Name: proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Эта работа была поддержана MIUR (Министро Университет Ricerca, PRIN 2017 в MG) и POR Калабрии FESR 2014-2020, действие 1.2.2, "INNOPROST".

<ol>
	<li>H&#252;ttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).</li><li>Roobol, M. J., Carlsson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+stratification+in+prostate+cancer+screening.">Risk stratification in prostate cancer screening.</a> Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).</li><li>Principe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prostate-enriched+proteins+by+in-depth+proteomic+analyses+of+expressed+prostatic+secretions+in+urine.">Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine.</a> Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics+identifies+liquid-biopsy+signatures+for+extracapsular+prostate+cancer.">Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer.</a> Nature Communications. 7, 1-10 (2016).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+collection+and+protein+properties+of+expressed+prostatic+secretions+as+a+source+for+biomarkers+of+prostatic+disease.">Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease.</a> Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).</li><li>Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+based+clinical+proteomics:+Applications+to+cancer+research.">Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research.</a> Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).</li><li>Berger, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MStern+blotting-high+throughput+polyvinylidene+fluoride+(PVDF)+membrane-based+proteomic+sample+preparation+for+96-well+plates.">MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).</li><li>Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(STrap)+sample+preparation+method+for+bottom-up+proteomics+analysis.">Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis.</a> Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+Proteomics:+Evaluation+of+Different+Sample+Preparation+Workflows+for+Quantitative,+Reproducible,+and+Improved+Depth+of+Analysis.">Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+and+annotation+of+human+normal+urinary+proteome.">A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+Filter+Aided+Sample+Preparation+(FASP)+and+Multienzyme+Digestion+FASP+Protocols.">Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+sample+preparation+in+96-well+filter+plates+for+quantitative+clinical+proteomics.">Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+A+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).</li><li>Liu, Y., H&#252;ttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+protein+maps+for+biomarker+discovery+and+clinical+research.">Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).</li><li>Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+LC-MS/MS+analysis:+Implication+for+proteomics+experiments.">Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments.</a> Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).</li><li>Muntel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Urinary+Protein+Biomarker+Discovery+by+Data-Independent+Acquisition+on+a+Quadrupole-Orbitrap+Mass+Spectrometer.">Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Differentially+Expressed+Proteins+in+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions+of+Men+with+Organ-confined+Versus+Extracapsular+Prostate+Cancer.">Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).</li><li>Decramer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+in+clinical+proteomics.">Urine in clinical proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).</li><li>Thongboonkerd, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+points+in+urinary+proteomics.">Practical points in urinary proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).</li><li>Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics.">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions.">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li></ol>

Все авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.

В этой работе представлена стратегия анализа образцов ЭПС-мочи. Протокол FASP является идеальным выбором для протеомии мочевыводящих путей, поскольку он позволяет концентрации образца до энзиматической пищеварения. В самом деле, используя этот рабочий процесс, несколько сотен микролитров мочи могут быть загружены на один фильтр и обработаны. Кроме того, пищеварение на фильтре обеспечивает относительную свободу в выборе условий денатурации. В нашей работе денатурация белка достигается путем разбавления образцов мочи в буфере, содержащем Трис, СДС и ДДТ (окончательная концентрация: 50 мМ Трис, 1% SDS, 50 мМ ДТТ). Белки эффективно денатурированы сразу после оттаивания образца, чтобы избежать нежелательной деградации активными протеасами. Первоначальный протокол FASP был улучшен за счет увеличения объема моет со 100 йл до 200 йл. Таким образом, достигается лучшее удаление остатков, особенно моющих средств из фильтра.
После энзиматичного пищеварения, оценки белка по внешнему стандарту с использованием быстрого LC-MS/MS, зависящий от данных метод выполняется перед последними этапами протокола, которые включают двойную очистку StageTip и анализ LC-MS/MS в режиме DIA, на равных исходном материале для всех образцов (2 мкг).
Универсальность FASP связана с подходом DIA, чувствительным методом, обеспечивающим небольшое количество недостающих значений17. В нашей работе было выявлено и количественно выявлено 2387 белков, что позволило получить подробный протеомный профиль EPS-мочи. Идентификация и количественная оценка 2387 белков стала возможной благодаря генерации богатой спектральной библиотеки, полученной с помощью обратной фракционации пептидов с высоким рН, и нашим методом DIA, направленным на широкий диапазон прекурсоров м/з. Этот рабочий процесс определил более 80% белков, ранее найденных в прямом анализе EPS, демонстрируя, что значительная часть ПРОТЕом EPS-мочеиспускания действительно получена из выраженных простатических секретов, таким образом, является богатым источником специфических белковпростаты ткани 26.
В заключение, наш экспериментальный дизайн пары универсальность FASP с чувствительностью DIA для того, чтобы получить богатую карту мочевыводящих протеом. Эта стратегия рекомендуется для анализа образцов ЭПС-мочи, но ее использование может быть распространено на протеомию мочевыводящих путей в целом или даже на другие типы образцов.

