Name: proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 till MG) och av POR Calabria FESR 2014-2020, åtgärd 1.2.2, "INNOPROST".

Studien godkändes av Den institutionella etiska kommittén vid Magna Graecia University of Catanzaro, RP 41/2018. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter som var inskrivna i studien.
1. Provberedning
<ol><li>Centrifugera EPS-urinprover inom 2 timmar efter insamling vid 2 100 x g i 10 minuter vid rumstemperatur (RT). Förvara supernaten vid -80 °C tills den används.</li>
</ol>2. Prov upptining
<ol><li>Överför provet från -80 °C till -20 °C dagen före matsmältningen.</li>
	<li>Före provbehandlingen överför du provet i 15–20 minuter vid 4 °C och sedan vid RT.</li>
</ol>3. Reagens förberedelse för FASP
<ol><li>På samma dag, förbered följande lösningar: ureabuffert, 50 mM jodjodamid (IAA) i ureabuffert, 50 mM triethylammoniumbikarbonat och 500 mM dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>Förbered ureabuffert (urea 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): för 10 ml, väg 4 800 mg urea och lös upp den i lämplig mängd HPLC-vatten efter tillsats av 1 ml 1 M Tris pH 8. En volym på 800 μL urea behövs för varje prov.</li>
	<li>Förbered 500 mM dithiothreitol (DTT): lös upp 38,5 mg DTT i 500 μL HPLC-vatten. För varje prov behövs 66,7 μL DTT.</li>
	<li>Bered 50 mM IAA i Urea Buffer: lös upp 9, 25 mg IAA i 1 ml ureabuffert. För varje prov behövs 50 μL IAA.</li>
	<li>Förbered 50 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB). Tillsätt 150 μL 1 M TEAB till 2,85 ml HPLC-vatten. För varje prov behövs 460 μL TEAB.</li>
	<li>Förbered en lösning av trypsin (100 ng/μL) i HPLC-vatten. Denna lösning kan förvaras vid -80 °C och tinas omedelbart före användning. För varje prov behövs 2 μL (200 ng).</li>
</ol>4. Protein matsmältning av FASP
<ol><li>Späd 500 μL av varje EPS-urinprov med 66,7 μL 10 % (w/v) natriumddecylsulfat (SDS), 66,7 μL 500 mM DTT och 33,3 μL 1 M Tris pH 8 för att lösliga proteiner och minska disulfidbindningarna. Inkubera 10 minuter vid 95 °C med skonsam skakning.</li>
	<li>Tillsätt 300 μL utspädd EPS-urinprov på filterenheten (10 kDa) och centrifugera vid 14 000 x g i 20 minuter.</li>
	<li>Tillsätt 200 μL ureabuffert till filtret och centrifug vid 14 000 x g i 15 minuter. Upprepa det här steget och ignorera sedan genomflödet.</li>
	<li>Tillsätt 50 μL IAA-lösning och centrifugera vid 6 000 x g i 25 minuter.</li>
	<li>Tillsätt 200 μL ureabuffert och centrifugera vid 14 000 x g i 20 minuter. Upprepa det här steget och ignorera sedan genomflödet.</li>
	<li>Tillsätt 200 μL 50 mM triethylammoniumbikarbonatbuffert (TEAB) och centrifugera vid 14 000 x g i 20 minuter. Upprepa det här steget.</li>
	<li>Överför filterenheten till ett nytt uppsamlingsrör.</li>
	<li>Tillsätt 60 μL 50 mM TEAB-buffert och 200 ng trypsin och inkubera provet i en termoblandare vid 37 °C över natten. OBS: För att undvika provavdunstning under inkubation över natten, linda varje filterenhet med ett lager aluminiumfolie och sedan ett lager parafilm.</li>
	<li>Efter trypsininkubation, tillsätt 140 μL vatten och centrifugera injektionsflaskan vid 14 000 x g i 25 minuter för att samla in volymen av smälta (180-200 μL).</li>
</ol>5. Reagensberedning för SCX-rening
<ol><li>Bered 1 ml tvätt 1 (0,5% myrsyra (FA) och 20% acetonitril (ACN)) enligt följande: tillsätt 50 μL 10% FA och 200 μL 100% ACN till 750 μL HLPC-vatten. För varje prov behövs 100 μL tvätt 1.</li>
	<li>Förbered 1,5 ml tvätt 2 (0,5% FA och 80% ACN) enligt följande: tillsätt 75 μL 10 % FA och 1,2 ml 100 % ACN till 225 μL HPLC-vatten. För varje prov behövs 190 μL tvätt 2.</li>
	<li>Bered 100 μL elutlösning (500 mM ammoniumacetat (AA) och 20% ACN): tillsätt 25 μL 2 M AA och 20 μL 100% ACN till 55 μL HPLC-vatten.</li>
	<li>Förbered scentips enligt följande.<ol>
<li>Packa en 200 μL pipettspets med ett lager SCX-harts med en trubbig sprutnål (spår 16). Sätt in StageTip i ett mikrocentrifuglock som tidigare har genomborrats för att rymma mikrokolet.</li>
		<li>Montera locket på en 2 ml mikrocentrifug från vilken originallocket togs bort. Mikro-SPE-centrifugalanordningen som just monterats ska passa in i en centrifuge på bänkskivan. Eftersom perforerade lock är tråkiga att förbereda, kan de användas flera gånger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. SCX rening
<ol><li>Späd 30 μL av varje prov till 120 μL med tvätt 2.</li>
