Name: modifications of the langendorff method for simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice
Uploaded: 2021-05-13T13:00:00
Duration: 6 min 27 s
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इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) और बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 7192051) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक योगदान: बाई और लियू ने परियोजना को डिजाइन और कल्पना की। वेन और रुआन ने प्रयोगों के लिए मूल्यवान सलाह प्रदान की। वू और लिनलिंग ली ने प्रयोगात्मक कार्य किया और डेटा अधिग्रहण, विश्लेषण और व्याख्या में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। ली ने लैंगेनडॉर्फ तंत्र में भाग लिया। पेंग, झांग, वांग और यांग ने प्रयोग से पहले अभिकर्मकों और समाधानों की तैयारी में भाग लिया। वू ने लेख लिखा था।

वयस्क पुरुष C57BL / 6 चूहों का वजन 20-30 ग्राम, 8-10 सप्ताह की उम्र के पशु केंद्र से कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी, बीजिंग, चीन से खरीदा गया था। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु संसाधन संस्थान द्वारा प्रस्तावित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा प्रकाशित किया गया था। Excel और Origin 8.5 का उपयोग डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए किया गया था। डेटा को एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए, छात्र के टी परीक्षण का उपयोग किया गया था और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
1. समाधान और परफ्यूजन उपकरण तैयारी
<ol><li>एक निरंतर प्रवाह Langendorff उपकरण (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या स्व-निर्मित) को इकट्ठा करें। चित्रा 1 एक सरल योजनाबद्ध प्रदान करता है।</li>
	<li>तालिका 1 और तालिका 2 में दिए गए अभिकर्मकों के अनुसार समाधान तैयार करें।</li>
	<li>परिसंचारी पानी के स्नान को चालू करें और यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त इनपुट तापमान (हमारी प्रयोगशाला में 42.7 डिग्री सेल्सियस) को समायोजित करें कि कैनुला से परफ्यूसेट परिसंचरण प्रणाली का बहिर्वाह 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है।</li>
	<li>विआयनीकृत पानी को परिसंचारी करके परफ्यूजन प्रणाली को साफ करें। यदि एक बाँझ स्थिति की आवश्यकता होती है, तो 15 मिनट के लिए परफ्यूजन सिस्टम के माध्यम से 75% इथेनॉल चलाएं, इसके बाद विआयनीकृत पानी (दिल पर शराब विषाक्तता प्रभाव से बचने के लिए कम से कम 10 चक्र)।</li>
	<li>परफ्यूजेट परिसंचरण प्रणाली के एक चक्र के लिए समय और मात्रा को मापने के लिए यह निर्धारित करने के लिए कि निम्नलिखित परफ्यूजन चरण में लोड किए जाने वाले ऑक्सीजनयुक्त टायरोड के समाधान के कितने मिलीलीटर हैं।</li>
	<li>वांछित विधि में सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें।</li>
	<li>परफ्यूसेट परफ्यूजन सिस्टम की प्रवाह दर को 4 एमएल / मिनट पर सेट करें।</li>
	<li>दो साफ 35 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करें- एक में टायरोड का समाधान (पेट्री डिश 1) शामिल है, दूसरा समाधान 1 (पेट्री डिश 2) युक्त है।</li>
	<li>समाधान 1 और एक 20 जी कुंद स्टील कैनुला सुई से भरा एक 1 एमएल सिरिंज तैयार करें, जहां से दूरी टिप के लिए 1 मिमी है। प्रवेशनी शाफ्ट के लिए 3-0 टांके के साथ एक ढीली गाँठ तैयार करें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के देखने के क्षेत्र को विनियमित करें और सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी टिप पेट्री डिश 2 की तरल सतह के नीचे है।</li>
</ol>2. पशु तैयारी
