasjon, beregner du det totale toppområdet. Sammenlign den deretter med en ekstern standardkurve for å estimere peptidkonsentrasjon i FASP-sammendraget. Etter å ha estimert peptidmengde, rens en ny aliquot av FASP-fordøye som tilsvarer to mikrogram peptider ved to påfølgende StageTip-rensinger som beskrevet her.LC-MS-oppsettet som brukes i denne protokollen, er basert på direkte injeksjon i den analytiske kolonnen. Hvis du bruker et system med en overlappingskolonne, kan du unngå trinnet med frakoblet C18-rensing. Husk å bruke dedikerte nåler og stempler for hvert kromatografiske materiale.Etter å ha unndratt peptidene fra C18 Stage Tip med 10 mikroliter eluent, fordamper du delvis eluate i en vakuum sentrifuge i noen minutter, og prøver å unngå full fordampning. Tilsett deretter 47 mikroliter 0,1 % maursyre og legg den resulterende løsningen i et HPLC-hetteglass for LC-MS-analyse. Systemet som brukes her, er basert på direkte innlasting av kolonneeksempel uten å bruke en overlappingskolonne.Analytiske søyler er internt laget ved å trekke en 75 mikrometer ID kapillær etter å ha fjernet et stykke polyamidbelegg. Den resulterende spissen kan være forsiktig formet med en keramisk kutter. Kapillæren plasseres deretter i en pakkebombe og pakkes med en 50 milligram per ml isopropanolslam av C18 tre mikrometer stasjonære fasepartikler.Et gasstrykk på mellom 10 og 20 bar nitrogen eller helium er nødvendig. Du kan bruke alternative eller kommersielle kromatografikolonner som kjører ved submikroliter per minutt-strømningshastighet. Sett sammen kolonnen på et T-stykke.De to andre endene er koblet til høyspennings strømforsyningen og til HPLC-sløyfen. Vurder den optimale sprayspenningen ved å kjøre systemet ved isokratisk strømning. Start deretter analysen.Skill peptidene over en to timer lang kromatografigradient som vist. Datainnsamlingen vil bestå av en rask fullstendig MS-tjenesteskanning etterfulgt av 26 MS-MS-skanninger på forløpervinduer med variabel bredde. Starter i 20 m / z bredde, for de første 20 vinduene som vil dekke et m / z-område fra 350 til 750 Thompson.Deretter flytter du til en bredde på 50 m/z for følgende fem vinduer og slutter med en enkelt MS-MS-skanning, med en isolasjonsbredde på 200 Thompson. Smalere bredder står for en mer befolket region av spekteret når det gjelder tilstedeværelse av peptidforløpere. For DIA-analyse trenger du et spektralbibliotek.For å generere et spektralbibliotek kan du utføre noen dataavhengige eksperimenter på det samme LC-MS-MS-systemet du har brukt til DIA-anskaffelse ved hjelp av samme kromatografigradient. Eksempelfraksjonering vil øke proteomdekningen. Trinntips kan brukes til prøvefraksjonering.Sterk kationutveksling og grunnleggende omvendt fase er to gyldige alternativer. Start med de 10 mikrogram av et basseng med flere FASP-sammendrag. Forsure prøven ved hjelp av 0,2 % TFA endelig konsentrasjon.Last inn peptidene på C18 Stage Tips med høy kapasitet. Bruk flere plater i tilfelle høye peptidmengder. For 10 mikrogram materiale anbefales to plater.Utfør C18-rensing som beskrevet tidligere. Forbered flere hetteglass for eluate oppsamling. Så mange som antall brøker.I dette tilfellet produseres 10 brøker trinnvis elution. Etter den siste vasken legger du til 20 mikroliter av den første eluenten. 0,2 % ammoniumhydroksid, 10 millimolar TEAB, 4 %acetonitril.Etter å ha unndratt den første brøkdelen i den første Eppendorf, flytter du stage tip til neste oppsamlings hetteglass. Fortynn i 20 mikrolitertrinn ved bruk som eluent, 0,2% av ammoniumhydroksid, 10 millimolar TEAB, og deretter økende mengde acetonitril. Når du har fraksjonert utvalgs- og dataavhengige eksperimenter på hver brøk, genererer du spektralbiblioteket ved databasesøk etter MS-MS-data.Biblioteket vil deretter bli importert i en programvare som er i stand til DIA-dataanalyse for protein kvantifisering basert på minst ett unikt peptid tildelt av minst tre overganger. Forvent å dekke et bredt spekter av urinproteomet. Denne figuren viser identifisering og kvantifisering av proteiner over et overflodsområde, som spenner over fem størrelsesordener.Arbeidsflyten her som presenteres kombinerer konsentrasjonsfordelen og allsidigheten til FASP-protokollen med følsomheten til DIA-skannemodus. Denne kombinasjonen gir et rikt kart over urinproteomet. Siden analyseoppsettet vårt ikke inkluderer bruk av en overlappingskolonne, ble FASP-sammendraget renset av både sterk kationutveksling og omvendt fasefasetips.Det omvendte fasetrinntipstrinnet kan utelates når en overlappingskolonne er koblet direkte til analysekolonnen. Bruken av denne arbeidsflyten anbefales for å analysere EPS-urinprøver, men bruken kan utvides til urinproteomikk generelt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Disseksjon av Human netthinnen og RPE-akkord for Proteomic analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bruker en omfattende Immunoprecipitation berikelse System for å identifisere en endogen post-translasjonell modifikasjon profil for målet proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID-Proteomic analyse av kontekstavhengige Protein komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk Proteomic og miRNA analyse av Polysomes fra isolert musen hjertet etter Langendorff perfusjon

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomic analyse av menneskelig Macrophage polarisering Under et lavt oksygeninnhold miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Utvinning og analyse av taiwanske grønne Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...