	<li>Konditionera StageTip genom att tillsätta 50 μL tvätt 1 ovanpå extraktionshartset och centrifugera vid 400 x g i 2 minuter. Eftersom flödesmotståndet beror på hur starkt extraktionshartset packades in i pipettspetsen kan centrifugeringshastigheten behöva justeras för att erhålla en flödeshastighet på 20-30 μL/min. Försök att inte lämna spetsen torr under provbelastning och tvättning.</li>
	<li>Jämställ StageTip med 50 μL tvätt 2 och centrifugera vid 400 x g i 2 minuter.</li>
	<li>Ladda det utspädda provet (120 μL) med en lägre spinnhastighet.</li>
	<li>Tvätta StageTip med 50 μL tvätt 2 och centrifugera vid 400 x g i 2 minuter. Upprepa med 50 μL tvätt 1. OBS: Efter denna tvätt måste hartset vara helt torrt.</li>
	<li>Elutepeptidblandning med 7 μL eluatlösning (500 mM ammoniumacetat (AA) och 20% acn) använder långsamt en lägre spinnhastighet.</li>
	<li>Tillsätt 27 μL 0,1 % FA för att späda ut AA och för att få ett prov för LC-MS/MS preliminär injektion. Den slutliga utspädningen till 34 μL resulterar i ett volymetriskt förhållande på 1:1 mellan urin- och peptidlösning (1 μL renat röt motsvarar 1 μL original urinprov).</li>
</ol>7. Proteink kvantifiering enligt extern standard med hjälp av DDA-analys(figur 2)
<ol><li>Bestäm proteinmängden i proverna genom att injicera 2 μL av den resulterande peptidsmältningen i LC-MS/MS och interpolera det resulterande totala peptidområdet med en kalibreringskurva byggd enligt följande:</li>
	<li>Förbered fem olika HeLa-rötlösningar (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) med hjälp av ett HeLa-stam (100 μg/μL).</li>
	<li>Injicera varje Hela-lösning i duplikat (2 μL).</li>
	<li>Ställ in LC-MS/MS-metoden.<ol>
<li>Injicera 2 μL av de fem HeLa-peptidblandningarna och separera peptider genom en linjär lutning på 75 minuter med en flödeshastighet på 230 nL/minut på en 15 cm, 75 μm d kolonn packad med 3 μm C18 kiseldioxidpartiklar. Använd en binär gradient som består av mobil fas A (0,1% FA, 2% ACN) och mobil fas B (0,1% FA och 80% av ACN).</li>
		<li>Utför gradient eluering genom att öka mobil fas B-innehåll från 6% till 42% på 60 minuter och från 42% till 100% på ytterligare 8 minuter. Håll i 5 minuter 100% B och flytta sedan tillbaka till 0% B på två minuter.</li>
		<li>Arbeta i DDA-läge med en topp-12-metod och ställ in MS full skanningsområde på 350-1800 m/z,upplösning 70 000, ACG-mål 1e6 och maximal injektionstid 50 ms. Ställ in massfönstret för prekursorjonisolering på 1,6 m/z, upplösning 35 000, ACG-mål 1e5, maximal injektionstid 120 ms, HCD-fragmentering vid 25 NCE (normaliserad kollisionsenergi) och dynamisk uteslutning 15 sekunder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysera råa filer med Sequest som sökmotor och HUMAN Uniprot Complete proteinsekvens som databas. I experimenten som presenterades här laddades databasen ner i mars 2016 och innehöll 42.013 sekvenser.<ol>
<li>Använd följande inställningar: MS-tolerans 15 ppm, MS/MS tolerans 0,02 Da, trypsin som enzym genom att ställa in två missade klyvningsplatser. Ställ in karbamidetylering av lysin, serin, treonin, tyrosin (+57.021) och oxidation av metioniner som dynamiska modifieringar och karbamidetylering av cysteiner (+57.021) som statiska modifieringar. Använd cut-off av falsk upptäcktshastighet (FDR) för peptider och proteinidentifiering till 0,01 och filtrera bort med perkolator.</li>
		<li>Beräkna toppområdet för alla MS1-peptidsignaler. Beräkna peptidens totala yta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injicera 2 μL peptidblandningar som erhållits från EPS-urinprover med samma LC-MS/MS-metod som används för HeLa-proverna och analysera den råa filen med samma parametrar som används för HeLa-databehandling.</li>
	<li>Beräkna total intensitet av peptidsignaler genom att summera områdesvärden för alla identifierade peptider och interpolera den externa standardkurvan. Detta kommer att ge en acceptabel uppskattning av peptidmängden som finns i EPS-urinproteinet.</li>
</ol>8. Reagens förberedelse för C18 StageTip protokoll
<ol><li>Bered 500 μL lösning A (0,1% trifluoracetisk syra (TFA), 50% ACN): tillsätt 250 μL 100% ACN och 10 μL 5% TFA till 240 μL HPLC-vatten.</li>
	<li>Bered 2 ml lösning B (0,1 % TFA): Tillsätt 40 μL 5 % TFA till 1960 μL HPLC-vatten.</li>
	<li>Förbered 100 μL elutlösning (0,1% FA, 50% ACN): tillsätt 1 μL 10% FA och 50 μL 100% ACN till 49 μL HPLC-vatten.</li>
	<li>Förbered scentips enligt tidigare beskrivna. I det här fallet används C18-extraheringsdiskar.</li>
</ol>9. SCX/C18 StageTip-protokoll
OBS: Rena EPS-urin matsmältningar genom C18 StageTip protokoll för att ta bort salter.