<ol><li>रक्त के थक्कों से बचने के लिए चूहों को इंट्रापेरिटोनियल रूप से हेपरिन (एकाग्रता, 1,000 आईयू / एमएल; 0.2 एमएल / माउस) का प्रशासन करें। 10 मिनट के बाद, सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी इंजेक्शन) के साथ चूहों को एनेस्थेटिक करें और सुनिश्चित करें कि चूहे पूंछ / पैर की अंगुली के चुटकी का जवाब देना बंद कर दें। हेपरिन प्रशासन के 20 मिनट बाद गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन करें।</li>
	<li>चूहों को सर्जिकल प्लेटफ़ॉर्म पर स्थानांतरित करें, चूहों को एक सुपाइन स्थिति में ठीक करें, 75% इथेनॉल के साथ छाती को निष्फल करें, और इसे धुंध या नैपकिन के साथ सुखाएं।</li>
</ol>3. दिल उच्छेदन और महाधमनी तोप
<ol><li>ऊतक संदंश के साथ xiphoid की त्वचा को उठाएं और ऊतक कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से एक मामूली पार्श्व चीरा बनाएं। त्वचा और प्रावरणी के बीच एक कुंद विच्छेदन करें और दोनों पक्षों पर एक्सिले की ओर वी-आकार में त्वचा के चीरे का विस्तार करें।<ol>
<li>रिब पिंजरे के माध्यम से एक ही चीरा ट्रेस जारी रखें, और फिर, दिल और फेफड़ों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए ऊतक संदंश के साथ उरोस्थि को क्लैंप करके रिब पिंजरे को ऊपर की ओर विक्षेपित करें।</li>
	</ol>
</li>
	<li>एक घुमावदार संदंश का उपयोग करके पेरिकार्डियम को छील लें। थाइमस ग्रंथि को दो घुमावदार संदंश द्वारा दोनों पक्षों की ओर फाड़ दें यदि यह महान जहाजों को कवर करता है। धीरे से घुमावदार संदंश के साथ पूंछ की ओर हृदय के आधार को खींचें जब तक कि "वाई" आकार की रक्त वाहिका (महाधमनी और इसकी शाखा धमनियों) को नहीं देखा जा सकता है।</li>
	<li>कैनुलेशन और तुलना के लिए महाधमनी की विभिन्न लंबाई को आरक्षित करने के लिए, महाधमनी को बाईं आम कैरोटिड धमनी ( चित्रा 2 में हरी रेखा) पर ट्रांसेक्ट करें और कुछ चूहों में एक ही समय में ब्रैकियोसेफलिक धमनी को काटें। अन्य चूहों में आरोही महाधमनी पर transact ( चित्र2 में काली रेखा). नोट: उन लोगों के लिए जो इस प्रक्रिया के लिए नए हैं, यह चरण स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत भी किया जा सकता है।</li>
	<li>दिल को एक्साइज करें, और तुरंत अवशिष्ट रक्त को धोने और पंप करने के लिए पेट्री डिश 1 में विसर्जित करें।</li>
	<li>पेट्री डिश 2 में दिल को स्थानांतरित करें, और यदि आवश्यक हो तो ठीक आईरिस कैंची का उपयोग करके किसी भी अधिशेष ऊतक को ट्रिम करें। उन लोगों के लिए जो इस प्रक्रिया के लिए नए हैं, महाधमनी या अन्य हृदय संरचनाओं को गलत तरीके से काटने से बचने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इस कदम को करें।</li>
	<li>महाधमनी cannulation से पहले हवा के बुलबुले निष्कासित करने के लिए सिरिंज पुश. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत दो सीधे बांधने वाले संदंश (चिकनी जबड़े) की सहायता से प्रतिगामी महाधमनी कैनुलेशन करें। सुनिश्चित करें कि पूरी कैनुलेशन प्रक्रिया तरल सतह के नीचे है।</li>
	<li>महाधमनी वाल्व में प्रवेश करने से बचें और आरोही महाधमनी (माउस है कि महाधमनी बाएं आम कैरोटिड धमनी पर transacted था) और महाधमनी जड़ (माउस है कि महाधमनी आरोही महाधमनी पर transacted किया गया था), क्रमशः करने के लिए गहराई को समायोजित करने से बचें। नोट: महाधमनी cannulation की गहराई (बस गहराई के रूप में के रूप में संदर्भित) यहाँ स्थिति जहां cannula टिप महाधमनी में है या जहां महाधमनी ligated है के रूप में परिभाषित किया गया है.</li>
	<li>पूर्व गाँठ 3-0 सीवन के साथ महाधमनी ligate प्रवेशनी पायदान के लिए. अवशिष्ट रक्त को कुल्ला करने के लिए सिरिंज सामग्री को धीरे से दबाएं। नोट: रक्त कोरोनरी धमनियों को छोड़ देगा और पृष्ठीय नसों से बहाव करेगा यदि गहराई ठीक से स्थित है। दिल और अलिंद उपांगों का विस्तार होगा और पीला हो जाएगा।</li>
