Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

نشكر ألبرتا الابتكار لتوفير CNC وكين هاريس وجاي يونغ تشو لمشورتهم التقنية عند إعداد مصفوفة CNC / agarose / D - mannitol. نشكر أيضا بن هوفمان وهيذر وينشيل ونيكول ديامانتييدات على نصائحهم التقنية ودعمهم بإعداد ومعايرة الطابعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد.

ملاحظة: يتكون هذا البروتوكول من خمسة أقسام: (1) عزل نخاع عظم الفأر وتمايز الخلايا الصاري المشتقة من نخاع العظم الماوس (BMMCs)، (2) تلفيق CNC/agarose/D-mannitol هيدروجيل الركائز في نظام 24 جيدا وثقافة BMMCs على الركائز، (3) إزالة BMMCs من CNC / agarose / D - mannitol هيدروجيل الركائز وتحليل الجدوى والتعبير العلامات الحيوية با...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+Scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).</li><li>Halib, N., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocellulose:+Insight+into+health+and+medical+applications.">Nanocellulose: Insight into health and medical applications.</a> Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).</li><li>Alonso-Lerma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+performance+crystalline+nanocellulose+using+an+ancestral+endoglucanase.">High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase.</a> Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).</li><li>Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications.">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).</li><li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies.">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).</li><li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells.">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).</li><li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds.">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li><li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function.">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li><li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

يتطلب تصنيع الأنسجة المحاكاة الحيوية ثلاثية الأبعاد الدمج الناجح للدينك الحيوي ، الذي يحاكي مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مع المكون الخلوي (المكونات) لإنشاء تناظرات فسيولوجية في الأنسجة الحية . وهذا يتطلب استخدام الخلايا الأولية، وليس الخلايا المتحولة، عند تصنيع الأنسجة المحاكاة ا...

