Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

我们感谢Alberta Innovates提供CNC，Ken Harris和Jae-Young Cho在准备CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇基质时提供技术建议。我们还感谢Ben Hoffman，Heather Winchell和Nicole Diamantides在INKREDIBLE+ 3D生物打印机的设置和校准方面的技术建议和支持。

注意：该方案由五个部分组成：（1）小鼠骨髓的分离和小鼠骨髓来源的肥大细胞（BMMCs）的分化，（2）在24孔系统中制造CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇水凝胶底物并在底物上培养BMMC，（3）从CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇水凝胶底物中去除BMMC并使用流式细胞术分析活力和生物标志物表达， （4）从市售原纤维纳米纤维素（FNC）/海藻酸钠复合生物材料墨水中对水凝胶支架进行3D生物打印，以及（5）在FNC /海藻酸钠水...

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

3D仿生组织的制造需要生物墨水的成功融合，其模仿细胞外基质的成分，与细胞成分一起创建 体内 组织的生理类似物。这需要在制造生理仿生组织时使用原代细胞，而不是转化的细胞。然而，原代免疫细胞（例如肥大细胞）特别容易受到生物墨水基质本身可能引发的细胞毒性作用和表型变化的影响，这是不希望的。因此，快速评估候选生物材料墨水对肥大细胞的活力和表型（表面受体表达...

最近对3D培养系统和3D生物打印的兴趣将注意力集中在水凝胶和水凝胶复合材料上。这些复合材料可用作粘稠但多孔的仿生剂，可由高达99%的重量含水量组成，可与生物组织相媲美1，2，3。因此，水凝胶复合材料的这些特征允许细胞生长，而不会影响其活力和功能。其中一种复合材料是结晶纳米纤维素（CNC），它已被用作水凝胶复合材料，生物材料植入物开发中的细胞支架以及二维（2D）和3D 体外 细胞培养中的增强材料4，5。在大多数情况下，由CNC组成的基质对人角膜上皮细胞6，肠上皮细胞7，人骨髓来源的间充质干细胞8或神经元样细胞9没有明显的细胞毒性。然而，人骨髓来源的间充质干细胞的代谢活性和增殖与木基纳米纤维素复合材料粘度的增加相关，这表明必须仔细测试基质的组成，以确定其对细胞功能的有害影响8。
同样，CNC可以在内化时诱导巨噬细胞中的炎症反应，这可能在3D免疫细胞培养系统中产生严重后果10，11。事实上，关于CNC如何影响其他免疫细胞反应，特别是由肥大细胞引发的过敏性炎症反应，可用的数据很少。肥大细胞是颗粒状白细胞，表达高亲和力IgE受体FCERI，负责激活对过敏原的炎症反应。它们的增殖和分化依赖于干细胞因子（SCF），其结合酪氨酸受体Kit。肥大细胞来源于骨髓祖细胞，这些祖细胞进入循环并随后在外周迁移，在所有人体组织中无处不在12。由于肥大细胞在3D组织环境中起作用，因此它们是研究 体外 3D组织模型中免疫过程的理想免疫细胞候选者。然而，迄今为止，还没有含有肥大细胞的活体 外 3D组织模型。
由于肥大细胞的高度敏感性及其对外部刺激引发促炎反应的倾向，因此需要仔细考虑3D基质成分以及将肥大细胞引入3D支架的生物打印方法，如进一步讨论的那样。组织结构可以从两大类生物材料（即生物墨水和生物材料油墨）中生物制造。区别在于生物墨水是充满细胞的水凝胶复合材料，而生物材料油墨是没有细胞的水凝胶复合材料，如Groll等人13，14所定义。因此，用生物墨水打印的3D构建体包含预先嵌入在水凝胶基质中的细胞，而用生物材料油墨打印的3D构建体需要在打印后接种细胞。来自水凝胶基生物墨水/生物材料墨水的培养支架的生物制造通常使用挤出3D生物打印机进行，该打印机通过气动或机械驱动的活塞在压力下通过微尺度喷嘴挤出生物墨水/生物材料墨水14。挤出生物打印机通过将生物墨水沉积在2D横截面图案中以"自下而上"的方法顺序堆叠在一起来制造3D支架。
为了与挤出生物打印兼容，基于水凝胶的生物墨水/生物材料墨水必须具有触变性（剪切变稀）特性，即生物墨水/生物材料墨水的组成水凝胶聚合物在承受剪切应力时像流体一样流过微通道喷嘴，但在去除剪切应力后恢复到粘稠的凝胶状状态15.由于其高含水量，水凝胶基生物墨水/生物材料油墨的聚合物必须以物理或共价方式交联，以保持3D生物打印结构的结构和结构完整性。在充满细胞的生物墨水的情况下，细胞在交联过程中直接受到化学应力的影响。将细胞封装在生物墨水水凝胶基质中的过程也会使细胞受到剪切应力，这可能导致活力降低和/或细胞死亡。一旦3D组织模型被生物打印，就很难区分水凝胶基质本身引发的细胞毒性水平以及挤出和交联过程。这在3D支架的背景下尤其具有挑战性，其中细胞预先嵌入在水凝胶基质中，因此难以去除细胞以进行后续分析，这将不利于肥大细胞的活力。
生成包含肥大细胞的3D组织结构体的更温和的方法涉及将细胞从细胞培养悬浮液中接种到预打印的多孔生物材料墨水3D支架中，这利用了肥大细胞从循环迁移到外周组织的先天能力。这种细胞接种方法的好处是双重的：（i）肥大细胞不会分别受到挤出和交联过程中的剪切和化学应力，以及（ii）通过温和洗涤进行分析，细胞暴露后可以很容易地从3D支架上取出，而不会对其生存能力产生不利影响。在3D生物打印的多孔水凝胶支架上接种和分析肥大细胞的细胞活力的另一个好处是，3D生物打印的水凝胶支架概括了 体内 组织的微观地形特征，这些特征不存在于散装的2D平面水凝胶盘中。这种方法是一种合适，快速且具有成本效益的方法，可以在投资昂贵的3D组织工程实验之前确定候选bioink水凝胶基质对肥大细胞以及其他免疫细胞的潜在灾难性细胞毒性作用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