Постоянная эволюция протеомных технологий обещает оказать значительное влияние на диагностику заболеваний и прогнозирование реакции на лечение путем предоставления карт высокого разрешения ключевых молекулярных эффекторов, присутствующих в самых разнообразных образцах, таких как ткани и биофлюиды. С аналитической точки зрения, моча предлагает ряд преимуществ, таких как простота сбора и основные стабильности протеома по отношению к другим биофлюидов1. Протеомный анализ мочи представляет особый интерес в исследованиях по открытию биомаркеров на урологических раковых заболеваниях, так как позволяет неинвазивный отбор проб в непосредственной близости оттканей,представляющих интерес 2 . В частности, образец, который кажется перспективным для изучения патологий, связанных спростатой,- это EPS-urine3,4 (т.е. образец мочи, собранный после цифрового ректального экзамена (DRE).). Эта последняя операция до сбора проб обогащает мочу специфическими белками простаты. EPS-моча является хорошим кандидатом для расследования расстройств, связанныхс предстательной железы 5 в том числе рака предстательной железы (PCa), так как через DRE, белки, выделяется опухоль может быть вылил в образец мочи, увеличивая вероятность обнаружения рака ткани конкретных белков.
Решающую роль в выявлении и количественной оценке потенциальных биомаркеров белка играет масс-спектрометрия (МС). За последние два десятилетия протоколы на основе MS для протеомного анализа позволили постоянно растущее количество белков, которые будут обнаружены в одном LC-MS / MS перспективе благодаря непрерывным улучшениям в MS приборов и в программном обеспечении анализаданных 6.
MS основе протеомной подготовки образца обычно включает в себя энзиматический пищеварения белковой смеси, которые могут быть достигнуты с помощью широкого спектра протоколов, таких как: в растворе пищеварения, MStern blotting7, подвеска захвата (S-ловушка)8, твердой фазы расширенной подготовки образца (SP3)9, in-StageTipпищеварения 10 и фильтрованной подготовки образца (FASP)11. Все протоколы могут быть использованы для протеомии мочевыводящих путей, даже если результаты могут варьироваться в зависимости от количества выявленных белков и пептидов и с точкизрения воспроизводимости 12.
В этой работе наше внимание было сосредоточено на анализе ЭПС-мочи протоколом ФАСП. Протокол FASP был первоначально разработан для анализа белков, извлеченных из тканей и клеточных культур, но затем его использование было расширено до анализа других типов образцов, таких какмоча 13. Что касается простого пищеварения в растворе FASP является более гибкимпротеомный подход 14, так как путем достижения эффективного удаления моющих средств и других загрязняющих веществ, таких как соли из белковой смеси до энзиматическогопищеварения 15, это позволяет выбор оптимальных условий солубилизации белка. Кроме того, еще одной характеристикой ФАСП является то, что она обеспечивает средства концентрации проб. Это представляет особый интерес для протеомного анализа мочевыводящих путей, поскольку позволяет начать с относительно больших объемов выборки (сотни микролитров). В свете потенциала протокола FASP, несколько исследований сосредоточили внимание на автоматизации рабочего процесса, с целью снижения экспериментальной изменчивости и обработки повышенного числа образцов параллельно16.
В нашем рабочем процессе за FASP следует приобретение LC-MS/MS в независимом от данных анализе (DIA), который обеспечивает высокий охват протеом, хорошую количественную точность и низкую частоту недостающих значений. Подход DIA является чувствительным методом, при котором все ионы выбираются для событий MS/MS, напротив того, что происходит в зависимом от данных анализе (DDA), где фрагментированы только ионы с наибольшей интенсивностью. Масс-спектрометр, работающий в режиме DIA, выполняет циклы сканирования с различной шириной изоляции, охватывающей весь диапазон прекурсоров m/z. Такой подход позволяет воспроизводить большое количество пептидов за единицу времени, обеспечивая протеомический снимок образца17. Кроме того, данные, генерируемые DIA имеют еще одну интересную характеристику: возможность заднего анализа18. Данные DIA являются более сложными, чем данные, полученные DDA, потому что MS / MS спектра в DIA в результате совместной изоляции нескольких ионов-прекурсоров в каждом м / z окно19. Разобщание композитных спектров MS/MS в различные и специфические пептидные сигналы достигается с помощью двух фундаментальных элементов: спектральной библиотеки и специального программного обеспечения для анализа данных. Спектральная библиотека генерируется в результате эксперимента, зависящего от данных, обычно включающего пептидную фракционирование для максимального охвата протеом, который содержит список из тысяч экспериментально определяемых ионов-прекурсоров и спектра MS/MS пептидов, обнаруживаемых в рассмотренном образце. Программное обеспечение для анализа данных, вместо этого, использует информацию, содержащуюся в спектральной библиотеке, для интерпретации данных DIA путем генерации конкретных извлеченных ионных хроматограмм, которые позволяют обнаружение пептидов и количественной оценки. В то время как анализ данных DIA без библиотек теперь осуществим, библиотечная DIA по-прежнему обеспечивает лучшие результаты с точки зрения охватаproteome 20.
Протокол подготовки образца здесь описан(рисунок 1) состоит из следующих шагов: шаг центрифугации (для удаления клеточного мусора), fasP пищеварения, Очистка StageTip21, количественная оценка белков и анализ DIA. Этот протокол был разработан для анализа ЭПС-мочи в контексте открытия биомаркера рака простаты, но он может быть применен к протеомическому анализу любого образца мочи.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