وقد ركز الاهتمام الأخير في نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد والطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الاهتمام على الهيدروجيلات ومركبات الهيدروجيل. هذه المركبات بمثابة اللزوجة بعد المحاكاة الحيوية المسامية ويمكن أن تتكون من ما يصل إلى 99٪ محتوى المياه من حيث الوزن، وهو ما يماثل الأنسجة البيولوجية1،2،3. هذه السمات من مركبات هيدروجيل وبالتالي تسمح لنمو الخلايا دون التأثير على قدرتها على البقاء ووظيفتها. واحد من هذه المركبة هو نانوسليلوز البلورية (CNC)، والتي تم استخدامها كمادة تعزيز في مركبات الهيدروجيل، سقالات الخلية في تطوير يزرع المواد الحيوية، وفي ثنائي الأبعاد (2D) و 3D في ثقافة الخلايا المختبرية4،5. بالنسبة للجزء الأكبر، المصفوفات المكونة من CNC ليست سامة للخلايا الخلوية علنا إلى الخلايا الظهارية القرنية البشرية6، الخلايا الظهارية المعوية7، الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم البشري8، أو الخلايا العصبية الشبيهة9. ومع ذلك ، فإن النشاط الأيضي وانتشار الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من نخاع العظم البشري يقلل من الارتباط مع زيادة لزوجة مركبات الخلايا النانوية القائمة على الخشب ، مما يشير إلى أنه يجب اختبار تكوين المصفوفة بعناية لآثارها الضارة على وظائف الخلية8.
وبالمثل ، يمكن أن تحفز CNC الاستجابات الالتهابية في الضامة عند الاستيعاب ، والتي يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة في أنظمة زراعة الخلايا المناعية ثلاثية الأبعاد10،11. في الواقع ، هناك القليل جدا من البيانات المتاحة حول كيفية تأثير CNC على استجابات الخلايا المناعية الأخرى ، وخاصة الاستجابات الالتهابية التحسسية التي تبدأها الخلايا السارية. الخلايا الصارية هي الكريات البيض الحبيبية التي تعبر عن مستقبلات IgE عالية التقارب ، FceRI ، المسؤولة عن تنشيط الاستجابات الالتهابية لمسببات الحساسية. انتشارها والتمايز تعتمد على عامل الخلايا الجذعية (SCF), الذي يربط مستقبلات التيروزين, كيت. الخلايا الصاري مشتقة من خلايا السلف نخاع العظم التي تدخل الدورة الدموية وتهاجر بعد ذلك هامشيا لتفريق في كل مكان في جميع الأنسجة البشرية12. كما تعمل الخلايا الصاري في بيئة الأنسجة 3D، فهي مرشح مثالي للخلايا المناعية لدراسة العمليات المناعية في نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد في المختبر . ومع ذلك، حتى الآن، لا يوجد نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد قابلة للحياة في المختبر التي تحتوي على خلايا سارية.
نظرا للطبيعة الحساسة للغاية للخلايا الصاري وميلها إلى الحصول على استجابات مؤيدة للالتهابات للمحفزات الخارجية ، يلزم النظر بعناية في مكونات المصفوفة ثلاثية الأبعاد وطريقة الطباعة الحيوية لإدخال الخلايا السارية في السقالة ثلاثية الأبعاد ، كما نوقش أكثر. يمكن تصنيع الأنسجة من فئتين واسعتين من المواد الحيوية ، أي الدينك الحيوي وحبر المواد الحيوية. ويكمن التمييز في حقيقة أن المركبات البيولوجية هي مركبات هيدروجيل محملة بالخلايا، في حين أن أحبار المواد الحيوية هي مركبات هيدروجيل خالية من الخلايا، على النحو المحدد من قبل Groll et al.13,14. وبالتالي، تحتوي البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بالأنك الحيوي على خلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، في حين أن البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بحبر المواد الحيوية تحتاج إلى بذر بخلايا بعد الطباعة. يتم إجراء التصنيع الحيوي لسقالات الثقافة من الأحبار الحيوية / الأحبار الحيوية القائمة على الهيدروجيل بشكل شائع باستخدام الطابعات الحيوية ثلاثية الأبعاد البثق ، والتي تبرز حبر bioink / biomaterial من خلال فوهة صغيرة تحت الضغط إما عن طريق المكبس الهوائي أو الميكانيكي. تقوم الطابعات الحيوية البثق بتصنيع سقالات ثلاثية الأبعاد عن طريق إيداع المنك الحيوي في أنماط مقطعية ثنائية الأبعاد مكدسة بشكل متسلسل على بعضها البعض في نهج "من أسفل إلى أعلى".
لتكون متوافقة مع الطباعة الحيوية البثق، يجب أن يكون الحبر bioink/biomaterial القائم على الهيدروجيل تمتلك خصائص التكستروبيك (القص رقيق)، حيث البوليمرات هيدروجيل المكونة للتدفق الحبر bioink / المواد الحيوية مثل السائل من خلال فوهة القنوات الدقيقة عندما تتعرض لضغوط القص، ولكن العودة إلى حالة لزجة، هلام مثل عند إزالة الإجهاد القص15 . نظرا لارتفاع محتوى المياه ، يجب ربط البوليمرات من الأحبار الحيوية / المواد الحيوية القائمة على الهيدروجيل ، إما ماديا أو مكافئا ، للحفاظ على الهندسة المعمارية والسلامة الهيكلية للبنية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد. في حالة الخلايا المحملة bioinks ، تتعرض الخلايا مباشرة لضغوط كيميائية خلال عملية الربط. عملية الخلايا البثق مغلفة داخل مصفوفة هيدروجيل bioink يخضع أيضا الخلايا لإجهاد القص، والتي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض القدرة على البقاء و / أو موت الخلية. وبمجرد طباعة نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد بيولوجيا، من الصعب التمييز بين مستويات السمية الخلوية التي تثيرها مصفوفة الهيدروجيل نفسها وعمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي. وهذا يشكل تحديا خاصا في سياق السقالات ثلاثية الأبعاد حيث تكون الخلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، مما يجعل من الصعب إزالة الخلايا لإجراء تحليلات لاحقة، مما سيضر بقابلية الخلايا الصارية للحياة.
نهج ألطف لتوليد الأنسجة ثلاثية الأبعاد يبني تحتوي على الخلايا الصاري ينطوي على بذر الخلايا في المطبوعة مسبقا، والسقالات الحبر المواد الحيوية المسامية 3D من تعليق ثقافة الخلية، مما يعزز القدرة الفطرية للخلايا الصاري للهجرة من الدورة الدموية إلى الأنسجة الطرفية. فوائد هذا النهج البذر الخلية هي ذات شقين: (1) لا تخضع الخلايا الصاري للقص والضغوط الكيميائية من عمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي، و (2) يمكن إزالة الخلايا بسهولة من سقالة 3D بعد التعرض عن طريق غسل لطيف للتحليل دون التأثير سلبا على قدرتها على البقاء. الفائدة الإضافية من البذر وتحليل صلاحية الخلية من الخلايا الصاري على 3D المطبوعة بيولوجيا، والسقالات هيدروجيل مسامية بدلا من أقراص هيدروجيل 2D هو أن السقالات هيدروجيل المطبوعة بيولوجيا 3D تلخص السمات الطوبوغرافية microscale في الأنسجة الحية ، والتي ليست موجودة بكميات كبيرة، 2D أقراص هيدروجيل مخطط. هذا النهج هو نهج مناسب وسريع وفعال من حيث التكلفة لتحديد الآثار السامة للخلايا الكارثية المحتملة لمصفوفات هيدروجيل البيونك المرشحة على الخلايا الصارية ، وكذلك الخلايا المناعية الأخرى ، قبل الاستثمار في التجارب الهندسية مكلفة الأنسجة ثلاثية الأبعاد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