三维（3D）生物打印利用以图案沉积的水凝胶基复合材料（或生物材料油墨），形成细胞沉积在其上的底物。由于许多生物材料油墨可能对原代细胞具有潜在的细胞毒性，因此有必要在昂贵的3D组织工程工艺中使用这些水凝胶复合材料之前确定其生物相容性。一些3D培养方法，包括生物打印，要求将细胞嵌入3D基质中，这使得很难提取和分析细胞的活力和生物标志物表达的变化而不会引起机械损伤。该协议将概念证明描述为概念验证，一种评估结晶纳米纤维素（CNC）嵌入琼脂糖复合材料的生物相容性的方法，该复合物被制造成24孔培养系统，小鼠骨髓衍生肥大细胞（BMMCs）使用流式细胞术测定细胞活力和生物标志物表达。
在暴露于CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇基质18小时后，通过碘化丙啶（PI）渗透率测量的BMMC活力保持不变。然而，在 CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇 底物上培养的BMMC似乎略微增加了其高亲和力IgE受体（FcεRI）和干细胞因子受体（Kit;CD117），尽管这似乎并不依赖于生物墨水复合材料中CNC的量。在暴露于水凝胶支架后，还评估了BMMC的可行性，这些支架是使用3D挤出生物打印机由原纤维纳米纤维素（FNC）和海藻酸钠组成的商业生物材料墨水制成的。在6-48小时内，FNC / 藻酸盐底物没有对流式细胞术和微量滴定测定（XTT和乳酸脱氢酶）测定的BMMC的活力产生不利影响。该协议描述了一种有效的方法，可以快速筛选候选生物材料油墨的生化相容性，以用作3D支架，用于用肥大细胞进行打印后接种。

成功的生物材料油墨或培养基质的最关键特征之一是生物相容性。首先，底物不得诱导细胞死亡。有几种基于微量滴定和流式细胞术的方法来量化细胞活力和坏死;然而，这些方法不适合分析嵌入在水凝胶基质中的细胞。在该协议中，通过将BMMC接种到水凝胶底物或生物打印的支架上来规避上述限制。在特定的潜伏期（本研究中为6-48小时）之后，BMMCs很容易通过微量移液收获，而无需对水凝胶底物?...

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Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

该协议强调了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料墨水与小鼠骨髓衍生肥大细胞的生物相容性的方法，包括细胞活力和细胞表面受体，试剂盒（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。