<ol><li>Börja från 2 μg peptider (enligt den preliminära injektionen). Späd smältlösningen 4-faldig i tvätt 2 SCX och fortsätt enligt beskrivningen ovan (i avsnittet "SCX-rening"). Eluera peptidblandningen med 7 μL eluatlösning (500 mM ammoniumacetat (AA) och 20% acn) långsamt med lägre spinnhastighet (5 μL/min flöde).</li>
	<li>Försura SCX-eluaten med 150 μL 0,1% trifluoracetikasyra (TFA) för att uppnå ett pH-kort som är lägre än 3 och en koncentration av organiskt lösningsmedel under 5%.</li>
	<li>Kondition C18 StageTip med 50 μL lösning A och centrifugering vid 400 x g i 2 minuter. Jämvikt C18 StegTip med 50 μL lösning B och centrifugera vid 400 x g i 2 minuter.</li>
	<li>Ladda provet på scenspetsen långsamt med en lägre rotationshastighet.</li>
	<li>Tvätta C18 Stegtopp med 50 μL lösning B och centrifuger.</li>
	<li>Eluera långsamt peptidblandningen med 10 μL elueringslösning med lägre spinnhastighet.</li>
	<li>Torka eluatet (10 μL) vid 30 °C i en vakuumcentrifug i 3 minuter. Tillsätt 47 μL 0,1% FA. Förväntad peptidkoncentration kommer att vara 40 ng/ μL. Analysera med LC-MS/MS i DIA-läge.</li>
</ol>10. DIA-analys (figur 3)
<ol><li>nanoLC-separation: Separera peptidblandningen med en linjär gradient på 140 minuter med en flödeshastighet på 230 nL/min på en 15 cm, 75 μm ID-kolumn packad med 3 μm C18 kiseldioxidpartiklar.<ol>
<li>Utför gradient eluering vid 230 nL / minut flöde och öka mobil fas B-innehåll från 3% till 25% på 90 minuter, sedan från 25% till 40% på 30 minuter och slutligen från 40% till 100% på 8 minuter.</li>
		<li>Efter 10 minuter vid 100% B, balansera kolonnen med mobil fas A i 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Masspektrometriska parametrar: utför DIA-analys med hjälp av en metod som använder följande skanningscykel: (i) en fullständig ms-händelse med en upplösning på 17 500 (AGC-mål 1e6, maximal insprutningstid 50 ms) följt av (ii) 20 fönster med isoleringsbredden 20 m/z, med början från m/z 350, ii) 5 fönster med isoleringsbredden 50 m/z och iv) 1 fönster vid isoleringsbredden 200 m/z, vilket avslutar skanningsområdet för DIA vid 1200 m/z. Utför DIA-skanningar vid upplösning 35 000 (AGC-mål 5e5, maximal injektionstid 120 ms och 25 NCE).</li>
</ol>11. Hög pH omvänd fas C18 fraktionering för biblioteksgenerering
OBS: Pool EPS-urin representativa prover i en mängd av högre än 10 μg för att bygga ett databeroende bibliotek för DIA-analys genom följande förfarande:
<ol><li>Försura peptidblandningen (11 μg) med 0,2% av TFA och ladda den resulterande lösningen på en C18 StageTip packad med två lager extraktionsskivor för att möjliggöra högre kapacitet. Vi uppskattade lastkapaciteten för en enda mikroskiva (från en 16 gauge spruta nål) att vara i 5-10 μg-intervallet.</li>
	<li>Skick och jämvikt stationär fas som redan beskrivits för C18 rening.</li>
	<li>Utför peptidfraktion genom stegvis eluering (n=10) från hög pH-omvänd fas C18 med hjälp av elueringslösningar som innehåller 0,2% ammoniumhydroxid, 10 mM TEAB och ökande v/v-koncentrationer av ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%).</li>
	<li>Analysera de 10 fraktionerna med samma kromatografiska parametrar för DIA-metoden. Använd masspektrometern i DDA-läge med hjälp av de inställningar som tidigare antagits för den preliminära analysen (se "Proteink kvantifiering med extern standard med hjälp av DDA-analys").</li>
</ol>12. Dataanalys
<ol><li>Generera spektralbiblioteket genom att importera proteinidentifieringsresultaten från DDA LC-MS/MS-experimenten med hög omvänd fas C18-fraktionering i en programvara som är dedikerad till DIA-analys.</li>
	<li>Ange det minsta respektive högsta antalet fragmentjoner som används för identifiering och kvantifiering till 3 respektive 6. Filtrera de erhållna resultaten med ett Q-värde på 0,01.</li>
	<li>Importera DIA-råfiler och associera samma FASTA-fil som används för att skapa spektralbiblioteket till varje rå fil.</li>
	<li>Ställ in det lägsta och högsta antalet unika peptider som används för proteink kvantifiering till 1 respektive 10.</li>
	<li>Beräkna intensiteten för varje protein genom att summera fragmentjontoppen.</li>
	<li>Generera en matris med intensiteten hos de kvantifierade proteinerna i varje prov.</li>
</ol>

<ol>
	<li>H&#252;ttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).</li><li>Roobol, M. J., Carlsson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+stratification+in+prostate+cancer+screening.">Risk stratification in prostate cancer screening.</a> Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).</li><li>Principe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prostate-enriched+proteins+by+in-depth+proteomic+analyses+of+expressed+prostatic+secretions+in+urine.">Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine.</a> Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics+identifies+liquid-biopsy+signatures+for+extracapsular+prostate+cancer.">Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer.</a> Nature Communications. 7, 1-10 (2016).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+collection+and+protein+properties+of+expressed+prostatic+secretions+as+a+source+for+biomarkers+of+prostatic+disease.">Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease.</a> Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).</li><li>Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+mass+spectrometry+based+clinical+proteomics:+Applications+to+cancer+research.">Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research.</a> Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).</li><li>Berger, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MStern+blotting-high+throughput+polyvinylidene+fluoride+(PVDF)+membrane-based+proteomic+sample+preparation+for+96-well+plates.">MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).</li><li>Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(STrap)+sample+preparation+method+for+bottom-up+proteomics+analysis.">Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis.</a> Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+Proteomics:+Evaluation+of+Different+Sample+Preparation+Workflows+for+Quantitative,+Reproducible,+and+Improved+Depth+of+Analysis.">Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+and+annotation+of+human+normal+urinary+proteome.">A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+Filter+Aided+Sample+Preparation+(FASP)+and+Multienzyme+Digestion+FASP+Protocols.">Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+sample+preparation+in+96-well+filter+plates+for+quantitative+clinical+proteomics.">Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+A+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).</li><li>Liu, Y., H&#252;ttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+protein+maps+for+biomarker+discovery+and+clinical+research.">Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).</li><li>Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+LC-MS/MS+analysis:+Implication+for+proteomics+experiments.">Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments.</a> Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).</li><li>Muntel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Urinary+Protein+Biomarker+Discovery+by+Data-Independent+Acquisition+on+a+Quadrupole-Orbitrap+Mass+Spectrometer.">Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Differentially+Expressed+Proteins+in+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions+of+Men+with+Organ-confined+Versus+Extracapsular+Prostate+Cancer.">Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).</li><li>Decramer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+in+clinical+proteomics.">Urine in clinical proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).</li><li>Thongboonkerd, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+points+in+urinary+proteomics.">Practical points in urinary proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).</li><li>Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics.">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions.">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li></ol>

Alla författare förklarar ingen intressekonflikt.

I detta arbete presenteras en strategi för att analysera EPS-urinprover. FASP-protokollet är ett idealiskt val för urinproteomik eftersom det tillåter provkoncentration före enzymatisk matsmältning. Faktum är att med hjälp av detta arbetsflöde kan flera hundratals mikroliter urin laddas på ett enda filter och bearbetas. Dessutom erbjuder matsmältningen på filtret relativ frihet i valet av denatureringsförhållanden. I vårt arbete uppnås proteindenaturering genom att späda urinprover i en buffert som innehåller Tris, SDS och DTT (slutlig koncentration: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Proteiner denatureras effektivt omedelbart efter upptining av provet, för att undvika oönskad nedbrytning genom aktiva proteaser. Det ursprungliga FASP-protokollet har förbättrats genom att öka volymen av tvättar från 100 μL till 200 μL. På detta sätt uppnås bättre avlägsnande av rester, särskilt tvättmedel från filtret.
Efter enzymatisk matsmältning, proteinuppskattning med extern standard med hjälp av en snabb LC-MS/MS, utförs databeroende metod före protokollets sista steg, som omfattar dubbelstegsrening och LC-MS/MS-analys i DIA-läge, på lika utgångsmaterial för alla prover (2 μg).
Mångsidigheten hos FASP är associerad med DIA-metoden, en känslig metod som ger ett lågt antal saknade värden17. I vårt arbete identifierades och kvantifierades 2387 proteiner, vilket möjliggör en detaljerad proteomisk profil av EPS-urin att ritas. Identifiering och kvantifiering av 2387 proteiner var möjlig genom generering av ett rikt spektralbibliotek, erhållet via hög-pH omvänd fraktionering av peptider, och med vår DIA-metod, riktad mot ett brett m / z prekursorsortiment. Detta arbetsflöde identifierade över 80% av proteiner som tidigare hittats i direkt EPS-analys, vilket visar att en betydande del av EPS-urinerad proteom faktiskt härrör från uttryckta prostatautsöndringar, vilket är en rik källa till prostatavävnadsspecifika proteiner26.
Sammanfattningsvis parar vår experimentella design fasps mångsidighet med DIA: s känslighet för att få en rik karta över urinproteomen. Denna strategi rekommenderas för att analysera EPS-urinprover, men dess användning kan utvidgas till urinproteomik i allmänhet, eller till och med till andra provtyper.