تستخدم الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) المركبات القائمة على الهيدروجيل (أو أحبار المواد الحيوية) التي يتم إيداعها في نمط ، مما يشكل ركيزة تودع عليها الخلايا. لأن العديد من الأحبار المواد الحيوية يمكن أن تكون سامة للخلايا الأولية، فمن الضروري تحديد التوافق البيولوجي لهذه المركبات هيدروجيل قبل استخدامها في عمليات هندسة الأنسجة 3D مكلفة. تتطلب بعض طرق الثقافة ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك الطباعة الحيوية، أن يتم تضمين الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، مما يجعل من الصعب استخراج الخلايا وتحليلها للتغيرات في القدرة على البقاء والتعبير عن العلامات الحيوية دون إحداث ضرر ميكانيكي. يصف هذا البروتوكول بأنه دليل على المفهوم ، وهو طريقة لتقييم التوافق البيولوجي للخلايا النانوية البلورية (CNC) المدمجة مركب agarose ، ملفقة في نظام ثقافة 24 بئرا ، مع خلايا سارية مشتقة من نخاع العظم الماوس (BMMCs) باستخدام المقايسات الخلوية التدفق لرواية الخلية والتعبير عن العلامة الحيوية.
بعد 18 ساعة من التعرض لمصفوفة CNC /agarose/D-mannitol ، لم تتغير قابلية BMMC للحياة كما تقاس نفاذية يوديد البروبيديوم (PI). ومع ذلك، BMMCs مثقف على CNC/agarose/D-مانيتول الركيزة يبدو أن زيادة طفيفة في التعبير عن مستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI) ومستقبلات عامل الخلايا الجذعية (كيت؛ CD117) ، على الرغم من أن هذا لا يبدو أن تعتمد على كمية CNC في مركب bioink. كما تم تقييم صلاحية BMMCs بعد التعرض لدورة زمنية لسقالات الهيدروجيل التي تم تصنيعها من حبر المواد الحيوية التجارية المكونة من نانوسليلوز الرجفان (FNC) وألجينات الصوديوم باستخدام طابعة بيولوجية قذف ثلاثية الأبعاد. على مدى فترة 6-48 ساعة، لم تؤثر ركائز FNC/alginate سلبا على صلاحية BMMCs كما يحددها قياس التدفق الخلوي ومقايسات الميكروتتر (XTT وdhydrogenase اللاكتات). يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لفحص التوافق الكيميائي الحيوي للحبر الحيوية المرشحة بسرعة لفائدة سقالات ثلاثية الأبعاد للبذر بعد الطباعة مع الخلايا الصارية.