	<li>निकालें और Langendorff उपकरण के लिए cannula कनेक्ट. एक बार फिर, दिल में प्रवेश करने वाले किसी भी हवा के बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखें। नोट: ध्यान रखें कि थोराकोटॉमी से प्रारंभिक परफ्यूजन तक का समय 5 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए।</li>
</ol>4. दिल परफ्यूजन
<ol><li>सबसे पहले, लगभग 10 s के लिए प्राइम और परफ्यूज ऑक्सीजनयुक्त टायरोड का समाधान (इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सिस्टम में 10 s चलने वाले तरल की मात्रा लगभग 0.7 मिलीलीटर है) यदि एट्रिया में अवशिष्ट रक्त है, और फिर समाधान 1 पर स्विच करें। हालांकि, बस समाधान 1 के साथ perfuse यदि वहाँ atria में कोई अवशिष्ट रक्त है. लगभग 2 मिनट के लिए दिल को परफ्यूज करें।</li>
	<li>समाधान 3 पर स्विच करें. एक एकल-उपयोग बाँझ पॉलीथीन पिपेट के साथ समाधान 3 के बारे में 2.5 मिलीलीटर चूसें और बाद में उपयोग के लिए पानी के स्नान में इसे प्रीवार्म करें, शेष लगभग 11-12 मिनट के लिए परफ्यूजन के लिए उपयोग किया जाता है। पहले 2 मिनट में समाधान 3 perfused छोड़ें। पाचन पूरा होने तक पुन: उपयोग के लिए peristaltic पंप द्वारा perfusate जलाशयों के लिए बाकी रीसायकल.</li>
	<li>पाचन को समाप्त करें जब दिल सूजा हुआ हो जाता है और थोड़ा पीला और फ्लैक्सीड (स्पंजी बनावट) हो जाता है या एक छाप मौजूद होती है यदि मायोकार्डियम को दांतेदार संदंश का उपयोग करके धीरे से चुटकी ली जाती है।</li>
</ol>5. सेल अलगाव और कैल्शियम reintroduction
<ol><li>संदंश के साथ वेंट्रिकल और एट्रिया को हटा दें, और उन्हें विभिन्न पेट्री व्यंजनों में रखें। पेट्री व्यंजन ों के लिए prewarmed समाधान 3 जोड़ें.</li>
	<li>कुंद संदंश के साथ ऊतक को एक टर्बिड बनावट में विभाजित करें और यहां तक कि पाचन के लिए ऊतक को धीरे से पिपेट करें। हवा के बुलबुले पेश करने से बचें।</li>
	<li>शेष एंजाइम गतिविधि को गिरफ्तार करने के लिए समाधान 4 में पिपेट के साथ टर्बिड पचे हुए ऊतक को स्थानांतरित करें, और फिर 192×g पर 20 s के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने के लिए सेल तलछट और पिपेट में समाधान 5 जोड़ें।</li>
	<li>कैल्शियम विरोधाभास और कैल्शियम अधिभार से बचने के लिए एक चरणबद्ध तरीके से कैल्शियम को फिर से पेश करें। धीरे-धीरे सेल निलंबन के लिए कुल 50 μL 100 mM / L CaCl2 (क्रमशः 5 μL, 10 μL, 15 μL, और 20 μL के प्रत्येक 5 मिनट के अंतराल पर) जोड़ें।</li>
</ol>6. सेल भंडारण
<ol><li>पैच क्लैंप अध्ययन के लिए, Tyrode के समाधान में कोशिकाओं को स्टोर करें। अन्य सेलुलर अध्ययनों के लिए, समाधान 6 में कोशिकाओं को संग्रहीत करें।</li>
	<li>तीव्र कार्यात्मक अध्ययनों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए '(उदाहरण के लिए, Ca2+ स्पार्क्स, Ca2+ तरंगें, Ca2+ रिलीज, Ca2+ रिसाव, और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग) परिणाम, अगले 6 ज के भीतर इस प्रकार के कार्यात्मक प्रयोगों को समाप्त करें।</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+sustained+K++current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle.">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> The Journal of Physiology. 504, 557-563 (1997).</li><li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+"KB+medium".">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+promotes+atrial+fibrillation+by+inducing+structural+remodeling+and+calcium+dysregulation+in+the+atrium.">Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium.</a> Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