Den ständiga utvecklingen av proteomisk teknik lovar att ha en betydande inverkan på att hjälpa sjukdomsdiagnostik och förutsägelse av svar på behandling genom att tillhandahålla högupplösta kartor över viktiga molekylära effektorer som finns i en mängd olika prover som vävnader och biofluider. Ur analytisk synvinkel erbjuder urin flera fördelar som enkel insamling och stor stabilitet hos proteomen med avseende på andra biofluider1. Proteomisk analys av urin är av särskilt intresse för biomarkörupptäcktsstudier på urologiska cancerformer, eftersom det möjliggör icke-invasiv provtagning i närheten av vävnader av intresse2. I synnerhet är ett prov som verkar lovande för att studera prostatarelaterade patologier EPS-urin3,4 (dvs. ett urinprov som samlats in efter en digital rektalundersökning (DRE)). Denna senare operation före provtagning berikar urin med prostataspecifika proteiner. EPS-urin är en bra kandidat för att undersöka störningar relaterade till prostatakörteln5 inklusive prostatacancer (PCa), eftersom proteiner som utsöndras av tumören genom DRE kan hällas i urinprovet, vilket ökar risken för att upptäcka cancervävnadsspecifika proteiner.
En avgörande roll för att möjliggöra upptäckt och kvantifiering av potentiella proteinbiomarkörer spelas av masspektrometri (MS). Under de senaste två decennierna har MS-baserade protokoll för proteomisk analys gjort det möjligt att upptäcka ett ständigt ökande antal proteiner i en enda LC-MS/MS-körning tack vare kontinuerliga förbättringar av MS-instrumentering och i dataanalysprogramvara6.
MS-baserade proteomiska provberedning innebär i allmänhet enzymatisk matsmältning av proteinblandningen, som kan uppnås via en mängd olika protokoll såsom: matsmältning i lösning, MStern blotting7,suspensionsfångst (S-fälla)8, fastfasförbättrad provberedning (SP3)9, i stegTip-matsmältning10 och filtrerad stödprovberedning (FASP)11. Alla protokoll kan användas för urinproteomik, även om resultaten kan variera med avseende på antalet identifierade proteiner och peptider och när det gäller reproducerbarhet12.
I detta arbete fokuserades vår uppmärksamhet på analys av EPS-urin genom FASP-protokollet. FASP-protokollet utformades ursprungligen för att analysera proteiner som extraherats från vävnader och cellkulturer, men dess användning utvidgades sedan till analys av andra provtyper, såsom urin13. När det gäller enkel matsmältning i lösningen FASP är en mer flexibel proteomiskstrategi 14, eftersom det genom att uppnå effektivt avlägsnande av tvättmedel och andra föroreningar som salter från proteinblandningen före enzymatisk matsmältning15, tillåter valet av optimala proteinlöslighetsförhållanden. Dessutom är en ytterligare egenskap hos FASP att den ger ett medel för provkoncentration. Detta är av särskilt intresse för urinproteomisk analys, eftersom det gör det möjligt att börja från relativt stora provvolymer (hundratals mikroliter). Mot bakgrund av FASP-protokollets potential har flera studier fokuserat uppmärksamheten på automatisering av arbetsflöden, i syfte att minska experimentell variabilitet och bearbeta ett förhöjt antal prover parallellt16.
I vårt arbetsflöde följs FASP av LC-MS/MS förvärv i dataoberoende analys (DIA), vilket ger hög proteomtäckning, god kvantitativ precision och låg incidens av saknade värden. DIA-metoden är en känslig metod där alla joner väljs för MS/MS-händelser, mittemot vad som händer i databeroende analys (DDA) där endast joner med högsta intensitet fragmenteras. Masspektrometern, som arbetar i DIA-läge, utför skanningscykler med olika isoleringsbredd som täcker hela m/z-prekursorområdet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att reproducerbart upptäcka ett stort antal peptider per enhetstid, vilket ger en proteomisk ögonblicksbild avprovet 17. Dessutom har data som genereras av DIA en annan intressant egenskap: möjligheten till en posteriorianalys 18. DIA-data är mer komplexa än de som erhålls av DDA, eftersom MS/MS-spektra i DIA är ett resultat av samtidig isolering av flera prekursorjoner inom varje m/z-fönster 19. Disentangling av den sammansatta MS/MS-spektra i distinkta och specifika peptidsignaler uppnås med hjälp av två grundläggande element: ett spektralbibliotek och en dedikerad programvara för dataanalys. Spektralbiblioteket genereras av ett databeroende experiment, vanligtvis med peptidfraktionering för att maximera proteomtäckningen, som ger en lista över tusentals experimentellt bestämda prekursorjoner och MS/ MS-spektra av peptider som kan upptäckas i det övervägande provet. Dataanalysprogramvaran använder istället informationen i spektralbiblioteket för att tolka DIA-data genom att generera specifika extraherade jonkromatogram som möjliggör peptiddetektering och kvantifiering. Även om biblioteksfri DIA-dataanalys nu är genomförbar, ger biblioteksbaserad DIA fortfarande bättre resultat när det gäller proteomtäckning20.
Provberedningsprotokollet här beskrivet (Figur 1) består av följande steg: ett centrifugeringssteg (för att avlägsna cellskräp), FASP-matsmältning, StageTip-rening21,kvantifiering av proteiner och DIA-analys. Detta protokoll har utformats för analys av EPS-urin i samband med upptäckt av prostatacancerbiomarkör, men det kan tillämpas på proteomisk analys av alla urinprov.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

Filterstödda provprotokoll (FASP) används ofta för proteomikprovberedning eftersom det gör det möjligt att koncentrera utspädda prover och det är kompatibelt med en mängd olika tvättmedel. Nedifrån och upp-proteomikarbetsflöden som FASP förlitar sig i allt högre grad på LC-MS/MS-metoder som utförs i dataoberoende analysläge (DIA), en skanningsmetod som möjliggör djup proteomtäckning och låg incidens av saknade värden. 