Протокол выборки с помощью фильтра (FASP) широко используется для подготовки образца протеомика, поскольку позволяет концентрировать разбавленные образцы и совместим с широким спектром моющих средств. Рабочие процессы протеомики снизу вверх, такие как FASP, все больше полагаются на методы LC-MS/MS, выполняемые в режиме независимого анализа данных (DIA), метод сканирования, который позволяет глубокое покрытие протеома и низкую частоту недостающих значений. 
В этом отчете мы предоставим подробную информацию о рабочем процессе, который сочетает в себе протокол FASP, двойной шаг очистки StageTip и LC-MS/MS в режиме DIA для отображения мочевыводящих путей. В качестве образцов мы проанализировали выраженные секреции простаты (EPS)-моча, образец, собранный после цифрового ректального экзамена (DRE), который представляет интерес в исследованиях обнаружения биомаркеров рака простаты.

Этот протокол протеомного анализа мочевыводящих путей включает в себя следующие шаги: пищеварение FASP, оценка количества белка с помощью внешней стандартной калибровки, двойная очистка StageTip (SCX и C18),и анализ LC-MS/MS в режиме DIA.
После переваривания белка, предварительные инъекции выполняются после StageTip SCX очистки полученных пептидов. Необработанные файлы LC-MS/MS обрабатываются для получения количества идентифицированных пептидов, количества идентифицированных белков и площади обнаруженных пептидов. Общая площадь, полученная путем подведения итогов всех выявленных пептидов, используется для оценки содержания белка с помощью интерполяции по внешнему стандарту: дайджест белка HeLa, вводимый в пяти различных количествах (2, 5, 15, 50, 150 нг соответственно). Количество белка для шести образцов, проанализированных в этом исследовании, варьировалось от образца к образцу, показывая среднее значение 78 нг/йл.
После оценки белка, 2 мкг переваренных белков из каждого образца очищаются последовательными SCX и C18 StageTip до анализа DIA. Спектральная библиотека для поиска данных DIA создается после обратной фракционации с высокой рН и анализа DDA LC-MS/MS репрезентативной выборки (например, пула образцов). Используя описанные выше параметры, мы определили и количественно определили в совокупности 2387 белковых групп в шести рассмотренных образцах ЭПС-мочи(Дополнительная таблица 1 и рисунок 4).
Для того, чтобы оценить с качественной точки зрения актуальность списка выявленных и количественных белков, полученную матрицу сравнили со списком из 624 белков, ранее выявленных в direct- EPS22, образце, собранном в более инвазивной процедуре, которая оказалась источником интересных биомаркеров рака предстательной железы. В общей сложности 508 из 624 белков были успешно обнаружены нашим протоколом FASP/DIA по EPS-моче.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> Рисунок 1: Протеомный рабочий процесс. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> Рисунок 2: Представление нашего экспериментального дизайна для количественной оценки белка на основе внешнего стандарта (HeLa дайджест). Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> Рисунок 3: Ключевые этапы анализа DIA: i) разработка спектральной библиотеки с помощью высокой рН обратной фазы фракционации и анализа DDA, ii) анализа выборки с использованием подхода DIA, (iii) анализа данных Спектронавтом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> Рисунок 4: Рейтинговый участок для обнаруженных EPS-мочевых белков. Несколько выбранных хитов помечены. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительная таблица 1: Репрезентативная таблица количественных белков в шести образцах ЭПС-мочи в Спектронавте. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Здесь мы представляем оптимизированный протокол пищеварения на фильтре с подробной информацией о следующем: переваривание белка, пептидная очистка и независимый анализ приобретения данных. Эта стратегия применяется к анализу выраженных секреций простаты-мочи и позволяет высокий охват протеом и низкое отсутствующей стоимости этикетки свободного профилирования мочевыводящих протеом.