कार्डियक रोग मृत्यु दर के प्रमुख वैश्विक कारणों में से एक है। स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली पर इस बोझ को संबोधित करने के लिए, दिल के शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान की गहराई से समझ आवश्यक है। पूरे जानवर और बरकरार दिल की तैयारी के अलावा, सेलुलर तैयारी कार्यात्मक और रोग अध्ययन 2 के लिए एक और अपरिहार्य उपकरण है। पैच क्लैंप, कैल्शियम इमेजिंग, आणविक जीव विज्ञान और अन्य उन्नत प्रौद्योगिकियों को लागू करके, शोधकर्ता इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों, कैल्शियम होमियोस्टैसिस, सिग्नलिंग मार्गों, चयापचय राज्यों और जीन ट्रांसक्रिप्शन के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं एक ही कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम)। यह हृदय रोग प्रक्रिया के शारीरिक और रोग तंत्र को प्रकट करने में बेहद सहायक है3,4,5,6,7। पशु अनुसंधान के लिए, छोटे (जैसे, चूहों, चूहों और गिनी सूअरों) से लेकर बड़े (जैसे, खरगोश और कुत्तों) जानवरों तक की प्रजातियों का उपयोग किया जा सकता है। छोटे जानवरों को आमतौर पर पसंद किया जाता है, विशेष रूप से चूहों, क्योंकि वे आनुवंशिक और रोग मॉडल हेरफेर 8,9,10 के लिए उपयुक्त हैं।
तीव्र रूप से अलग-थलग सीएम की तकनीकों ने एक लंबी विकास अवधि का सामना किया है और अभी भी विकसित हो रहे हैं। Langendorff प्रतिगामी परफ्यूजन चूहों और चूहों में लागू सबसे सफल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य सीएम अलगाव विधि है, विशेष रूप से वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स (वीएम) को अलग करने के लिए 12,13,14,15। हालांकि, सफलतापूर्वक अलग-थलग अलिंद मायोसाइट्स (एएम) की रिपोर्ट दुर्लभ 16,17,18 हैं। तंत्र को प्रकट करने और नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का पता लगाने के लिए पूरे अंग / प्रणाली और सेलुलर / उपकोशिकीय दोनों स्तरों पर आगे की जांच वारंट की जाती है क्योंकि अलिंद फिब्रिलेशन (एएफ), अतालता का सबसे आम प्रकार, तेजी से विश्व स्तर पर प्रचलित हो रहा है, और फार्माकोलॉजिकल थेरेपी और कार्डियक एब्लेशन दोनों में वर्तमान उपचार के तरीके लगभग 40% -50% रोगियों में अप्रभावी रहते हैं AF19 . सफल वयस्क माउस सीएम अलगाव सेलुलर अध्ययन के लिए पहला कदम है। दो प्राथमिक अलगाव विधियों का उपयोग किया जा सकता है: चंक और लैंगेनडॉर्फ विधियां। Langendorff परफ्यूजन विधि में, ऊतक पाचन कोरोनरी धमनियों और केशिका बिस्तरों के लिए उनकी शाखाओं द्वारा वितरित एंजाइम समाधान पर निर्भर करता है। एक उचित महाधमनी कैनुलेशन गहराई जो महाधमनी वाल्वों को भेदने से बच सकती है और कोरोनरी धमनी ओस्टिया को अवरुद्ध कर सकती है, इस तरह के एक परफ्यूजन पैटर्न को प्राप्त करने की शर्त है, जो कुशल पाचन और आदर्श वीएम उपज के लिए भी आवश्यक कदम है। इसलिए, यह मानना उचित है कि महाधमनी कैनुलेशन की गहराई इसी तरह एट्रिया पोत के परफ्यूजन को प्रभावित कर सकती है और अंत में एएम उपज को प्रभावित कर सकती है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न गहराई पर महाधमनी कैनुलेशन किया गया था और संबंधित एएम पैदावार की तुलना की गई थी। डेटा से पता चला है कि महाधमनी cannulation गहराई सीधे एएम उपज के लिए प्रासंगिक है। इसमें, एएमएस और वीएम को एक साथ अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश किया गया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bull Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>43D14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Zhejiang Tianhang Biotechnology</td>
			<td>150207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 8.5</td>
			<td>OriginLab, Northampton, MA,US</td>
			<td></td>
			<td>data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Shanghai Reagent Factory</td>
			<td>810923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>JULABO</td>
			<td>ED (v.2)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modifications of the langendorff method for simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice

एक एकल कार्डियोमायोसाइट्स संकुचन और विद्युत गतिविधि की एक मौलिक इकाई के रूप में कार्डियक जीव विज्ञान और बीमारियों के सेलुलर और उपकोशिकीय स्तर के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इसलिए, हृदय से व्यवहार्य, उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना प्रारंभिक और सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक कदम है। वयस्क चूहों के कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल की तुलना करते हुए, लैंगेनडॉर्फ प्रतिगामी परफ्यूजन साहित्य में रिपोर्ट की गई सबसे सफल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि है, विशेष रूप से वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने के लिए। हालांकि, perfused दिल से गुणवत्ता एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, और कुछ सफल अलगाव रिपोर्ट उपलब्ध हैं। इस जटिल समस्या को हल करना बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि वेंट्रिकुलर रोग के अलावा, अलिंद रोग हृदय रोगों के एक बड़े हिस्से के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, तंत्र को प्रकट करने के लिए सेलुलर स्तर पर आगे की जांच की आवश्यकता है। इस पेपर में, लैंगेनडॉर्फ प्रतिगामी परफ्यूजन विधि पर आधारित एक प्रोटोकॉल पेश किया गया है और महाधमनी कैनुलेशन की गहराई में कुछ संशोधन और अलिंद और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने के लिए पाचन प्रक्रिया को प्रभावित करने वाले चरणों को एक साथ बनाया गया था। इसके अलावा, पृथक कार्डियोमायोसाइट्स को पैच क्लैंप जांच के लिए सक्षम होने की पुष्टि की जाती है।