I den här rapporten kommer vi att tillhandahålla information om ett arbetsflöde som kombinerar ett FASP-protokoll, ett dubbelt Stegtips reningssteg och LC-MS/MS i DIA-läge för kartläggning av urinproteom. Som ett modellprov analyserade vi uttryckt prostatautsöndringar (EPS)-urin, ett prov som samlats in efter en digital rektalundersökning (DRE), som är av intresse för upptäcktsstudier av prostatacancerbiomarkör.

Detta protokoll för urinproteomisk analys innehåller följande steg: FASP-matsmältning, uppskattning av proteinmängd via extern standardkalibrering, dubbel stegtip-rening (SCX och C18)och LC-MS/MS-analys i DIA-läge.
Efter protein matsmältningen utförs preliminära injektioner efter StageTip SCX rening av de resulterande peptiderna. LC-MS/MS råa filer behandlas för att erhålla antalet identifierade peptider, antalet identifierade proteiner och området för upptäckta peptider. Den totala arealan som erhålls genom att summera alla identifierade peptider används för att uppskatta proteininnehållet via interpolation till en extern standard: en HeLa-proteinsammanfattning injicerad i fem olika mängder (2, 5, 15, 50, 150 ng). Proteinmängden för de sex prover som analyserades i denna studie varierade från prov till prov, vilket visade ett genomsnittligt värde på 78 ng/μL.
Efter proteinuppskattning renas 2 μg smält proteiner från varje prov genom sekventiell SCX och C18 StageTip före DIA-analys. Spektralbiblioteket för sökning av DIA-data skapas efter fraktionering med hög pH-omvänd fas och LC-MS/MS-analys av ett representativt urval (t.ex. en exempelpool). Med hjälp av de parametrar som beskrivs ovan har vi identifierat och kvantifierat kumulativt 2387 proteingrupper i de sex EPS-urinprov som övervägs (kompletterande tabell 1 och figur 4).
För att ur kvalitativ synvinkel utvärdera relevansen av förteckningen över identifierade och kvantifierade proteiner jämfördes den erhållna matrisen med en lista över 624 proteiner som tidigare identifierats i direkt- EPS22, ett prov som samlats in i ett mer invasivt förfarande, vilket har visat sig vara en källa till intressanta kandidat prostatacancer biomarkörer. Totalt upptäcktes 508 av 624 proteiner framgångsrikt av vårt FASP/DIA-protokoll om EPS-urin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> Bild 1: Proteomiskt arbetsflöde. Klicka här för att se en större version av den här <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> Bild 2: Representation av vår experimentella design för proteink kvantifiering baserat på extern standard (HeLa digest). Klicka här för att se en större version av denna <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> Figur 3: Viktiga steg iDIA-analysen: i) utarbetande av spektralbiblioteket genom fraktionering med hög pH-omvänd fas och analys av utvecklingsagendan från Doha, ii) provanalys med hjälp av DIA-metoden, iii) dataanalys av Spektronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> Figur 4: Rangordnad tomt för det upptäckta EPS-urinproteinerna. Några utvalda träffar är märkta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande tabell 1: Representativ tabell över kvantifierade proteiner i sex EPS-urinprover i Spektronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis at JoVE.com

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Här presenterar vi ett optimerat matsmältningsprotokoll på filter med detaljerad information om följande: proteinsammanfattning, peptidrening och dataoberoende förvärvsanalys. Denna strategi tillämpas på analys av uttryckt prostata sekret-urin prover och tillåter hög proteome täckning och lågt saknade värde etikett-fri profilering av urinary proteome.