Протеомный профиль EPS-Urine через FASP пищеварение и независимый анализ данных

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

Протокол FASP представляет 17000 подход к протеомии мочевыводящих путей из-за его совместимости с сильно денатурированными буферами и из-за его способности сконцентрировать образец на фильтре, который имеет решающее значение для разбавленных образцов белка. Протокол FASP в сочетании с данными независимого анализа масс-спектрометрии позволяет нам достичь глубокого охвата протеомом в EPS-моча, которая мочи, собранной после цифрового ректального экзамена. В настоящее время мы применяем метод, который вы собираетесь увидеть в усилиях по открытию биомаркеров на рак простаты.Процедуру покажут Лисия Престагиакомо, Паола Морелли и Катерина Габриэле. Центрифуга EPS-мочи образцов в течение двух часов после сбора в течение 10 минут при 2, 100 RCF при комнатной температуре. Затем храните супернатанты при температуре минус 80 градусов по Цельсию до их использования.Бросьте образцы на лед, или при четырех градусах. Чтобы ускорить процедуру, можно перенести образцы с минус 80 до минус 20 за день до пищеварения. В качестве фондовых решений, вам понадобится 500 миллимоляров DTT, 10%SDS, один буфер molar Tris при рН восемь.Разбавить 500 микролитров каждого образца ЭПС-мочи 67 микролитров SDS, 67 микролитров DTT и 33 микролитров буфера Tris. Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут с нежной тряской. Соберите центробежный фильтр с отрезанным молекулярным весом 10 000 Далтонов.Затем добавьте в фильтр 300 микролитров разбавленного образца ЭПС-мочи. Центрифуга при 14 000 г в течение примерно 20 минут. Вы можете временно прервать процедуру примерно через 15 минут, чтобы проверить, идет ли фильтрация гладко.Продолжайте до тех пор, пока все решение не будет пройдено через фильтр. Затем добавьте 200 микролитров буфера мочевины и центрифуги при 14 000 г в течение 15 минут. Повторите этот шаг во второй раз.Когда поток через вот-вот коснется фильтра, опорожните коллекцию Eppendorf путем трубопроводов из потока через. Белки безопасны на фильтре. Для алкиляции цистеин, подготовить раствор иодоацетамида непосредственно перед использованием.Взвесите около 10 миллиграммов иодоацетамида в ряде флаконов Эппендорфа и растворите его в буфере мочевины при концентрации 9,25 миллиграмма на мл, или в терминах моларности, 50 миллимоляров. Добавьте 50 микролитров раствора иодоацетамида к каждому фильтру и центрифуге при 6000 г в течение 25 минут. Более низкая скорость центрифугации позволит фильтрам не иссякнуть.После алкиляции белка промойте фильтры двумя последовательными 200 микролитерными алицитами буфера мочевины и центрифуги при 14 000 г в течение 20 минут. Отбросьте поток через. Добавьте 200 микролитров 50 миллимоляров три этилового аммония бикарбоната буфера и центрифуги на 14000 г в течение 20 минут.Повторите этот шаг. После полного завершения последней стирки бикарбоната, перенесите блок фильтра в новую трубку сбора. Затем добавьте 60 микролитров буфера 50 миллимолярной TEAB.Добавьте один микролитер трипсинового раствора при концентрации 200 нанограмм на микролитер трипсина. Кроме того, вы можете подготовить буфер пищеварения для всех образцов в флаконе Eppendorf и распределить 61 микролитров буфера пищеварения для каждого фильтра. Если вы используете ThermoMixer, чтобы избежать испарения образца во время ночной инкубации, оберните каждый фильтр единицы с слоем алюминиевой фольги, а затем слой парафильма.Инкубировать образцы при 37 градусах за ночь. На следующее утро перенесите фильтры на скамейку верхней центрифуги для очень короткого спина. После вращения откройте крышки Эппендорфа и добавьте 140 микролитров воды.Центрифуга флаконов на 14000 г в течение 25 минут, для того, чтобы собрать пептиды. Собранный объем должен быть около 190 микролитров. Для того, чтобы удалить следы SDS из дайджеста, сильная очистка обмена катиоцией пептидов до LC-MS-MS рекомендуется.