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Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

यह प्रोटोकॉल लैंगेनडॉर्फ विधि के संशोधनों का वर्णन करता है जिसमें वयस्क चूहों से अलिंद और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव के लिए महाधमनी कैनुलेशन की गहराई शामिल है।

वयस्क चूहों से एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव के लिए लैंगेनडॉर्फ विधि के संशोधन

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...

यह प्रोटोकॉल एक perfused माउस दिल से अलिंद उपज में सुधार करने में मदद कर सकता है। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि अलिंद और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को एक ही पाचन स्थिति के तहत एक साथ अलग किया जा सकता है। यह विधि सेलुलर और उपकोशिकीय स्तर पर हृदय रोग के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।आठ से 10 सप्ताह पुराने पुरुष C57 काले छह माउस को euthanizing के बाद, xiphoid की त्वचा को उठाने के लिए ऊतक संदंश का उपयोग करें। फिर ऊतक कैंची का उपयोग करके, त्वचा के माध्यम से एक मामूली पार्श्व चीरा बनाएं। त्वचा और प्रावरणी के बीच एक कुंद विच्छेदन करें।दोनों पक्षों पर एक वी आकार में axillae की ओर त्वचा चीरा का विस्तार और ribcage के माध्यम से चीरा जारी रखें. फिर ऊतक संदंश का उपयोग करके, उरोस्थि को दबाएं और हृदय और फेफड़ों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए रिबकेज को ऊपर की ओर विक्षेपित करें। घुमावदार संदंश का उपयोग करके, पेरिकार्डियम को छील लें।यदि थाइमस ग्रंथि महान वाहिकाओं को कवर करती है, तो थाइमस ग्रंथि को दोनों तरफ फाड़ने के लिए दो घुमावदार संदंश का उपयोग करें, फिर धीरे से दिल के आधार को पूंछ की ओर खींचें जब तक कि महाधमनी और इसकी शाखा धमनियां वाई-आकार की रक्त वाहिका के रूप में दिखाई न दें। महाधमनी को बाएं आम कैरोटिड धमनी पर ट्रांसेक्ट करें, फिर ब्रैकियोसेफेलिक धमनी को काट लें। दिल को एक्साइज करें और तुरंत इसे एक पेट्री डिश में विसर्जित करें जिसमें टायरोड के समाधान को धोने और अवशिष्ट रक्त को पंप करने के लिए किया जाता है।फिर दिल को एक और पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें समाधान एक होता है। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक आईरिस कैंची का उपयोग करके, किसी भी अधिशेष ऊतक को ट्रिम करें। सिरिंज से हवा के बुलबुले निकालें।फिर दो सीधे बांधने वाले संदंश की सहायता से, प्रतिगामी महाधमनी कैनुलेशन का प्रदर्शन करें, इस बात का ध्यान रखें कि पूरी कैनुलेशन प्रक्रिया तरल सतह के नीचे की जाती है। कैनुलेशन गहराई को समायोजित करें जैसे कि कैनुला टिप आरोही महाधमनी में है, महाधमनी वाल्वों में प्रवेश न करने का ध्यान रखता है। फिर एक पूर्व-गाँठ 3-ओ टांके के साथ, महाधमनी को कैनुला पायदान पर लिटाएं।अवशिष्ट रक्त को बाहर निकालने के लिए सिरिंज से एक को धीरे से इंजेक्ट करें। फिर cannulated दिल को Langendorff उपकरण से कनेक्ट करें, ध्यान रखें कि दिल में किसी भी हवा के बुलबुले को पेश न करें। Cannulated दिल को Langendorff उपकरण से जोड़ने के बाद, लगभग दो मिनट के लिए समाधान एक के साथ दिल perfuse।एक एकल-उपयोग बाँझ पॉलीथीन पिपेट का उपयोग करके, लगभग 2.5 मिलीलीटर समाधान तीन को तैयार करें और बाद में उपयोग के लिए पानी के स्नान में इसे प्रीवार्म करें। फिर ऊतकों को पचाने के लिए, लगभग 11 से 12 मिनट के लिए शेष समाधान तीन के साथ दिल को पार करें। समाधान तीन के साथ परफ्यूजन के पहले दो मिनट के बाद, पाचन पूरा होने तक पुन: उपयोग के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप द्वारा परफ्यूज्ड जलाशयों के लिए परफ्यूज्ड समाधान को रीसायकल करें।जब दिल सूज जाता है, तो थोड़ा पीला और फ्लैसिड हो जाता है, दांतेदार संदंश का उपयोग करके, धीरे से मायोकार्डियम को चुटकी लें। यदि कोई छाप दिखाई देती है, तो पाचन को समाप्त करें और दिल को उपकरण से अलग करें। धमनी और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने के लिए, निलय और एट्रिया को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें और उन्हें विभिन्न पेट्री व्यंजनों में रखें।फिर दोनों व्यंजनों में पहले से गर्म समाधान तीन जोड़ें। कुंद संदंश का उपयोग करते हुए, ऊतकों को एक टर्बिड बनावट में विभाजित करें, फिर धीरे से हवा के बुलबुले पेश किए बिना भी पाचन के लिए ऊतक को पिपेट करें। शेष एंजाइम गतिविधि को गिरफ्तार करने के लिए, एक पिपेट का उपयोग करके, टर्बिड डाइजेस्टेड ऊतक को समाधान चार में स्थानांतरित करें, फिर 192 बार जी पर 20 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।कैल्शियम विरोधाभास और कैल्शियम अधिभार से बचने के लिए, सेल निलंबन में धीरे-धीरे 100 मिलीमोलर प्रति लीटर कैल्शियम क्लोराइड के कुल 50 माइक्रोलीटर जोड़कर कैल्शियम को चरणबद्ध तरीके से फिर से पेश करें। एक बार जब सभी कैल्शियम क्लोराइड को जोड़ा जाता है, तो पैच क्लैंप अध्ययन के लिए टायरोड के समाधान में कोशिकाओं को स्टोर करें। कैनुलेशन गहराई एट्रिया और इसके उपांगों के परफ्यूजन के साथ जुड़ी हुई है।जब कैनुला टिप आरोही महाधमनी पर होती है, तो दोनों अलिंद उपांगों को पर्याप्त एट्रिया परफ्यूजन का संकेत देते हुए फुलाया जाता है। हालांकि, जब कैनुला टिप महाधमनी जड़ पर होती है, तो दोनों अलिंद उपांगों को विज़ेन किया जाता है, जो अपर्याप्त परफ्यूजन का संकेत देता है। आरोही महाधमनी पर कैनुलेशन द्वारा अलग किए गए एट्रियल मायोसाइट्स में कैल्शियम रीइंट्रोडक्शन से पहले और बाद में महाधमनी जड़ में कैनुलेशन द्वारा अलग किए गए लोगों की तुलना में उच्च जीवित रहने की दर थी।इसके विपरीत, वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की जीवित रहने की दर में कोई अंतर नहीं था, जो या तो आरोही महाधमनी या महाधमनी जड़ में कैनुलेशन द्वारा अलग-थलग था, दोनों पहले और बाद में कैल्शियम पुन: परिचय। पृथक अलिंद और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स में सोडियम वर्तमान की पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग, साथ ही साथ वर्तमान घनत्व इस बात की पुष्टि करते हैं कि पृथक कोशिकाओं की गुणवत्ता इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए आवश्यकताओं को पूरा करती है। महाधमनी transacting करते समय, बंधाव के लिए एक पर्याप्त ग्रंथि बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें।अन्यथा, प्रवेशनी बंधाव के बाद महाधमनी वाल्व में प्रवेश कर सकती है।