واحدة من أهم خصائص الحبر المواد الحيوية الناجحة أو ركيزة الثقافة هو أن من التوافق البيولوجي. في المقام الأول ، يجب ألا تؤدي الركيزة إلى الموت الخلوي. هناك العديد من الأساليب القائمة على الميكروتيتر وتدفق قياس الخلايا لتحديد مدى صلاحية الخلية ونخر; ومع ذلك، هذه الطرق غير قابلة لتحليل الخلا...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتقييم التوافق البيولوجي بسرعة للخلايا النانوية البلورية (CNC) / agarose المركبة هيدروجيل الحبر المواد الحيوية مع خلايا الصاري نخاع العظم الماوس المستمدة من حيث صلاحية الخلية والتعبير الظاهري لمستقبلات سطح الخلية، كيت (CD117) ومستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI).

تصنيع بلوري Nanocellulose جزءا لا يتجزأ من الحبر Agarose المواد الحيوية لثقافة الخلايا الصاري نخاع العظام المستمدة

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

يوفر هذا البروتوكول نهجا سهلا وسريعا لفحص أحبار المواد الحيوية المرشحة للآثار السامة للخلايا المحتملة ضد الخلايا الأولية والمناعية الحساسة قبل تجارب الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المعقدة. بعد احتضان الخلايا المناعية على بنيات الحبر المواد الحيوية، يمكن استرجاع الخلايا بسهولة من البنى عن طريق غسل لطيف لإجراء السمية الخلوية المصب أو تحليلات العلامات الحيوية. هذا البروتوكول هو ذات الصلة مباشرة لهندسة الأنسجة التي يجب أن تبنى الأنسجة المطبوعة بيولوجيا التي هي متجهة لزرع من الخلايا الأولية وحبر المواد الحيوية المتوافقة بيولوجيا.للبدء، قم بإعداد خرطوشة حبر حيوي لتركيبها على الطابعة الحيوية INKREDIBLE+3D. أولا، قم بإزالة قبعات النهاية الزرقاء من خرطوشة حبر المواد الحيوية ثلاثية الملليلتر وألصق فوهة طباعة بيولوجية مخروطية معقمة من عيار 22 إلى نهاية قفل Luer لخرطوشة الحبر الحيوي. قم بتوصيل أنابيب إمداد ضغط الهواء لرأس الطباعة واحد أو PH1 بالطرف المقابل للخرطوشة وأدخل الخرطوشة مع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المرفقة في الفتحة الرأسية ل PH1.بعد ذلك، قم بمقعد الخرطوشة بقوة في PH1 مع فوهة طباعة بيولوجية مخروطية تمتد أسفل رأس الطباعة. شد المسمار على PH1 في اتجاه عقارب الساعة حتى إصبع ضيق لقفل خرطوشة الحبر الحيوي في مكان. لاحظ أنه يمكن إجراء الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد مع ترك PH2 فارغا.الطاقة على الطابعة الحيوية وإطلاق برنامج الطباعة الحيوية على جهاز كمبيوتر متصل بالطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد عبر كابل USB 2.0. في البرنامج، انقر فوق زر الاتصال لمزامنته مع الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد. لاحظ ثلاثة خيارات في قائمة التحكم الرئيسية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.أولا، إعداد الطباعة الحيوية. ثانيا، قائمة المرافق. وثالثا، شاشة الحالة.حدد خيار التحضير للطباعة الحيوية، ثم مرر لأسفل إلى خيار محاور المنزل وحدده. بعد المعايرة الناجحة لمحاور XYZ، سينخفض ارتفاع سرير الطباعة قليلا وستنتقل رؤوس الطباعة إلى أعلى النقطة المركزية لسرير الطباعة. للشروع في معايرة نقطة البداية للطباعة الحيوية في لوحات 24 بئرا ، قم بإزالة لوحة ثقافة معقمة من 24 بئرا من غلافها البلاستيكي المختوم ووضع علامة على نقطة مركزية من البئر D1 على الجانب السفلي من اللوحة مع علامة دائمة.قم بإزالة غطاء اللوحة ووضع لوحة الثقافة ذات ال 24 بئرا على سرير الطباعة مع D1 جيدا الموجود في الزاوية اليسرى الأمامية من سرير الطباعة. في قائمة التحكم الرئيسية، حدد قائمة الأدوات المساعدة ثم قم بنقل المحور. حرك رؤوس الطباعة بزيادات ملليمتر واحد على طول محاور X و Y حتى تكون فوهة الطباعة الحيوية المخروطية ل PH1 فوق النقطة التي تم وضع علامة عليها تحت D1 بشكل جيد. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية فوق النقطة عن طريق تحريك رؤوس الطباعة بزيادات 0.1 ملليمتر.سجل احداثيات X و Y من فوهة الطباعة الحيوية المخروطية عندما مباشرة فوق مركز D1 جيدا كما هو مبين في شاشة لوحة التحكم للطباعة الحيوية 3D ووضع علامة أسفل الإحداثيات. بعد ذلك ، ارفع سرير الطباعة بزيادات ملليمتر واحد حتى يقوم الجزء السفلي من البئر D1 بلمس فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المثبتة في رأس الطباعة الأول. ضبط حركة السرير المطبوع بزيادات 0.1 ملليمتر إذا لزم الأمر.من قائمة المرافق، حدد خيار معايرة المحور Z وحدد خيار معايرة Z في المتجر وتأكد منه. العودة إلى القائمة الرئيسية وحدد الخيار إعداد الطباعة الحيوية. مرر لأسفل إلى وحدد خيار معايرة Z.تحديث رمز هندسي لوحة 24 جيدا أو G-رمز مع إحداثيات نقطة البداية الصحيح. افتح ملف G-code المتوفر 24 جيدا على برنامج الطباعة الحيوية. تحديث إحداثيات س و ص على سطر واحد مع القيم التي تم الحصول عليها في الخطوات السابقة وحفظ الملف تحت اسم جديد.تأكد من أن المضخة الهوائية متصلة بإحكام بمنفذ كمية الهواء الخلفي للطباعة الحيوية INKREDIBLE+ 3D ثم قم بتشغيلها. اسحب مقبض التحكم الأمامي الموجود على الجانب الأيمن من الطابعة الحيوية INKREDIBLE+3D. تأكد من أن مقاييس الضغط الرقمي لPH1 و PH2 الموجودة على الجزء الأمامي من الطابعة الحيوية كل قراءة ما يقرب من صفر كيلوباسكال.