Proteomisk profil av EPS-urin genom FASP-matsmältning och dataoberoende analys

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

FASP-protokollet är ett intressant tillvägagångssätt för din urinproteomik på grund av dess kompatibilitet med starkt denaturerande buffertar och på grund av dess förmåga att koncentrera provet på filtret, vilket är avgörande för ett utspädt proteinprover. FASP-protokollet i kombination med dataoberoende analys av masspektrometri gör det möjligt för oss att uppnå djup proteomtäckning i EPS-urin, som urin samlas in efter digital rektalundersökning. Vi tillämpar för närvarande den metod du ska se i en biomarkörupptäcktsinsats mot prostatacancer.Ingreppet kommer att visas av Licia Prestagiacomo, Paola Morelli och Caterina Gabriele. Centrifuge EPS-urinprover inom två timmar efter uppsamling i 10 minuter vid 2 100 RCF vid rumstemperatur. Förvara sedan supernatanterna på minus 80 grader celsius tills de används.Kasta proverna på is, eller vid fyra grader. För att påskynda proceduren kan du överföra proverna från minus 80 till minus 20 dagen före matsmältningen. Som lagerlösningar behöver du 500 millimolar DTT, 10%SDS, en molar Tris buffert vid pH åtta.Späd ut 500 mikroliter av varje EPS-urinprov med 67 mikroliter SDS, 67 mikroliter DTT och 33 mikroliter Tris-buffert. Inkubera vid 95 grader celsius i 10 minuter med mild skakning. Montera centrifugalfilterenheten med en 10 000 Dalton molekylvikt avskuren.Tillsätt sedan 300 mikroliter utspädd EPS-urinprov till filtret. Centrifugera vid 14 000 g i cirka 20 minuter. Du kan tillfälligt avbryta proceduren efter 15 minuter eller så för att kontrollera om filtreringen fortskrider smidigt.Fortsätt tills hela lösningen har passerat genom filtret. Tillsätt sedan 200 mikroliter ureabuffert och centrifuger vid 14 000 g i 15 minuter. Upprepa det här steget en andra gång.När genomflödet är på väg att röra filtret, töm samlingen Eppendorf genom att pipetting ut genomflödet. Proteiner är säkra på filtret. För cysteinalkylering, förbered en jodacetamidlösning omedelbart före användning.Väg ca 10 milligram jodacetamid i ett antal Eppendorf injektionsflaska och lös upp den i ureabuffert vid en koncentration av 9,25 milligram per ml, eller i molaritetstermer, 50 millimolar. Tillsätt 50 mikroliter jodacetamidlösning till varje filter och centrifugera vid 6 000 g i 25 minuter. Den lägre centrifugeringshastigheten gör att filtren inte kan torka.Efter proteinalkylering, tvätta filtren med två på varandra följande 200 mikroliter alikvoter av ureabuffert och centrifugering vid 14 000 g i 20 minuter. Kassera genomflödet. Tillsätt 200 mikroliter på 50 millimolar tre etyl ammoniumbikarbonatbuffert och centrifugera vid 14 000 g i 20 minuter.Upprepa det här steget. När du är klar med den sista bikarbonattvätten överför du filterenheten till ett nytt uppsamlingsrör. Tillsätt sedan 60 mikroliter på 50 millimolar TEAB-buffert.Tillsätt en mikroliter trypsinlösning vid en koncentration av 200 nanogram per mikroliter trypsin. Alternativt kan du förbereda rötningsbufferten för alla prover i en Eppendorf-flaska och distribuera 61 mikroliter av rötningsbufferten till varje filter. Om du använder en ThermoMixer för att undvika provavdunstning under inkubation över natten, linda in varje filterenhet med ett lager aluminiumfolie och sedan ett lager parafilm.Inkubera proverna vid 37 grader över natten. Följande morgon överför du filtren till en bänktoppens centrifuge för en mycket kort snurr. Efter spinning, öppna Eppendorf lock och tillsätt 140 mikroliter vatten.Centrifugera injektionsflaskan vid 14 000 g i 25 minuter för att samla in peptiderna. Den insamlade volymen ska vara cirka 190 mikroliter. För att ta bort spår av SDS från rötningen rekommenderas stark katjonutbytesrening av peptiderna före LC-MS-MS.Förbered mikrokollumnhållarna genom att genomborra Eppendorf-locken med ett vasst verktyg som ett par pincett eller saxar. Hållaren rymmer mikrokolet under centrifugeringen. Eftersom de är tråkiga att förbereda kan innehavare användas flera gånger.Använd en trubbig och en nål, ta bort en plack av lämplig extraktionsskiva. Extraktionsskivor är mjuka polymera material som innehåller sorbenta partiklar. I detta fall är sorbenten gjord av partiklar med starka katjonutbytesegenskaper.Placera plack i en 200 mikroliter pipettspets. Tryck kontakten mot spetsens ände med hjälp av en kolv. Den lilla skivan ska skjutas hårt, men undvika överdriven styrka.Sätt in spetsen i hållaren och montera spinnmikrokolen med en två milliliter Eppendorfflaska från vilken originallocket togs bort. Kontakten från en mätare 16 nål kommer att ha en lastkapacitet på cirka fem mikrogram peptider. Kondition mikrokolet med två på varandra följande tvättar.Lämplig hastighet beror på hur starkt du trycker in skivan i pipettspetsen. Sikta på att uppnå ett flöde i storleksordningen 20 till 30 mikroliter per minut. Försök att inte få spetsen torr under tvätt och under provbelastning.Späd provet fem gånger i tvättlösning två och ladda resultatet i lösning med långsammare hastighet. Sikta på ett flöde på ca 15 till 20 mikroliter per minut. Om det behövs, kassera genomflödet.Tvätta bort resttvättmedel. Låt sedan skivan torka innan peptid eluering. Överför mikrokolet till ett rent 1,5 Eppendorf-rör och tillsätt omedelbart eluenten.Vilket blir sju mikroliter av en 500 millimolar ammoniumacetatlösning som innehåller 20% acetonitril. Späd eluatet med 27 mikroliter 0,1% myrsyra för att sänka andelen organiskt lösningsmedel och injicera sedan två mikroliter av den resulterande lösningen i LC-MS-MS med detektion i databeroende läge. Mer information om LC-MS-installationen som används