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Murine आइलेट अलगाव और Subcapsular गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए एक विधि

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

The WATCHMAN Left Atrial Appendage Closure Device for Atrial Fibrillation

चौकीदार atrial fibrillation के लिए वाम Atrial उपांग बंद डिवाइस

Atrial fibrillation (AF) is the most common cardiac arrhythmia, affecting an estimated 6 million people in the United States 1. Since AF affects primarily ...

Catheter Ablation in Combination With Left Atrial Appendage Closure for Atrial Fibrillation

संयोजन में atrial fibrillation के लिए वाम अलिंद उपांग क्लोजर साथ कैथिटर पृथक

Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained cardiac arrhythmia, affecting millions of individuals worldwide 1-3. The rapid, irregular, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

ताजा सर्जिकल नमूने से अलगाव और मानव निलय cardiomyocytes की कार्यात्मक विशेषता

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

चूहे में श्वासनली के रैपिड इंटुबैषेण के लिए एक बेहतर तरीका

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

बाईं वेंट्रिकुलर अतिवृद्धि की प्रेरण के लिए चूहों में न्यूनतम इनवेसिव अनुप्रस्थ महाधमनी कसना की तकनीक

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

अलगाव और वयस्क चूहे Cardiomyocytes की खेती

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

अलिंद Cardiomyocytes का एक चूहा मॉडल से चयापचय सिंड्रोम-संबंधित हृदय विफलता संरक्षित बेदखली अंश के साथ अलगाव

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

वयस्क चूहे से एट्रियल मायोसाइट्स का अलगाव

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

चूहे में सही वेंट्रिकुलर सिस्टम और हाइपोक्सिया-प्रेरित पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप के लिए आक्रामक हेमोडायनामिक आकलन

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...