تدوير مقبض التحكم إلى الأمام ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى يصل الضغط المشار إليه على المقياس الأيسر ل PH1 إلى 12 كيلوباسكال. ضع ورق نسيج مطوي أو قطعة من فيلم الختم المقاوم للماء تحت فوهة الطباعة للخرطوشة المثبتة، مع الحرص على عدم لمس فوهة الطباعة. من قائمة التحكم الرئيسية على الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، حدد إعداد الطباعة الحيوية.انتقل إلى وحدد تشغيل PH1. لاحظ أن الحبر الحيوي يبدأ في البثق من فوهة الطباعة. إذا لزم الأمر، قم بزيادة ضغط البثق عن طريق تدوير مقبض التحكم في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم قذف الحبر الحيوي في خيوط مستمرة وتسجيل إعداد الضغط الجديد.حدد إيقاف تشغيل PH1 لإيقاف البثق للحبر الحيوي. قم بإزالة ورق الأنسجة أو الفيلم الذي يحتوي على الحبر الحيوي مقذوف من سرير الطباعة وإغلاق باب الطابعة الحيوية. لإجراء الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للركائز الهيدروجيل المستقيمة في شكل لوحة 24 جيدا ، حدد قائمة المرافق من قائمة التحكم الرئيسية ، ثم حدد تعطيل طباعة SD التي ستسمح لبرنامج الطباعة الحيوية بنقل ملفات G-code إلى الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للطباعة.انقر على زر التحميل في برنامج الطباعة الحيوية وحدد ملف G-code المحدث ذو 24 بئرا. في لوحة التحكم اليمنى في البرنامج، حدد علامة التبويب معاينة الطباعة وانقر على زر الطباعة لبدء الطباعة الحيوية في D1 جيدا. عند الانتهاء من الطباعة الحيوية للبنى المستقيمة ، قم بتغطية اللوحة ذات ال 24 بئرا بغطاءها ونقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية. تزج كل بناء المستقيم في قطرتين من المعقمة 50 ملليمولار محلول كلوريد الكالسيوم واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.يستنشق بعناية محلول كلوريد الكالسيوم من كل بئر بناء وشطف مرة واحدة في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني 1X لإزالة كلوريد الكالسيوم الزائد. لمنع الجفاف من يبني الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا، والحفاظ على 3D يبني المستقيم المطبوع بيولوجيا في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة حتى خلايا الصاري المشتقة من نخاع العظام على استعداد لتكون البذور على البنى. واستنادا إلى معلمات التشتت الأمامي والجانبي للمركبات ثنائية الميثاز التي تم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي، لوحظ أن ركيزة الهيدروجيل ذات أعلى تركيز CNC لم تغير الحجم الأصلي أو التفاصيل الأصلية ل BMMCs بالمقارنة مع BMMCs المستزرعة في غياب ركائز الهيدروجيل D-mannitol AGAROSE D-mannitol.وأظهر تحليل التدفق الخلوي نفاذية BMMCs إلى يوديد البروبيديوم أن أيا من تركيزات CNC التي تم اختبارها لم يثر أي تأثير سلبي على قابلية BMMC للحياة. زادت ركيزة CNC agarose من التعبير عن المؤشرات الحيوية للخلايا السارية بتركيزات CNC أكبر من أو تساوي 2.5٪ ومع ذلك ، ظلت مستويات التعبير لهذه المستقبلات متسقة نسبيا بين 2.5٪ و 12.5٪ CNC مما يشير إلى تأثير مستقل عن تركيز CNC. أظهر فحص XTT أن النشاط الأيضي ل BMMCs المستزرعة على سقالات الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد ظل ثابتا نسبيا عند حوالي 100٪ عبر جميع النقاط الزمنية المختبرة.وبالمثل، لم يكشف الإصدار LDH ومقاييس استبعاد صبغة PI عن أي تغييرات كبيرة في جدوى BMMCs. الاهتمام الدقيق باختيار مقياس فوهة الطباعة، ومعايرة محاور الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، وإعداد ضغط البثق سيضمن الطباعة القابلة للاستنساخ للبنى ثلاثية الأبعاد عالية الجودة. السهولة التي يمكن استرجاع الخلايا الصاري يسمح لهم أن يتم التحقيق من قبل مجموعة واسعة من المقايسات البيولوجية لمزيد من الدراسة أي جانب من جوانب وظائفها الخلوية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Microfabricated المنصات الحيوي للثقافة الخلية ميكانيكيا

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

البوليمرات الذاكرة شكل خلية للثقافة أحدث

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

نظام الحرير ثقافة السينما ل في المختبر تحليل وتصميم مادة بيولوجية

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

تلفيق من Functionalized المغناطيسي البكتيرية Nanocellulose مع أكسيد الحديد النانوية

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

توصيف خلايا الدم البيضاء، الصفائح الدموية الغنية الليفين، رواية بيولوجية

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

تصنيع مقلوب الغروية كريستال بولي (جلايكول الإثيلين) سقالة: وثلاثي الأبعاد منصة الثقافة خلية للهندسة الأنسجة الكبد

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

تلفيق من الآبار المخصصة [اغروس] لبذر الخلية والأنسجة خاتم التجميع الذاتي باستخدام قوالب طباعة 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...