Подготовьте держатели микроколумна, пронзая крышки Eppendorf острым инструментом, как пинцет или ножницы. Держатель будет вмещать микроколумна во время центрифугации. Так как они утомительно готовить, держатели могут быть использованы несколько раз.Используя тупой и иглы, удалить налет соответствующего диска извлечения. Диски извлечения – это мягкие полимерные материалы, содержащие сорбентные частицы. В этом случае сорбент состоит из частиц с сильными свойствами обмена катицией.Разместите налет в 200 микролитровый наконечник пипетки. Использование поршня нажмите вилку к концу кончика. Маленький диск следует толкать твердо, но избегая чрезмерной прочности.Вставьте наконечник в держатель и соберите спин микроколумен с помощью двух миллилитров Эппендорф флакон, из которого оригинальная крышка была удалена. Вилка из иглы калибра 16 будет иметь грузоподъемность около пяти микрограммов пептидов. Состояние микроколумна с двумя последовательными моет.Соответствующая скорость будет зависеть от того, насколько сильно вы толкаете диск в кончик пипетки. Цель достижения текти в порядке от 20 до 30 микролитров в минуту. Старайтесь не сушить кончик во время стирки и во время загрузки образца.Разбавить образец пять раз в мытье раствор два и загрузить результаты в растворе на более медленной скорости. Цель для потока около 15 до 20 микролитров в минуту. При необходимости отбросьте поток через него.Смойте остаточные моющие средства. Затем дайте диску высохнуть перед пептидной элюционией. Перенесите микроколумн в чистую трубку 1.5 Eppendorf и немедленно добавьте элюент.Который будет семь микролитров 500 миллимолярный ацетат раствор ацетата аммония, содержащий 20%ацетонитрил. Разбавить элуат 27 микролитров 0,1% формовой кислоты, чтобы снизить процент органического растворителя, а затем ввести два микролитров в результате решения в LC-MS-MS с обнаружением в режиме зависимости от данных. Подробная информация о настройке LC-MS, используемая в этом протоколе, будет предоставлена позже в видео.После выполнения поиска базы данных и интеграции пептидных ошибок вычислите общую область пика. Затем сравните его с внешней стандартной кривой для оценки концентрации пептида в дайджесте FASP. После оценки количества пептида очистите новый алицита дайджеста FASP, соответствующего двум микрограммам пептидов, двумя последовательными очистителями StageTip, описанными здесь.Установка LC-MS, используемая в этом протоколе, основана на прямом впрыске в аналитическую колонку. Если вы используете систему с столбец захвата, вы можете избежать шага автономной очистки C18. Не забудьте использовать специальные иглы и поршни для каждого хроматографического материала.После eluting пептиды из C18 Этап Совет с 10 микролитров элюента, частично испаряются элуат в вакуумной центрифуге в течение нескольких минут, стараясь избежать полного испарения. Затем добавьте 47 микролитров 0,1% кремовой кислоты и поместите полученный раствор в флакон HPLC для анализа LC-MS. Используемая здесь система основана на прямой загрузке образца столбца без использования столбца захвата.Аналитические колонки в доме сделаны, потянув 75 микрометровый идентификатор капилляра после удаления кусок полиамидного покрытия. Полученный наконечник можно аккуратно формировать керамическим резаком. Капилляр помещается в упаковочную бомбу и упаковывается с 50 миллиграмм на мл изопропанола суспензии C18 три микрометров стационарных частиц фазы.Необходимо давление газа от 10 до 20 слитков азота или гелия. Можно использовать альтернативные или коммерческие колонки хроматографии, работающие на субминере в минуту. Соберите столбец на T-кусок.Два других конца соединены с высоковольтным источником питания и петлей HPLC. Оцените оптимальное напряжение брызг, запуская систему при изократическом потоке. Затем начните анализ.