i det här protokollet kommer att ges senare i videon.När du har utfört databassökning och peptidfelintegration, beräkna det totala toppområdet. Jämför sedan med en extern standardkurva för att uppskatta peptidkoncentrationen i FASP-matsmältningen. Efter att ha skattat peptidmängden, rena en ny alikvot av FASP-smältning motsvarande två mikrogram peptider med två på varandra följande StageTip-reningar som beskrivs här.LC-MS-inställningen som används i detta protokoll baseras på direkt injektion i analyskolonnen. Om du använder ett system med en svällningskolumn kan du undvika steget offline-C18-rening. Kom ihåg att använda dedikerade nålar och kolvar för varje kromatografiskt material.Efter eluering av peptiderna från C18-scenspetsen med 10 mikroliter eluent, avdunsta delvis eluaten i en vakuumcentrifuge i några minuter och försök att undvika full avdunstning. Tillsätt sedan 47 mikroliter 0,1%myrsyra och placera den resulterande lösningen i en HPLC-injektionsflaska för LC-MS-analys. Systemet som används här baseras på direkt inläsning av kolumnprov utan att använda en svällningskolumn.Analytiska kolonner är interna gjorda genom att dra en 75 mikrometer ID kapillär efter att ha tagit bort en bit polyamidbeläggning. Den resulterande spetsen kan formas försiktigt med en keramisk fräs. Kapillären placeras sedan i en förpackningsbomb och packas med en 50 milligram per ml isopropanol slam av C18 tre mikrometer stationära faspartiklar.Ett gastryck på mellan 10 och 20 bar kväve eller helium behövs. Du kan använda alternativa eller kommersiella kromatografikolumner som körs med submikroliter per minut flödeshastighet. Montera kolumnen på ett T-stycke.De andra två ändarna är anslutna till högspänningsströmförsörjningen och till HPLC-slingan. Utvärdera den optimala sprutspänningen genom att köra systemet vid isokratiskt flöde. Börja sedan analysen.Separera peptiderna under en två timmar lång kromatografigradient som visas. Datainsamlingen kommer att bestå av en snabb fullständig MS-tjänstsökning följt av 26 MS-MS-skanningar på prekursorfönster med variabel bredd. Start i 20 m/z bredd, för de första 20 fönstren som ska täcka en m/z spänner från 350 till 750 Thompson.Flytta sedan till en bredd på 50 m/z för följande fem fönster och sluta med en enda MS-MS-skanning, med en isoleringsbredd på 200 Thompson. Smalare bredder står för en mer befolkad region av spektrumet när det gäller närvaro av peptidprekursorer. För DIA-analys behöver du ett spektralbibliotek.För att generera ett spektralbibliotek kan du utföra några databeroende experiment på samma LC-MS-MS-system som du har använt för DIA-förvärv med samma kromatografigradient. Provfraktion ökar proteomtäckningen. Stegtips kan användas för provfraktion.Starkt katjonutbyte och grundläggande omvänd fas är två giltiga alternativ. Börja med de 10 mikrogramna i en pool med flera FASP-sammanfattningar. Försura provet med 0,2 % TFA slutlig koncentration.Ladda peptiderna på C18-scentips med hög kapacitet. Använd flera skivor vid höga peptidmängder. För 10 mikrogram material rekommenderas två skivor.Utför C18-rening enligt beskrivningen tidigare. Förbered flera injektionsflaskar för eluatsamling. Så många som antalet bråktal.I detta fall produceras 10 fraktioner genom stegvis eluering. Efter den sista tvätten, tillsätt 20 mikroliter av den första eluenten. 0,2% ammoniumhydroxid, 10 millimolar TEAB, 4%acetonitril.Efter att helt ha eluterat den första fraktionen i den första Eppendorf, flytta scenspetsen till nästa samlingsflaska. Späd i 20 mikrolitersteg med hjälp av som eluent, 0,2% av ammoniumhydroxid, 10 millimolar TEAB och sedan ökande mängd acetonitril. När du har fraktionent av exemplet och kört databeroende experiment på varje bråkdel genererar du ditt spektralbibliotek genom databassökning av MS-MS-data.Biblioteket kommer sedan att importeras i en programvara som kan DIA-dataanalys för proteink kvantifiering baserat på minst en unik peptid som tilldelas genom minst tre övergångar. Förvänta dig att täcka ett brett utbud av urinproteome. Denna siffra visar identifiering och kvantifiering av proteiner över ett överflödsområde, som sträcker sig över fem storleksordningar.Arbetsflödet här kombinerar koncentrationsfördelen och mångsidigheten hos FASP-protokollet med känsligheten för DIA-skanningsläge. Denna kombination ger en rik karta över urinproteomen. Eftersom vår analysinställning inte inkluderar användning av en svällningskolonn, renades FASP-sammandrag av både starkt katjonutbyte och omvänd fasstegstips.Steget Stegtips för omvänd fas kan utelämnas när en svällningskolumn är ansluten direkt till analyskolumnen. Användningen av detta arbetsflöde rekommenderas för att analysera EPS-urinprover men dess användning kan utvidgas till urinproteomik i allmänhet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Använda ett omfattande Immunoprecipitation berikning System för att identifiera en endogen posttranslationella modifieringen profil för målproteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein matsmältningen, ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi att optimera isolering av Exosomes från mänsklig blodplasma och Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteomiska och miRNA analyser av Polysomes från isolerade mus hjärtat efter av Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomiska analys av mänskliga makrofag polarisering Under en låg syrehalt miljö

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extraktion och analys av taiwanesiska grön Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifiering av funktionellt Protein regioner genom chimära Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...