用于骨髓源性肥大细胞培养的结晶纳米纤维素包埋琼脂糖生物材料墨水的制备

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

该协议提供了一种简单快速的方法来筛选候选生物材料油墨，以便在复杂的3D生物打印实验之前对敏感的原代细胞和免疫细胞产生潜在的细胞毒性作用。在生物材料墨水构建体上孵育免疫细胞后，可以通过温和洗涤来轻松从构建体中检索细胞，以进行下游细胞毒性或生物标志物分析。该协议与组织工程直接相关，其中用于移植的生物打印组织必须由原代细胞和生物相容性生物材料油墨构建。首先，准备一个生物墨盒以安装到INKREDIBLE + 3D生物打印机上。首先，从三毫升生物材料墨盒上取下蓝色端盖，并将无菌的22号锥形生物打印喷嘴固定在生物墨盒的Luer锁定端。将打印头一或PH1的气压供应管连接到墨盒的另一端，并将墨盒及其连接的锥形生物打印喷嘴插入PH1的垂直插槽中。接下来，将墨盒牢固地固定在PH1中，锥形生物打印喷嘴延伸到打印头下方。顺时针拧紧PH1上的螺钉，直到手指拧紧以将生物墨盒锁定到位。请注意，3D生物打印可以在PH2留空的情况下执行。打开生物打印机电源，并通过 USB 2.0 电缆在连接到 3D 生物打印机的 PC 上启动生物打印机软件。在软件中，单击连接按钮将其与3D生物打印机同步。观察3D生物打印机主控制菜单中的三个选项。首先，准备生物打印。第二，实用菜单。第三，状态屏幕。选择"准备生物打印"选项，然后向下滚动到并选择"主轴"选项。成功校准XYZ轴后，打印床的高度将略微降低，打印头将重新定位到打印床中心点上方。要继续进行24孔板中生物打印的起点校准，请从其密封的塑料包装中取出无菌的24孔培养板，并在板底侧的孔D1中心点上用永久标记标记点。取下印版盖，将24孔培养板放在打印床上，D1孔位于打印床的左前角。在主控制菜单上，选择实用程序菜单，然后选择移动轴。沿 X 轴和 Y 轴以 1 毫米为增量移动打印头，直到 PH1 的锥形生物打印喷嘴直接位于孔 D1 下方标记的点上。如有必要，通过以0.1毫米为增量移动打印头来微调锥形生物打印喷嘴在点上的位置。当直接在3D生物打印机的控制面板屏幕中指示的D1井中心上方时，记录锥形生物打印喷嘴的X和Y坐标，并标记坐标。接下来，以一毫米为增量抬起打印床，直到孔D1的底部几乎接触到安装在打印头一中的锥形生物打印喷嘴。如有必要，以 0.1 毫米为增量微调打印床的移动。从实用程序菜单中，选择 Z 轴校准选项，然后进一步选择并确认存储 Z 校准选项。返回主菜单，然后选择准备生物打印选项。向下滚动到并选择校准 Z 选项。使用正确的起始点坐标更新 24 孔板几何代码或 G 代码。在生物打印软件上打开提供的24孔G代码文件。使用在前面的步骤中获得的值更新第一行上的 X 和 Y 坐标，并以新名称保存文件。确保气动泵与 INKREDIBLE+3D 生物打印机的后进气口紧密连接，然后将其打开。拉出位于 INKREDIBLE+3D 生物打印机右侧的前控制旋钮。确保位于生物打印机正面的PH1和PH2数字压力表的读数均接近零千帕斯卡。顺时针缓慢旋转前向控制旋钮，直到左侧 PH1 仪表上指示的压力达到 12 千帕斯卡。将折叠的薄纸或一块防水密封膜放在已安装墨盒的打印喷嘴下方，注意不要接触打印喷嘴。从 3D 生物打印机的主控制菜单中，选择准备生物打印机。导航到并选择打开 PH1。请注意，生物墨水开始从打印喷嘴挤出。如有必要，通过顺时针旋转控制旋钮来增加挤出压力，直到生物墨水在连续长丝中挤出并记录新的压力设置。选择关闭PH1以停止生物墨水的挤出。从打印床上取出含有挤出生物墨水的薄纸或薄膜，然后关闭生物打印机门。要以24孔板格式对直线水凝胶基板进行3D生物打印，请从主控制菜单中选择实用程序菜单，然后选择禁用SD打印，这将允许生物打印机软件将G代码文件传输到3D生物打印机进行打印。单击生物打印机软件中的加载按钮，然后选择更新的24孔板G代码文件。在软件右侧控制面板中，选择打印预览选项卡，然后单击打印按钮以开始在D1井中进行生物打印。完成直线结构的生物打印后，用盖子盖住24孔板，并将其移至II类生物安全柜中。将每个直线结构浸入两滴无菌的50毫摩尔氯化钙溶液中，并在室温下孵育五分钟。小心地从每个孔结构中吸出氯化钙溶液，并在一毫升1X PBS中冲洗一次，以除去多余的氯化钙。为了防止生物打印的水凝胶构建体脱水，将3D生物打印的直线构建体保持在新鲜的1X PBS中，直到骨髓来源的肥大细胞准备好接种到构建体上。基于流式细胞术分析的BMMC的前向和侧向散射参数，观察到与在没有CNC琼脂糖D-甘露醇水凝胶底物的情况下培养的BMMC相比，具有最高CNC浓度的水凝胶底物没有改变BMMC的天然尺寸或粒度。对BMMC对碘化丙啶的渗透性的流式细胞术分析表明，测试的CNC浓度均未对BMMC的活力产生任何不利影响。CNC琼脂糖底物在CNC浓度大于或等于2.5%时增加了肥大细胞生物标志物的表达，然而，这些受体的表达水平在2.5%至12.5%CNC之间保持相对一致，这表明其效果与CNC浓度无关。XTT测定表明，在所有测试的时间点，在3D生物打印水凝胶支架上培养的BMMC的代谢活性在约100%时保持相对一致。同样，LDH释放和PI染料排除测定显示BMMC的生存能力没有显着变化。仔细注意打印喷嘴量规的选择，3D生物打印机轴的校准以及挤出压力设置将确保高质量3D构建体的可重复打印。肥大细胞的检索很容易，这使得它们可以通过广泛的生物测定进行探测，以进一步研究其细胞功能的任何方面。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

生物工程

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