Разделив пептиды в течение двух часов хроматографического градиента, как показано на основе. Получение данных будет состоять из быстрого полного сканирования службы MS с последующим 26 MS-MS сканирование на окнах-предшественниках переменной ширины. Начиная с ширины 20 м/з, для первых 20 окон, которые будут охватывать м / з диапазоне от 350 до 750 Томпсон.Затем переход на ширину 50 м/з для следующих пяти окон и заканчивая одним сканированием MS-MS, имеющих ширину изоляции 200 Томпсон. Более узкие ширины составляют более населенную область спектра с точки зрения наличия прекурсоров пептида. Для анализа DIA вам понадобится спектральная библиотека.Для создания спектральной библиотеки можно провести несколько экспериментов, зависящих от данных, на той же системе LC-MS-MS, которую вы использовали для приобретения DIA, используя тот же градиент хроматографии. Фракция выборки увеличит охват протеомомами. Советы по этапу могут быть использованы для фракционования образцов.Сильный обмен катицией и базовая обратная фаза являются двумя действительными альтернативами. Начните с 10 микрограммов пула из нескольких дайджестов FASP. Подкисляйте образец, используя 0,2%TFA конечной концентрации.Загрузите пептиды на высокой емкости C18 Этап Советы. Используйте несколько дисков в случае высоких пептидных количеств. Для 10 микрограммов материала рекомендуется два диска.Выполните очистку C18, как описано ранее. Приготовьте несколько флаконов для коллекции eluate. Столько же, сколько и количество фракций.В этом случае 10 фракций производятся пошаговому элюции. После последней стирки добавьте 20 микролитров первого элюента. 0,2%аммоний гидроксид, 10 миллимолярия TEAB, 4%ацетонитрил.После полного eluting первой фракции в первом Eppendorf, переместить этап Совет к следующей коллекции флакон. Разбавить в 20 шагов микролитера, используя в качестве элюента, 0,2% гидроксида аммония, 10 миллимолярный TEAB, а затем увеличивая количество ацетонитрила. После фракционирование выборки и работать данные зависимых экспериментов на каждой фракции, генерировать спектральной библиотеки путем поиска базы данных MS-MS данных.Библиотека будет затем импортироваться в программное обеспечение, способное анализа данных DIA для количественной оценки белка на основе как минимум одного уникального пептида, назначенного минимум тремя переходами. Ожидайте, чтобы покрыть широкий спектр мочевыводящих протеом. Эта цифра показывает идентификацию и количественную оценку белков в диапазоне изобилия, охватывающих пять порядков величины.Представленный здесь рабочий процесс сочетает в себе преимущество концентрации и универсальность протокола FASP с чувствительностью режима сканирования DIA. Эта комбинация обеспечивает богатую карту мочевыводящих протеом. Поскольку наша настройка анализа не включает в себя использование столбца захвата, дайджест FASP был очищен как сильным обменом катиоций, так и обратными фазами Stage Tips.Обратный этап Этап Советы шаг может быть опущен, когда захват столбец подключен непосредственно к аналитической колонке. Использование этого рабочего процесса рекомендуется для анализа образцов ЭПС-мочи, но его использование может быть распространено на протеомику мочевыводящих путей в целом.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Сплит BioID — Протеомного анализа контекстно зависимых белковых комплексов в их родной среде сотовой

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Динамический протеомных и Мирна анализ Polysomes от изолированных мыши сердца после Langendorff перфузии

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Протеомного анализа человека макрофагов поляризации в среде с низким содержанием кислорода

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Определение функциональных белков регионов путем строительства химерных белка

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...